用于治療子宮內膜異位的N?乙?；?L?半胱氨酸的制作方法
本申請是申請日為2010年9月24日和發(fā)明名稱為“用于治療子宮內膜異位的n-乙?；?l-半胱氨酸”的201080053396.6號發(fā)明專利申請的分案申請。
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及含n-乙?；?l-半胱氨酸的藥物組合物，其用于治療子宮內膜異位(endometriosis)和與子宮內膜異位相關的適應癥。
背景技術：
子宮內膜異位是引起美國婦科住院治療的第三大原因，且估計影響著一千四百萬歐洲女性。常用于表示子宮內膜異位發(fā)病率的數據有：所有育齡女性的5-10％和所有女性的30-40％具有不孕問題。該疾病特征在于，子宮腔外存在組織結構與子宮內膜(在哺乳動物子宮內襯墊的膜)相同的組織。該錯位組織發(fā)展為生長物或損傷(也稱植入物或結節(jié)(nodule))，其對于月經周期的響應與子宮內膜組織的方式相同：每個月該組織形成、破壞和脫落。月經期間血液從子宮流出，而從子宮內膜生長物脫落的血液和組織沒有流出的通道。這導致內出血、血管和損傷組織的破壞，以及所引起的慢性炎癥。
子宮內膜異位的兩種最常見癥狀是疼痛和不孕。癥狀可包括：痛經，即經期前后的疼痛，以及性交期間或之后的疼痛；骨盆慢性疼痛或腰背、腸疼痛；經期量過多或經期延長(heavymenstrualperiods)，或經期之間的滴血和出血；經期期間腸運動疼痛或小便澀痛；不孕。
子宮內膜異位的病因目前仍為未知，且一些理論提出了異位遷移和子宮內膜細胞的植入的原因。目前的理論將子宮內膜異位的發(fā)生與原始組織(正常位置的子宮內膜)本身狀況的改變聯(lián)系起來。目前本領域內越來越認可的是由于正常位置的子宮內膜細胞的紊亂而引起的子宮內膜瘤的不受控制的遷移、植入和生長所引起。
目前尚不能治愈子宮內膜異位。存在多種治療選擇，且有辦法將該病癥引起的癥狀最小化。除了用鎮(zhèn)痛藥治療疼痛，子宮內膜異位的治療主要涉及卵巢的雌激素分泌功能抑制，因此涉及對多種實體的激素治療，直至在很多重癥病例中引起絕經。用手術的辦法除去位于直腸陰道隔或在其他位置(即膀胱和腸)的子宮內膜瘤、粘著、腹膜植入和深度損傷，并減輕疼痛。然而，藥物和手術治療后都會復發(fā)?；加凶訉m內膜異位的年輕女性們通常面臨著關系到未來生育的艱難抉擇。意在抑制卵巢功能的激素治療，與妊娠是不相容的。
n-乙?；?l-半胱氨酸(本文稱為nac)是一種公知的藥物，其主要在對乙酰氨基酚中毒的治療中用作溶粘蛋白劑。近年來，其也公認具有其他有益性質，例如作為抗炎和抗增殖藥物，且已建議用于治療多種不同病癥和癥狀，例如精神分裂癥、糖尿病和癌癥。
在此前的探索潛在的與子宮內膜異位相關的分子機制的研究中，已表明子宮內膜異位之中細胞增殖率的增加，可能是由自由基或ros引起的子宮內膜異位的組織的氧化應激所導致。因此已表明對于子宮內膜異位的新的治療策略可基于抗氧化劑和ros清除劑，例如nac。
現(xiàn)有技術
charlotte
nastaranfoyouzi等人還指出(fertilityandsterility(2004)，vol.82，suppl.3，第1019-1022頁)，抗氧化劑例如nac可用于治療子宮內膜異位。該文章公開了一項體外研究，其中用不同抗氧化劑例如nac處理分離自健康受試者以及子宮內膜異位患者的細胞。所有抗氧化劑均抑制了子宮內膜間質細胞的增殖。
在yanwo和sun-weiguo(gynecologicandobstetricinvestigation(2006)，vol.62，no.4，第193-205頁；europeanjournalofobstetrics&gynecologyandreproductivebiology，(2008)，vol.137，第198-203頁)；專利文獻us2007/0287676a1)的研究中，對于永生的人子宮內膜間質細胞中nac對于增殖和細胞周期終止的作用進行了研究并與其他用于治療子宮內膜異位的物質相比較。表明nac對增殖和細胞周期終止均具有一定作用，盡管與組蛋白脫乙?；敢种苿┫啾炔⑽催_到所聲稱的作用。
在s.estany等人(journalofreproductiveimmunology(2007)，vol.75，第1-10頁)的研究中表明，通過防止h2o2誘導的細胞毒性，nac和其他抗氧化性物質對于培養(yǎng)中的子宮內膜細胞的抗氧化活性增加了被氧化細胞的活力。
其他相關文獻包括us2003/0190381a1，wo2004/096206a2，us6239137b1，us2003/0119875a1，us2004/0014672a1和wo2005/048822a2。
其他公開nac在癌癥治療中分子作用的背景技術包括：t.parasassi，等人(celldeathanddifferentiation(2005)，vol.12，no.10，第1285-1296頁)；e.k.krasnowska等人(freeradicalsbiologyandmedicine2008，45(11):1566-72)和a.c.gustafsson等人(bmccancer(2005)，5:75)。
發(fā)明目標
據本發(fā)明者所知，nac治療子宮內膜異位的臨床結果在現(xiàn)有技術中尚未確定，對于治療子宮內膜異位或將nac用于治療與子宮內膜異位相關的適應癥也沒有提出一個有效的劑量治療方案。
因此本發(fā)明的一個目標在于提供解決上述問題的方案，即提供含n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)的藥物組合物用于治療在人和哺乳動物中的子宮內膜異位和與子宮內膜異位相關的適應癥。本發(fā)明的一個方面是提供含n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)的藥物組合物，其以有效劑量治療方案而使用，用于在哺乳動物(包括人)中治療子宮內膜異位和與子宮內膜異位相關的癥狀。
技術實現(xiàn)要素：
前文已表明，nac可用于新的子宮內膜異位治療策略中，該策略是基于將其用作抗氧化劑和ros清除劑。本發(fā)明的發(fā)明者已表明，nac誘導分子和細胞的變化，其不僅抑制了增殖，也引起患病組織向正常組織分化。
這些發(fā)現(xiàn)引領本發(fā)明的發(fā)明者提出了在人或哺乳動物患者中治療子宮內膜異位和與子宮內膜異位相關的適應癥的新的nac處方。此外提供了在子宮內膜異位的治療中nac的有效劑量范圍。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述進行處方的治療方案可用于例如控制疼痛癥狀(痛經、性交困難和非周期性慢性骨盆痛)的頻率和強度，減小子宮內膜異位損傷的尺寸并最終使之消失，減少手術后復發(fā)和/或提高生育能力。該治療基本無副作用，且特別是該治療不妨礙妊娠。
本發(fā)明提供含n-乙?；?l-半胱氨酸的藥物組合物，其用于治療患有子宮內膜異位的哺乳動物(包括人)，其中所述組合物用于脈沖式或間歇式口服給藥，給藥時間周期為兩個月或兩個月以上，n-乙?；?l-半胱氨酸在給藥日的劑量為20至90mg/kg/天。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供含n-乙酰基-l-半胱氨酸的用于上述用途的藥物組合物，其中所述組合物用于連續(xù)給藥3-5天然后中斷2-4天。在另一實施方案中，所述含n-乙?；?l-半胱氨酸的藥物組合物用于連續(xù)給藥1-3天，然后中斷1-2天。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供含n-乙?；?l-半胱氨酸的用于上述用途的藥物組合物，其中所述組合物在給藥日以30至60mg/kg/天的n-乙?；?l-半胱氨酸的劑量給藥。在另一實施方案中，所述藥物組合物在給藥日以30至45mg/kg/天的n-乙?；?l-半胱氨酸的劑量給藥。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供含n-乙?；?l-半胱氨酸的用于上述用途的藥物組合物，其中所述藥物組合物避光(protectedfromlight)。在另一實施方案中，所述藥物組合物為水溶性片劑。在又一實施方案中，所述藥物組合物含有碳酸氫鈉。在一個實施方案中，所述藥物組合物為緩釋制劑和/或胃保護制劑。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供含n-乙?；?l-半胱氨酸的藥物組合物，其用于治療由子宮內膜異位引起的疼痛。在另一實施方案中，所述藥物組合物用于治療由子宮內膜異位引起的不孕。在又一實施方案中，所述藥物組合物用于在腹腔鏡檢查或手術之前預先治療患有子宮內膜異位的哺乳動物。在一個實施方案中，所述藥物組合物用于在腹腔鏡檢查或手術后治療患有子宮內膜異位的哺乳動物以防止復發(fā)。
在一個方面中，本發(fā)明提供治療患有子宮內膜異位的哺乳動物的方法，其包括將含n-乙?；?l-半胱氨酸的藥物組合物口服給藥于所述哺乳動物，采用脈沖式或間歇式劑量治療方案，給藥時間周期為兩個月或兩個月以上，n-乙酰基-l-半胱氨酸在給藥日的劑量為20至90mg/kg/天。在所述方法的一個實施方案中，連續(xù)給藥所述藥物組合物3-5天然后中斷2-4天。在另一實施方案中，連續(xù)給藥所述藥物組合物1-3天，然后中斷1-2天。
在所述方法的一個實施方案中，在給藥日n-乙?；?l-半胱氨酸的劑量為30至60mg/kg/天。在所述方法的另一實施方案中，在給藥日n-乙?；?l-半胱氨酸的劑量為30至45mg/kg/天。
在一個實施方案中，該方法用于治療子宮內膜異位引起的疼痛。在其他實施方案中，該方法用于治療子宮內膜異位引起的不孕，用于在腹腔鏡檢查或手術之前預先治療患有子宮內膜異位的哺乳動物，或用于在腹腔鏡檢查或手術之后的治療以防止子宮內膜異位損傷的復發(fā)。
附圖說明
下文將參照附圖更詳細地闡釋本發(fā)明，其中：
圖1表明nac對于小鼠中子宮內膜異位損傷生長的抑制作用，如實施例1所述。顯示植入后21天每份對照(n＝10)和經nac治療的(n＝10)動物的平均總重及其標準誤差。顯著性p<0.05。在直方圖上方的插圖中，顯示對照(a)和經nac治療的(b)病例繁殖的子宮內膜瘤的分別的圖像。條：1cm。
圖2a表示半定量rt-pcr的分別的凝膠，如實施例1所述。圖2b表明在經nac治療的小鼠的包囊(cyst)中cox-2和mmp-9表達減少，如實施例1所述。顯示5例對照和5例經nac治療的小鼠的平均半定量rt-pcr值及其標準誤差。
圖3表示e-鈣粘蛋白在經nac治療的小鼠的包囊中的重新定位，如實施例1所述。顯示對照(a和b)和經nac治療的小鼠(c和d)的子宮內膜瘤e-鈣粘蛋白免疫染色的分別的圖像。在對照樣品中，整個上皮細胞的細胞質中可觀察到彌散性褐色斑點，而在經nac治療的樣品中該斑點限制于細胞-細胞相接觸的水平。初始放大40倍。
圖4表明在經nac治療的動物的包囊中cox-2染色減少，如實施例1所述。顯示對照小鼠(a-c)和經nac治療的小鼠(d-f)的包囊免疫組織化學染色的分別的圖像。在對照樣品中，在一些區(qū)域檢測到存在明顯的褐色斑點，而這在經nac治療的樣品中幾乎檢測不到。初始放大40倍。
圖5表示在經nac治療的動物的包囊中ki-67染色減少，如實施例1所述。顯示對照小鼠(a-c)和經nac治療的小鼠(d-f)的包囊的免疫組織化學染色的分別的圖像。箭頭指向染色的增殖細胞。初始放大40倍。
圖6為現(xiàn)有技術的圖示，表示用nac治療增殖細胞時的若干作用機理和經nac治療對癌細胞的代謝作用，以癌細胞為例。這些機理集中于細胞終末分化。本發(fā)明的實施例也顯示了當根據本發(fā)明的nac用于治療子宮內膜異位時，會產生至少一些所述作用。
圖7報道了對總計64位女性(33位經nac治療，31位為未治療的對照)進行的臨床前研究結果。nac治療三個月后，通過超聲測量最大直徑來測量包囊尺寸的改變。圖7a表示經治療的患者和對照中包囊尺寸的絕對數值的變化。圖7b表明包囊尺寸的百分比變化。
發(fā)明詳述
nac概述
n-乙酰基-l-半胱氨酸(nac)是一種公知的低分子量藥物，化學式為
nac的特征主要涉及其巰基，其使之在三肽谷胱甘肽(gsh)作用的大多數生物化學途徑中是有效的，所述三肽谷胱甘肽(gsh)以相對高濃度存在于人組織中，甚至高于10mm。半胱氨酸是組成gsh的三個氨基酸之一，故nac被認為是具有去乙?；腚装彼岬膅sh前體。nac曾經并且目前仍然廣泛地用作溶粘蛋白劑，其作用方式通常歸因于粘液蛋白中的敏感的半胱氨酸二硫橋鍵的氧化還原裂解。實際上nac參與復雜的巰基氧化還原循環(huán)，其中有若干種酶的作用。事實上，具有極為重要生理學意義的是二硫化物形成和裂解的循環(huán)，這是一種調節(jié)蛋白活性和細胞信號傳導的普遍機理。酶，例如蛋白酪氨酸磷酸酶和酪氨酸激酶，例如在控制細胞周期、細胞增殖和分化中起著關鍵的作用，且許多這些酶通過其半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)而調節(jié)。
總之，盡管詳細的作用機理尚未最終確定，nac似乎在gsh作用的所有生物化學途徑中都發(fā)生作用。由gsh作用調節(jié)活性的酶和蛋白，其活性調節(jié)是直接進行或通過一系列信號轉導途徑進行的若干過程。在該圖中，nac既可與gsh的作用平行，或者可能比gsh更有效。
gsh例如通常結合于對乙酰氨基酚形成的活性代謝物，且有助于其解毒。當對乙酰氨基酚劑量過大時，gsh卻被消耗，且對乙酰氨基酚代謝物開始與細胞蛋白反應，最終導致細胞死亡。在對乙酰氨基酚中毒后暴發(fā)性肝功能衰竭的治療中，nac在對乙酰氨基酚代謝物的解毒過程中代替gsh起作用。nac被認為實際上不存在不利的副作用，這也通過在對乙酰氨基酚中毒的治療中用高劑量nac進行評估(對體重70kg的個體進行治療，約40g/天)而得以證實。
與胃中可降解的三肽gsh相反，更簡單的nac分子自由地擴散入所有組織和細胞中。nac藥代動力學研究測定血漿峰濃度約1小時內到達，其半衰期為約三小時。6至12小時發(fā)生完全清除。
nac作為抗增殖分化劑
本發(fā)明者最近發(fā)現(xiàn)n-乙?；?l-半胱氨酸(nac)對于上皮來源(與子宮內膜細胞相同的來源)的癌細胞具有顯著的抗增殖作用(celldeathanddifferentiation2005，12(10)：1285-1296)。盡管癌和子宮內膜異位基本上是不相關的疾病，然而它們具有一些共同的性質，這最終使本發(fā)明者想到nac對于子宮內膜異位的治療可能是有用的。特別是，正如癌一樣，子宮內膜異位是一種增殖性疾病，盡管它還具有一些未知的潛在的分子機理和病因學。在本文中，癌癥中觀察到的現(xiàn)象將作為nac作用的背景，以及作為子宮內膜異位中一種可能的作用模式。
nac用于終止兩種腺癌細胞系和原發(fā)正常角質化細胞的增殖和誘導其分化，上述兩者均為上皮來源。在這些系統(tǒng)中，所述分化由形態(tài)學、生物化學和基因表達分析來表征(所述基因表達分析公開于bmccancer2005，5：75中)。
癌癥研究中，nac的抗增殖作用與細胞死亡或毒性無關，但卻是由于生理學分化途徑的激活而產生，所述激活可視為使細胞功能對來源組織正?；?。
除了增殖減少，經nac治療的癌細胞的形態(tài)也有所變化。在體外，活性增殖中的上皮細胞顯示出不規(guī)則的形態(tài)(間質形態(tài))且通常形成多個細胞層。相反，當細胞經歷分化過程時，由于其最終靶組織的結構和功能，它們停止增殖，它們的形態(tài)規(guī)則地變?yōu)槎嘟切?，各個細胞有時較厚，且它們形成單層的相鄰細胞。該過程伴隨細胞-細胞和細胞-基質接合的增加，這與從增殖間質轉變?yōu)檎持?、活動性降低和分化的表型相符合?/p>
總之，將nac補充至癌細胞之后檢測到一系列復雜的代謝變化，其全都集中于使不受控制的增殖終止以及誘導其終末分化，如圖6中的圖示所示。
應注意，nac治療誘導細胞-細胞和細胞-基質粘著復合物的大量增加。不受控制的增殖可視為這樣的情形：細胞失去接觸抑制及其對于分化信號的響應能力。進入分化途徑的細胞顯示細胞間接合復合物的大量增加，且該進程通常也指示為接觸抑制。若干證據表明，細胞進入分化終點的信號來源于細胞-細胞復合物本身的成分。這些接合也是細胞間信號傳播的一個途徑。
遷移細胞，例如子宮內膜異位中的子宮內膜細胞，除了含量減少的粘著復合物之外，還必須具有和分泌足量的活性基質金屬蛋白酶，該酶促進細胞外基質的降解，以使得能夠通過細胞外基質進行遷移。有趣的是，在上皮癌的這一模型中，發(fā)現(xiàn)nac向下調節(jié)該酶，暗示阻止了細胞遷移。另外，事實上本發(fā)明的實施例1表明當根據本發(fā)明用于治療子宮內膜異位時，nac向下調節(jié)基質金屬蛋白酶9(mmp-9)的表達。這表明，nac可能妨礙以下兩種細胞遷移：從正常位置的子宮內膜遷移至新植入物(防止復發(fā))和遷移至子宮內膜異位的組織(防止進一步損傷)。
已知nac的作用還涉及其抗炎作用，這是將其加入非甾體抗炎藥物(nsaid)家族的原因之一。經nac治療的細胞的基因表達概況事實上顯示了環(huán)氧化酶-2(cox-2)的向下調節(jié)，該基因的誘導與炎性反應相關。nac的這一作用在本發(fā)明的實施例1的子宮內膜異位的組織中也得以證實，表明nac也可減輕與子宮內膜異位中的炎癥相關的癥狀。
作為nac通過敏感半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)調節(jié)細胞信號轉導的能力的實例，在結腸癌(caco-2)細胞和卵巢癌(ovcar-3)細胞體外模型中研究了非受體酪氨酸激酶c-src這種酶(freeradicalsbiologyandmedicine2008，45(11):1566-72)。c-src參與增殖/分化轉換，且在接合復合物和細胞骨架組織的組裝/分解中是活躍的。該激酶在很多的人癌癥中被激活和過度表達，特別是在結腸和卵巢癌中。國際上進行了突出的藥物設計方面的努力，這些努力事實上是致力于尋找特異性的c-src抑制劑。反之，已發(fā)現(xiàn)用nac簡單地治療腺癌細胞可實現(xiàn)c-src抑制的目標，其機理涉及c-src中敏感半胱氨酸殘基的氧化還原過渡，其能夠切斷該激酶并使其遞送至溶酶體內部并在其中儲存或降解。因此，腺癌細胞中nac誘導的終末分化涉及c-src的抑制。眾所周知，該激酶的活性在子宮內膜細胞周期的蛻膜期中呈現(xiàn)關聯(lián)性，因此表明其在子宮內膜異位中反向調節(jié)的增加(endocrinejournal，2008，55(5)：795-810)。
nac和子宮內膜異位
如背景技術部分所述，此前已建議nac可用于子宮內膜異位的新的治療策略中，該策略基于其用作抗氧化劑和ros清除劑的用途。從上述的上皮癌研究，本發(fā)明的發(fā)明者注意到除了作為抗氧化劑和ros清除劑的作用以外，nac對于上皮癌細胞具有一些有利的作用；且若子宮內膜異位的細胞會有類似的響應，那么所述作用也可用于子宮內膜異位的細胞的治療。特別是，希望當nac用于子宮內膜異位的治療時，在癌癥中發(fā)現(xiàn)的nac的抗增殖和分化作用也同樣會出現(xiàn)。
相信若nac具有以下已發(fā)現(xiàn)于癌癥以及子宮內膜異位的組織中的分子作用，那么nac對于子宮內膜異位的治療中也將是有益的：
i)細胞-細胞和細胞-基質接合的增加，其與從增殖向分化表型的轉移
相符合；
ii)基質金屬蛋白酶表達的減少，其與細胞遷移的減少相關；
iii)環(huán)氧化酶-2(cox-2)表達的減少，其與炎性反應的減少相關；
iv)c-src活性的調節(jié)，以調節(jié)子宮內膜增殖/蛻膜周期并且允許妊娠。
因此，假設nac對子宮內膜異位可能具有以下生理學作用：
i)子宮內膜細胞增殖的減少；
ii)減少局部慢性炎癥，且因此緩解相關的疼痛；
iii)通過更規(guī)則的增殖-分化循環(huán)使來源組織、正常位置的子宮內膜正?；?；
iv)異位子宮內膜細胞的數量減少，所述減少與由于組織金屬蛋白酶的減少和細胞-細胞和細胞-基質接合的增加所致的細胞活力下降有關；
v)雌激素受體構象通過相關半胱氨酸殘基中二硫橋的重新組裝而重組。
總之，通過臨床研究中患者的響應和通過所述患者或動物模型在形態(tài)學、組織學、生物化學和分子生物學水平上的組織學分析或活組織檢查，均直接或間接地證實了這些假說的結果。
特別是，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，nac事實上減少了環(huán)氧化酶-2(cox-2)和基質金屬蛋白酶9(mmp-9)在子宮內膜異位的組織中的表達。發(fā)明者們也闡明了，nac使得來自子宮內膜異位組織的細胞質的e-鈣粘蛋白重新定位于經nac治療的組織中的細胞-細胞接合處。這表明了細胞-細胞接合的增加，其與細胞增殖的減少是相符的。事實上，其他作用，例如p21的表達增加和ki-67表達的減少，也表明對于子宮內膜異位的nac治療使得細胞增殖減少。本發(fā)明者也闡明了nac治療子宮內膜異位的這些分子作用使得子宮內膜異位損傷的尺寸減少，緩解疼痛并允許了人們想要的妊娠。使用nac治療子宮內膜異位或與子宮內膜異位相關的適應癥的一個優(yōu)勢在于，不需要使用目前對于子宮內膜異位常用的激素治療抑制卵巢功能。因此，與之相比，nac的使用增加了這些患者能夠懷孕的可能性。手術前的nac治療也致使形成更規(guī)則和致密的子宮內膜瘤，其更容易除去，并且使得腹腔鏡檢查中的出血極少。
劑量治療方案
從對于nac治療腺癌細胞系和原發(fā)正常角質化細胞的研究(celldeathanddifferentiation2005，12(10)：1285-1296)中得出結論，有效劑量的nac對于抗增殖-分化作用的誘導情況各異，并且依賴于細胞的類型。因此來源的組織即指示了對于增殖的完全阻滯的觀察所需的有效nac濃度，且必須由各組織所確定。此外，nac的劑量也與細胞惡性相關。詳言之，正常細胞僅需要較低的劑量以停止增殖和開始分化，而具有特征性預后不良的腫瘤細胞則需要更高的nac濃度。
出于本發(fā)明的目的，基于以下標準來研發(fā)用于治療哺乳動物(包括人)的子宮內膜異位的nac的劑量治療方案：
1)nac的每日劑量，其與目前的其他臨床治療相一致，且被認為沒有不利的副作用；
2)劑量，其被認為足夠高以滿足將異常增殖細胞轉換入分化途徑的要求；
3)在關于延長治療后nac血漿水平降低的報道(pendyalal，creavenpj.cancerepidemiolbiomarkersprev.1995；4:245-51)的情況下，在為期兩個月或更長的治療中每周中止治療半周，被認為具有最佳的生物學響應。
本發(fā)明的包含nac用于治療子宮內膜異位或與子宮內膜異位相關適應癥的組合物，根據一個實施方案以大約20至90mg/kg/天的劑量給藥。其下限是基于粘液溶解作用劑量的2倍，即其本身已知具有生理學作用。其上限是基于已發(fā)現(xiàn)更高的劑量會在許多患者中引起胃部問題的考慮。在另一實施方案中，本發(fā)明的組合物包含以大約30-60mg/kg/天的劑量給藥的nac。其下限已表明對子宮內膜異位有效，其上限已知事實上不具有副作用。在又一實施方案中，本發(fā)明的組合物包含以大約30-45mg/kg/天給藥的nac。已表明其中的低劑量令人驚訝地對于子宮內膜異位有效。
在一個實施方案中，所述組合物給藥的時間周期為兩個月或兩個月以上，或優(yōu)選三個月或三個月以上。為抵消延長治療后nac血漿水平的降低，nac可以以間歇模式中進行處方的劑量(即間歇式劑量治療方案/療法)給藥。間歇式給藥或治療是指治療周期性地中斷，即所述藥物組合物給藥一定的時間周期(例如數天)然后中斷給藥(其中藥物組合物不予給藥一定的時間周期，例如數天)。間歇式治療可以是規(guī)則的，例如治療固定的天數或周數，然后中斷固定的天數或周數。其實例包括重復的以下方案：每周治療4天然后中斷3天、或治療2周然后中斷1周。規(guī)則的間歇式治療的一個特例是脈沖式治療，即具有規(guī)則的治療和中斷時間，例如每隔一天給藥或給藥2天然后中斷2天等。不規(guī)則重復的不規(guī)則間歇式治療方案或更復雜地重復的方案也是可能的，例如取決于對治療的響應。在本發(fā)明的不同示例性實施方案中，將所述進行處方的劑量的nac連續(xù)給藥3-5天然后中斷2-4天，或連續(xù)給藥1-3天然后中斷1-2天。
在一個實施方案中，參照大約60kg的體重，nac劑量的范圍為1.2至5.4g/天，優(yōu)選1.8至3.6g/天。所述劑量可分為兩份或多份，優(yōu)選三份或四份，每天各給藥一份或兩份的劑量(例如丸)，其中各劑量可包含例如0.15-2.7g的nac或優(yōu)選0.6-1.2g的nac。所述治療包括脈沖式或間歇式給藥上述劑量，例如每隔一天給藥，或每周連續(xù)給藥三至四天并分別中止四至三天。所述治療持續(xù)的最小總時間為兩個月，總時間無最大時間限制。對于其他體重(例如偏重或偏輕)的患者，每日劑量需要相應地調節(jié)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述治療子宮內膜異位或子宮內膜異位相關癥狀的、包含150-5400mg劑量的nac的藥物組合物每天兩次或三次給藥，周期為至少2個月，例如至少3個月。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述包含230-3600mg劑量的nac的藥物組合物每天兩次或更多次給藥，周期為至少2個月，例如至少3個月。所述治療包括脈沖式或間歇式給藥上述劑量，例如每隔一天給藥，或每周連續(xù)給藥三至四天并分別中止四至三天。
藥物制劑
本發(fā)明的藥物組合物可以以藥物領域技術人員本身已知的方式制備。所述組合物可包含根據本發(fā)明的有效量的nac，以及作為活性成分的載體或介質的適當的載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑是本領域已知的，且包括固體物質例如檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸(氫)鈉以及矯味劑。所述藥物組合物優(yōu)選適用于口服給藥。所述組合物可以以不同形式給藥，優(yōu)選作為片劑形式。其他形式，例如膠囊、栓劑、溶液、混懸液、糖漿等也是可能的。
本發(fā)明需要嚴格地測定nac制劑中的藥物品質，以得到有效劑量。因此，使用品牌或經認證的制劑。nac并非穩(wěn)定分子，其活潑的巰基殘基可容易地被氧氣、光和其他輻射氧化，使得不能達到有效劑量。因此該制劑優(yōu)選避光，形式優(yōu)選為可溶性片劑，并且含有在溶解過程中幫助從水中部分除去氧的碳酸氫鈉。
已觀察到高劑量的nac可引起腹部疼痛。為克服這一缺點，一個選項是在具有胃保護的制劑中提供nac，其適于防止nac在胃中釋放/增溶。所述制劑是本領域公知的，且可用于本發(fā)明中。例如，可使用耐胃液且允許所述藥物在通過胃之后僅在腸中釋放的片劑包衣。常用制劑包括聚合物，例如纖維素衍生物、甲基丙烯酸氨基酯共聚物。所述包衣通過使用對ph敏感的聚合物防止該片劑核芯在胃酸性環(huán)境中分解(其在通過胃之后由于ph的增加而膨脹或增溶，從而釋放所述藥物)。
另一選項是降低nac在每一次進入血流的劑量。每天給藥nac三次或三次以上，對于患者而言可能是難以完成的。然而，可能需要重復給藥以達到幾乎恒定的nac血清濃度。為克服這些問題，對患者而言更容易操作的是每天一次或兩次給藥，例如在早晨和晚上給藥。一個選項是在緩釋制劑(也作持續(xù)釋放或控釋制劑)中提供nac。由于能夠減小nac分散和攝取進入血流的速率，所述制劑使較長間隔的大劑量給藥成為可能。然后該劑量在長時間內小量地分配到血液中，例如在每天兩次的治療方案中經12+12小時。很多不同緩釋技術和制劑是本領域已知的，且可應用于本發(fā)明中。在所述技術中該活性物質例如包在包衣或基質中，所述包衣或基質在給藥位置的體液中是不溶的或可溶性低的。
具有緩釋和胃保護的組合作用的制劑也是可能的，且可用于本發(fā)明中。
本發(fā)明的用途/藥物適應癥
本發(fā)明已顯示在與子宮內膜異位相關的諸多方面具有有益的性質，且可用于治療子宮內膜異位和治療多種與子宮內膜異位相關的適應癥。治療多種與子宮內膜異位相關的適應癥是指例如：治療以緩和疾病癥狀，例如疼痛和炎癥；治療以增加妊娠的可能性；手術前預先治療，以緩和子宮內膜異位損傷的移除和提高手術效果；手術后治療，以防止損傷的復發(fā)；和在確證的、經評定的風險因素的情況或在家族性子宮內膜異位的存在下進行預防性治療。
根據本發(fā)明，nac已顯示減小損傷尺寸和將增殖性組織恢復為更加分化的正常組織。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物包含nac以用于治療子宮內膜異位，以使位于直腸陰道隔或其他位置的子宮內膜瘤、粘著物、腹膜植入物和深度損傷減小并且最終消失。
根據本發(fā)明，nac已顯示減輕子宮內膜異位引起的疼痛癥狀。因此，在本發(fā)明的另一實施方案中，所述藥物組合物包含nac以減輕與子宮內膜異位相關的疼痛。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述藥物組合物包含nac以促進患有子宮內膜異位的人實現(xiàn)想要的妊娠。
在本發(fā)明的又一實施方案中，所述藥物組合物包含nac以在子宮內膜異位的情況下用于腹腔鏡檢查或手術的預治療，以促進除去腫塊(mass)，減少出血，使組織更為致密/不易破壞。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述藥物組合物包含nac以防止腹腔鏡檢查或手術后的復發(fā)。
在本發(fā)明的又一實施方案中，所述藥物組合物包含nac以在確證的、經評定的風險因素的情況下用于防止由于家族性影響引起的子宮內膜異位。
實施例
本發(fā)明將參考以下實施例進一步地公開和闡明。然而應注意的是，這些實施例絕不應理解為限制本發(fā)明。
實施例1.在子宮內膜異位鼠模型中的作用
材料和方法
材料。除非特別指出，所有化學物質均來自sigma-aldrich，milan，italy。
動物。36只雌性、6至8周齡balb/c小鼠購自charlesriveritalia(calco，italy)。任意提供片狀飼料(濃縮標準膳食；mucedola，milan，italy)和水。在控制的條件下，以16/8小時的明/暗周期飼養(yǎng)動物。在任何侵入操作之前，通過腹膜內注射0.4ml的包含2.5％avertin的生理學溶液麻醉小鼠。
子宮內膜異位的誘導。子宮內膜異位的誘導是通過以下文獻公開的方法進行的：somigliana等人，humreprod1999dec；14(12):2944-50。在清潔條件下進行手術介入。簡言之，通過肚臍以下的腹膜空間中線的小切口將同系小鼠的子宮角除去，并將其放入包含磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)的培養(yǎng)皿(petridish)中。通過使用保險刀片精細地切下子宮角得到子宮內膜碎片。將碎片混懸于0.6ml的pbs中，并迅速接種于受者小鼠的腹膜腔中，比例為一個供者/兩個受者。誘導子宮內膜異位的小鼠隨機地分為兩組，每組12只小鼠：對照組和nac-治療組。
nac治療。在子宮內膜植入的次日，用nac在水中的100μl的10mg/ml儲備溶液對治療組的小鼠進行管飼。對照組僅接受水。每天給藥nac，持續(xù)21天。考慮到小鼠平均體重為22.5±0.7，則1mg/小鼠的nac劑量對應于44mg/kg/天。給藥所述基于體重的劑量，與對照組相比未注意到毒性的跡象(在治療結束時未變化)，所述跡象包括食物消耗，理毛行為或活動水平。治療結束時，小鼠通過頸脫位法處死。
子宮內膜瘤的收集。所述治療結束時處死動物，且小心地從周圍組織分離子宮內膜異位損傷部分，評估其總體重和總數。包囊立即固定于10％福爾馬林或在液氮中冷卻并儲存于-80℃。
組織學和免疫組織化學。經福爾馬林固定的樣品包埋于石蠟中，且組織切片(5μm厚度)使用蘇木精-伊紅染色。通過對本研究不知情的經驗豐富的病理學家對所有切片進行評價，且子宮內膜異位的組織學診斷是基于子宮內膜腺體組織和間質的形態(tài)學鑒定。
對于免疫組織化學，將切片去石蠟化，并在分級的乙醇中再水化。對于抗原回收，在0.1m檸檬酸鹽緩沖液(ph6.0)中微波處理切片6分鐘，且通過在3％的h2o2/甲醇中培養(yǎng)20分鐘來阻斷內生性過氧化物酶的活性。切片在pbs/tritonx-100中清洗，在1％的pbs-牛血清白蛋白(bsa)中浸漬15分鐘以阻斷非特異性結合位點，然后用所選擇的稀釋于1％pbs-bsa中的初級抗體培養(yǎng)。對于環(huán)氧化酶(cox)-2(兔抗鼠多克隆，caymanchemical，milan，italy)、ki-67(兔抗人多克隆，monosanxtra，dbaitalia，segrate，italy)和e-鈣粘蛋白(bdbiosciences，milan，italy)的免疫檢測，在4℃進行過夜培養(yǎng)并分別以1:100、1:600、1:200稀釋。使用dakocytomationlsab2system-hrp(dakoitalia，milan，italy)繼續(xù)進行免疫組織化學染色，且通過鏈霉素兔抗人多克隆、親和素-生物素過氧化物酶復合物溶液使用二氨基聯(lián)苯作為發(fā)色物質將抗體結合位點可視化。切片用蘇木精復染，脫水，包埋于加拿大樹膠中，然后用leica顯微鏡觀察。ki-67表達的定量研究通過兩位獨立觀察者以互不知情的方式進行；每位觀察者在每一樣品的多于10個隨機選擇的區(qū)域中數出了至少200個細胞，且以百分比來表示ki-67標記指數。
rna提取、半定量rt-pcr和qrt-pcr。用tissuelyser(qiagen，milan，italy)使用trizolreagent(invitrogen，milan，italy)根據制造商說明書將冷凍的子宮內膜包囊溶解，以分離全部rna。用1u的脫氧核糖核酸酶i(invitrogen)處理來自各樣品的一微克的全部rna，并且使用20μl終體積的250ng的隨機引物用200u的superscriptiii逆轉錄酶(invitrogen)逆轉錄。使用得自各樣品的相同cdna產物以用于后續(xù)的pcr擴增，所述擴增使用為靶基因準備的引物組合。將18srna看家基因用作內部對照。陰性對照樣品由反應混合物和引物組成，無cdna模板。引物序列(表i)使用從以下網站可得到的primer-blast軟件而設計：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
首先，樣品和看家基因的比通過在單一反應管中同時擴增基因特異性mrna和18srna而計算。由于該操作并非對于所有樣品而言都能成功地防止由于競爭性作用造成的定量不準確性(可能是由于因優(yōu)先擴增18smrna而造成特異性轉錄物的數量相對較少的原因所致)，相同rt反應中產生的靶基因和18scdna在不同的管中擴增。為了以指數的量度來記錄擴增，生成了18srna擴增曲線，且選擇了合適的周期數。用1μl的cdna、2mm的mgcl2、0.2mm的dntps、0.5μm的各引物和1.25u的hotstarttaqpolymerase(qiagen)，以25μl的反應體積進行半定量pcr。所述pcr擴增通過icycler(bio-rad，milan，italy)進行。然后在1.5％瓊脂糖凝膠上將pcr產物進行電泳分析并用溴化乙錠染色。通過光密度掃描和針對18s負載控制進行歸一化來評估靶mrna水平。使用圖像軟件quantityone(versadoc，bio-rad)進行pcr產物的密度分析。
表i.用于半定量和qrt-pcr的引物序列
結果
nac治療對于子宮內膜異位損傷生長的作用。誘導子宮內膜異位21天后，將所有實驗小鼠處死，切下并收集其子宮內膜瘤。在12只對照小鼠中，一只死亡且一只未發(fā)展子宮內膜瘤。在12只經nac治療的小鼠中，兩只未發(fā)展子宮內膜瘤。形態(tài)學上，異位損傷較大、囊腫并且血管化：其由充滿液體的包囊組成，這些包囊的顏色為白色、紅色或偶爾為褐色，且優(yōu)先定位于盆腹腔的腹膜處。在圖1.1的插圖中，我們報道了對照(a)和經nac治療的(b)動物的包囊的代表性照片。相比于對照組(n＝10)，在治療組(n＝10)觀察到了平均重量的顯著降低(圖1)。
nac減少cox-2和mmp-9的表達，并切斷增殖。所述rt-pcr分析表明，相對于來自對照小鼠(n＝5)的包囊，nac治療(n＝5)誘導了cox-2和mmp-9mrna水平的顯著下降(分別下降32％和34％)，其顯著性p<0.01，如18s表達的正常化(圖2a和b)。通常僅在增殖周期阻斷時才被表達的p21基因，在5只對照動物中從未被表達，而在5份所檢查的經nac治療的樣品中有3份得以表達(代表性實施例見圖2a)。
nac促使e-鈣粘蛋白重新定位。e-鈣粘蛋白的免疫組織化學檢測，在所檢查的病例中為100％陽性。標簽限于腺體上皮細胞中，而沒有樣品呈現(xiàn)間質染色。在細胞水平上，在對照小鼠的包囊發(fā)現(xiàn)e-鈣粘蛋白染色擴散于整個細胞質中，而在經nac治療的小鼠的包囊中e-鈣粘蛋白主要在細胞-細胞接合處被檢測到(圖3)。e-鈣粘蛋白是多蛋白粘著復合物的一部分，因此其在細胞邊界表達的增加表明細胞間粘著的增加。另外，與上述p21表達相一致，該重新定位與細胞增殖轉化為終末分化的行為的減少相符(conacci-sorrell等人，j.clin.invest.2002，109：987–991；parasassi等人，celldeathdiffer.2005，12：1285-1296)。
nac治療減少子宮內膜瘤中cox-2的量。炎癥相關的cox-2蛋白的免疫組織化學檢測表明相對于來自對照小鼠的包囊，從經nac治療的小鼠收集的樣品顯示染色明顯減少，在一些病例中完全消失(圖4)。
nac減少增殖細胞的數量。ki-67抗原(ki-67)是細胞增殖的經典標記，靜止的非周期性細胞完全缺乏表達ki-67。當用于染色來自對照小鼠的包囊時，可檢測到一些被標記的細胞(如圖5a-c中的箭頭所示)。相反，在經nac治療的小鼠的包囊中檢測到極少的被標記的細胞(如圖5d-f中的箭頭所示)。對每組的8只動物進行統(tǒng)計學評價(10張圖像/200個細胞小鼠)表明增殖細胞減少了54％(表ii)。
表ii.ki-67標記指數及其標準誤差。顯著性：p<0.01
討論
子宮內膜異位動物模型中有效地誘導了異位子宮內膜的植入。只有對照組中的一只動物和經nac治療的組中的兩只動物沒有顯示子宮內膜瘤。
與預期相一致，包囊的重量(與尺寸成比例)在經nac治療的小鼠中較低。這可歸因于nac的抗增殖作用(parasassi等人，celldeathdiffer.2005，12：1285-1296)，如本文中通過基因表達分析和免疫組織化學進行的拓展性闡述。事實上，在60％的經nac治療的動物中觀察到了僅在分化的非增殖細胞中表達的基因p21，而在對照中未觀察到。相反，對于僅在增殖細胞中表達的ki-67蛋白，在經nac治療的小鼠中觀察到ki-67蛋白比對照小鼠減少了54％。
與子宮內膜異位相關的蛋白，例如mmp-9(collette等人，humreprod2006；21：3059-3067)和cox-2(carli等人，endocrinology2009；150：3128-3137)，在nac治療之后顯示有所減少。mmp-9被認為是細胞運動和侵襲行為的基礎，而cox-2是與炎癥有關的酶的范例。兩種相關基因均顯示在nac治療后減少約30％。此外，cox-2的量也通過包囊中的組織化學染色得以檢查，且結果顯示染色的相關減少。
廣泛接受的觀點是細胞質e-鈣粘蛋白是增殖性細胞行為的標志，而與之相反的是，其在細胞間粘著復合物處的定位被認為是分化的標志和誘導者；基于此，我們也檢查了對照小鼠和經nac治療的小鼠的包囊中e-鈣粘蛋白的定位。結果與我們此前關于腺癌細胞的發(fā)現(xiàn)完全一致(parasassi等人，celldeathdiffer.2005,12：1285-1296)，表明e-鈣粘蛋白從細胞質在nac治療后重新定位于細胞邊界。e-鈣粘蛋白與粘著復合物之間的這種關聯(lián)也與活力低和侵襲性較低的細胞行為相符。
總之，從所有所檢查的方面可見，nac可形成子宮內膜異位的最佳治療。當轉變?yōu)榕缘乃鲋委煏r，與由于激素治療所產生的不想要的作用的程度相比，該藥物具有事實上無副作用這一優(yōu)勢。因此nac可用于減小包囊尺寸、減少局部炎癥和相關的慢性疼痛，以及減少手術后復發(fā)。其中最后一點是通過減少增殖和降低細胞活力而受到啟示。
實施例2.nac治療子宮內膜異位作用的臨床前研究
研究目的。設計該中試性臨床研究，以使用nac代替其他療法來治療患有子宮內膜異位的女性。唯一可能的附加治療是當需要時使用鎮(zhèn)痛藥以緩解疼痛。
患者加入的條件?；诩膊〉奶弁春吐殉渤曌C據最初診斷為子宮內膜異位的女性，以及在腹腔鏡檢查治療后疼痛和/或卵巢子宮內膜瘤復發(fā)的患者加入了本研究。
治療前，疼痛癥狀的強度通過10點直觀類比標度(vas)的手段測量，且通過超聲測量卵巢子宮內膜瘤的特征。在nac治療期間，除了需要時用鎮(zhèn)痛劑治療疼痛以外，排除其他治療。
患者。從2008年2月到2010年7月，64位診斷為卵巢子宮內膜異位的女性加入了本研究中，其平均年齡為35±7歲(±sd)。其中，33位被指定用nac治療(平均年齡：37±6歲)，而31位沒有接受nac或任何其他治療并作為對照病例(平均年齡：33±8歲)。她們中的所有人均在一個或兩個卵巢內呈現(xiàn)出一個或多個包囊。
治療。所述進行處方的nac劑量與動物研究中所用的劑量接近，為30mg/kg/天。實踐中，對于60kg的平均體重而言，加入的患者的處方為三次600mgnac的口服劑量，每日三次，每周連續(xù)給藥三天并且中斷四天。這樣每天的nac劑量為1.8g，每周為5.4g，每個月為21.6g。這些精確的治療方案是基于以下考慮：1)每天的nac劑量為1.8g，與目前其他的臨床治療相一致，且被認為是無不利的副作用；2)考慮到nac的藥代動力學，每日三次給藥0.6mg的劑量達到了幾乎恒定的血漿水平，而不會使復合物治療的患者出現(xiàn)不適；3)考慮到據報道延長治療后nac血漿水平會下降(pendyalal，creavenpj.cancerepidemiolbiomarkersprev.1995；4:245-51)，每周中止所述治療約半周將確保長期(例如2至6個月或更長)治療中的最佳生物學響應。
隨訪。疼痛癥狀強度(vas疼痛量表)和卵巢子宮內膜瘤的尺寸(臨床和us檢查)，在治療最初三個月之后得以評價。若需要，在三個月后進行腹腔鏡檢查治療。
結果
下面報道最初三個月的隨訪周期之后的數據。
nac治療三個月后通過超聲測量最大直徑以獲得包囊尺寸的改變(未變化、增加或減少)，見于圖7a(包囊的絕對數量變化)和圖7b(包囊百分比變化)中。圖中顯示經nac治療的患者的包囊和未治療的對照的包囊的對比。在百分比方面(圖7b)，38％的病例中觀察到包囊尺寸減少，而在對照中不10％的病例顯示自發(fā)的減少。在子宮內膜瘤尺寸減少的情況下，若干患者(33人中的21人)決定停止或延期進行預定的腹腔鏡檢查。
在nac治療后痛感也有所變化。在該3個月的治療之前和之后評價疼痛，評價手段為10點直觀類比標度(vas)，其中0代表無疼痛，10代表可想象的最嚴重的疼痛。將癥狀強度分類為無(0)、輕度(1-4)、中度(5-7)或重度(8-10)。經nac治療的患者報道，在三個月的治療后平均疼痛從7.6±0.3減少至5.1±0.8(p<0.01)。
未報道不良的副作用。
盡管我們未評價患者是否想要妊娠，且因此不能根據我們的發(fā)現(xiàn)歸納出相應的顯著性，我們仍然報道了三例妊娠，這顯然是目前以抑制卵巢功能為靶點治療子宮內膜異位的療法所不可能實現(xiàn)的。
據經驗豐富的外科醫(yī)生報道，在nac治療后的腹腔鏡檢查觀察到子宮內膜瘤更規(guī)則、更致密且更容易移除，因此與腹腔鏡檢查中出血的相關減少有關。
在其他病例中，直腸陰道隔結節(jié)消失，表明nac的效果不僅限于卵巢子宮內膜瘤。
實施例3：脈沖式、間歇式和每天進行nac治療，對于實驗誘導的子宮內膜異位的作用：在大鼠中對作為疼痛征兆的陰道高響應性的中試研究
材料和方法
動物。使用16只未交配的雌性sprague-dawley大鼠。研究開始時其稱重為200-230g，分別飼養(yǎng)于控溫室內具有墊料的塑料籠中。大鼠可任意飲水、任意食用鼠糧，并且保持12小時的明/暗周期，其中照明于07:00開始。通過每天進行陰道灌洗確定生殖狀態(tài)(動情前期、動情期、動情后期和動情間期)。
實驗模型和手術前訓練。子宮內膜異位的誘導前，訓練大鼠以對由可充氣乳膠氣球造成的末端陰道擴張形成逃跑響應。將未充氣的小乳膠氣球系在經潤滑的細導管上，然后插入中陰道腔。用空氣以不同體積對氣球進行充氣，使陰道腔擴張。通過小體積壓力傳感器測量并控制各擴張體積所產生的壓力。該測試裝置是一種小型圓柱體有機玻璃室，其設計為容納大鼠并恰好使之不能轉身。該室后部的開口允許該連接至陰道刺激器的導管與刺激裝置相連接。光感受器確定大鼠在室中的位置。若大鼠伸展(逃跑響應的一部分)，光束被破壞并且刺激終止。通過每天將大鼠置于該室中15分鐘持續(xù)5天，使大鼠適應該測試室。然后在訓練期間使大鼠習慣通過機械的逃跑響應以使陰道擴張放氣，所述放氣涉及到大鼠伸展其頭部以中斷光束。所有大鼠均在4個訓練期間內學會了逃跑響應。一經訓練，測試期間開始。
測試期間每周在不連續(xù)之日進行3次。各測試期間包括一系列經控制的逃跑訓練。各訓練由氣球快速充氣(1ml/s)至固定體積組成，該訓練持續(xù)至大鼠出現(xiàn)逃跑響應或經過15秒的時間，且氣球迅速放氣。以隨機的順序釋放不同的擴張體積，包括對照體積(0.01ml)。15秒的最大潛伏期視為無響應。
對于各期間，測量響應和逃跑響應時間作為擴張體積的功能，如casonam等人(hormbehav.(2003)，vol.44，第123-31頁)所述。響應時間越短、造成響應的體積越小，大鼠的逃跑響應越大。對于各鼠，合并了各大鼠期間(至少12個期間)內的逃跑響應和壓力/體積，并計算其平均。在所有四個實驗組(見下文)中，發(fā)現(xiàn)子宮內膜異位手術前陰道擴張的基線逃跑響應是相似的。
子宮內膜異位的誘導。通過子宮同體組織移植片，可用實驗方法在大鼠中誘導子宮內膜異位。根據從1985年vernon和wilson(fertilityandsterility，1985，vol.44，第684-694頁)發(fā)展的治療方案，進行子宮內膜異位手術。將動情間期內的大鼠麻醉，置于加熱板上以保持體溫并進行手術。進行腹部中線切口以暴露子宮。將四片子宮角沿供養(yǎng)尾端小腸的交替串聯(lián)的腸系膜動脈縫合。手術后恢復中未發(fā)生事故，且在一周內所有大鼠中均繼續(xù)存在規(guī)則的動情周期。
nac治療。手術后，用nac以60mg/kg/天的劑量(在給藥日適用)或用安慰劑治療所有大鼠8周。大鼠分為四個實驗組：
第一組接受脈沖式nac治療，即每隔一天治療。
第二組接受間歇式nac治療，即每天治療5天并中斷2天(即2天無治療)。
第三組每天接受nac治療。
第四組接受假治療，即安慰劑治療。
8周后，評價如上所述的對于末端陰道擴張?zhí)优茼憫?/p>
結果
結果表明，子宮手術后，大鼠中引起了陰道痛覺增敏(對于疼痛的敏感性增加)。
對于陰道腔的不同擴張體積，確定逃跑響應(即特定擴張體積下的響應時間和15秒內的響應數，與對照組對比)和陰道壓力。顯示了四個不同實驗組(假治療組的值用作基線值)的結果。
以0.5ml的擴張體積，相對于假治療組的逃跑響應相對下降為：
1.對于脈沖式nac治療組：32％逃跑響應減少。
2.對于間歇式nac治療組：28％逃跑響應減少。
3.對于nac每天治療組：18％逃跑響應減少。
因此該結果令人感興趣地表明，與接受每天治療的組相比，nac治療帶來的減少疼痛的作用在脈沖式治療組和間歇式治療組中更為顯著。
綜上所述，本發(fā)明涉及如下方面：
1.藥物組合物，其為含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于治療患有子宮內膜異位的哺乳動物的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為
采用脈沖式或間歇式口服給藥、
給藥時間周期為兩個月或兩個月以上、和
n-乙?；?l-半胱氨酸在給藥日的劑量為20至90mg/kg/天的藥物組合物。
2.根據1的含n-乙酰基-l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為用于連續(xù)給藥3-5天然后中斷2-4天的藥物組合物。
3.根據1的含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為用于連續(xù)給藥1-3天，然后中斷1-2天的藥物組合物。
4.根據前述任一項的含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為在給藥日以30至60mg/kg/天的n-乙酰基-l-半胱氨酸的劑量給藥的藥物組合物。
5.根據前述任一項的含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為在給藥日以30至45mg/kg/天的n-乙?；?l-半胱氨酸的劑量給藥的藥物組合物。
6.根據前述任一項的含n-乙酰基-l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物避光保存。
7.根據前述任一項的含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物為水溶性片劑。
8.根據前述任一項的含n-乙酰基-l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有碳酸氫鈉。
9.根據1-6的含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含用于緩釋和/或胃保護的制劑。
10.根據前述任一項的含n-乙酰基-l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其為用于治療由子宮內膜異位引起的疼痛的藥物組合物。
11.根據前述任一項的含n-乙酰基-l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其為用于治療由子宮內膜異位引起的不孕的藥物組合物。
12.根據前述任一項的含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其為用于在腹腔鏡檢查或手術前預先治療患有子宮內膜異位的哺乳動物的藥物組合物。
13.根據前述任一項的含n-乙?；?l-半胱氨酸且用于所述用途的藥物組合物，其為用于腹腔鏡檢查或手術后的治療以防止子宮內膜異位損傷的復發(fā)的藥物組合物。
14.所述治療患有子宮內膜異位的哺乳動物的方法，其包括將含n-乙?；?l-半胱氨酸的藥物組合物口服給藥于所述哺乳動物，其中：
采用脈沖式或間歇式的劑量治療方案，
給藥時間周期為兩個月或兩個月以上，
n-乙?；?l-半胱氨酸的劑量在給藥日為20至90mg/kg/天。
15.根據14的方法，其中連續(xù)給藥所述藥物組合物3-5天然后中斷2-4天。
16.根據14的方法，其中連續(xù)給藥所述藥物組合物1-3天，然后中斷1-2天。
17.根據14-16中任一項的方法，其中n-乙?；?l-半胱氨酸的劑量在給藥日為30至60mg/kg/天。
18.根據14-17中任一項的方法，其中n-乙酰基-l-半胱氨酸的劑量在給藥日為30至45mg/kg/天。
19.根據14-18中任一項的方法，其用于治療由子宮內膜異位引起的疼痛。
20.根據14-19中任一項的方法，其用于治療由子宮內膜異位引起的不孕。
21.根據14-20中任一項的方法，其用于在腹腔鏡檢查或手術前預先治療患有子宮內膜異位的哺乳動物。
22.根據14-21中任一項的方法，其用于在腹腔鏡檢查或手術后的治療以防止子宮內膜異位損傷的復發(fā)。
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