本發(fā)明涉及一種中藥，尤其涉及一種用于治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸的中藥及其制備方法。

背景技術(shù)：

黃疸亦稱“黃癉”，是感受濕熱疫毒，肝膽氣機受阻，疏泄失常，膽汁外溢，以身黃、目黃、小便黃為主癥的一種病證。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的黃疸含義基本相同，包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的阻塞性黃疸、溶血性黃疸、肝細胞性黃疸，以及凡是引起血中膽紅素異常升高的疾病。一般而言，若能正確鑒別診斷并及時治療，多數(shù)黃疸能在1個月內(nèi)逐漸消退。臨床上，凡黃疸反復(fù)或持續(xù)出現(xiàn)超過半年以上者則稱為難治性黃疸(或頑固性黃疸)，其發(fā)病原理、病理變化、臨床經(jīng)過和轉(zhuǎn)歸各不相同，病機復(fù)雜，治療棘手。此類患者因血中膽紅素長期升高，肝臟負擔(dān)過重，發(fā)生肝硬化的機率比常人高30～50倍，因此消退黃疸是控制病情、改善預(yù)后的關(guān)鍵。黃疸作為一種常見病、多發(fā)病，越來越受到人們的重視?？v觀目前研究進展，運用治療黃疸方劑治療黃疸，中藥優(yōu)于西藥，療效顯著，優(yōu)勢突出。

中醫(yī)對黃疸的認識由來已久，《內(nèi)經(jīng)》就有“溺黃赤，安臥者，黃疸”。《傷寒雜病論》把黃疸分為黃疸、谷疸、酒疸、女勞疸、黑疸五種?！妒備洝贩譃榫硼闳S?！缎l(wèi)生寶鑒》中將黃疸概括為陰黃、陽黃兩大類。中醫(yī)認為產(chǎn)生黃疸的原因為外感濕熱疫毒，內(nèi)傷飲食、脾胃虛弱、勞倦、病后續(xù)發(fā)等。病機為：肝膽氣機受阻，疏泄失常，膽汁外溢，發(fā)為黃疸?！督饏T要略·黃疸病篇》指出“黃家所得，從濕得之”，仲景強調(diào)濕在黃疸發(fā)病中的首要地位，將黃疸分為濕熱黃疸，燥熱黃疸，瘀血黃疸，燥瘀黃疸，虛寒黃疸等。黃疸的主要病位在肝、膽、脾、胃。多由脾胃涉及肝膽?！毒霸廊珪S疸》:“陽黃證多以脾濕不流，郁熱所致……”?！澳憘麆t膽氣敗，而膽液泄，故為此證”初步認識了黃疸的發(fā)生與膽液外泄有關(guān)。明末吳又可在《瘟疫論·發(fā)黃》中論述了“疫邪轉(zhuǎn)里，移熱下焦，小便不利，邪無輸泄，經(jīng)氣郁滯，其傳為疸……”對黃疸的傳染性己經(jīng)有了初步的認識?！爸T病黃家，但利小便”，創(chuàng)立“利濕退黃”大法，之后歷代醫(yī)家針對黃疸的治療各有發(fā)揮。濕邪是黃疸的最主要的病邪，無論陽黃，陰黃的發(fā)生均有濕邪內(nèi)蘊，祛邪首先必須祛除濕邪。濕為陰邪，其性粘膩重濁，亦趨下焦，同時濕邪可致熱郁于里，濕蒸熱郁為黃疸發(fā)生的主要病理因素。濕邪可從小便分利，熱邪同樣可循路而出。因此利濕清熱，疏利肝膽成為退黃的關(guān)鍵所在。

現(xiàn)代臨床研究：正如關(guān)幼波先生所說：“黃疸一病，病在百脈?！辈⒖偨Y(jié)出了“治黃必行血，血行黃易退；治黃需解毒，毒解黃易除；治黃要治痰，痰化黃易卻”的臨床經(jīng)驗從臨床實際來看，此病患者多有血瘀證候存在，古代醫(yī)家對黃疸論述中所謂“瘀熱發(fā)黃”、“瘀血發(fā)黃”也都說明黃疸是血分受病。根據(jù)黃疸發(fā)生的這一病機，瘀熱毒邪也是其突出特點之一，因此，現(xiàn)代醫(yī)家多主張采用涼血，化瘀，解毒等法治療黃疸。

現(xiàn)代實驗研究：既是血分受病，治黃必須從治血入手，亦即在清熱利濕(或溫化寒濕)的同時，重視用活血化瘀之品，以起到?jīng)鲅钛?、養(yǎng)血活血、溫通血脈的功效。從瘀論治難治性黃疸的方法，是以名老中醫(yī)關(guān)幼波先生提出的“治黃必治血，血行黃易卻”的理論為指導(dǎo)的。臨床實踐證明，應(yīng)用活血祛瘀藥物后，能促使黃疸消退，瘀血證候減輕，肝脾腫大回縮，以活血祛瘀為主治療病毒性肝炎所致難治性黃疸，明顯優(yōu)于單用清熱利濕為主的治療方法。

我們常見的黃疸的辨證分型多數(shù)強調(diào)濕熱，瘀、毒，痰等邪實，而容易忽視黃疸的病本，容易使用很多寒涼通下的藥物而不顧護脾胃，可能導(dǎo)致患者脾胃不和癥狀加重，從而影響患者的生存質(zhì)量，不利于黃疸患者的預(yù)后。劉華寶教授在多年臨床中，根據(jù)本病的流行病學(xué)資料、病因病機、發(fā)病特點和臨床表現(xiàn)，結(jié)合中醫(yī)肝病理論，認為肝細胞性黃疸是因病毒性肝炎等各種肝病造成肝細胞廣泛損害，膽紅素攝取、結(jié)合、排泄障礙所致的黃疸，其病因是正氣不足、外感濕熱疫毒、飲食不節(jié)、勞倦過度、七情所傷是其誘因；基本病機為濕熱瘀結(jié)，肝脾受損；病理因素以濕熱、瘀毒為主。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述問題提供一種療效確切、無毒副作用、安全可靠的治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸的中藥。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一種治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸的中藥，由下述重量份的原料配制而成：茵陳20～40、生大黃3～9、蘇木8～16、瞿麥10～20、平地木10～20、田基黃20～40。

作為優(yōu)選地，本發(fā)明中藥由下述重量份的原料配制而成：茵陳24～36、生大黃4～8、蘇木10～14、瞿麥12～18、平地木12～18、田基黃24～36。

作為優(yōu)選地，本發(fā)明中藥由下述重量份的原料配制而成：茵陳28～32、生大黃5～7、蘇木11～13、瞿麥13～17、平地木13～17、田基黃28～32。

一種上述的治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸的中藥的制備方法，為取配方量的各原料粉碎為粉末混勻制成中藥制劑。

在上述技術(shù)方案中，所述中藥制劑為合劑或散劑或丸劑或膠囊或片劑。

茵陳：清熱利濕；退黃。主治：黃疸、小便不利、濕瘡瘙癢、傳染性黃疸型肝炎等。藥理學(xué)研究有利膽，保護肝功能，解熱，抗炎，降血脂，降壓，擴冠等作用。

生大黃：攻積滯；清濕熱；瀉火；涼血；祛瘀；解毒。

蘇木：為清血劑，有祛痰、止痛、活血、散風(fēng)之功效。

瞿麥：清熱利水，破血通經(jīng)。治小便不通，淋病，水腫，經(jīng)閉，癰腫，目赤障翳，浸淫瘡毒。

平地木：主治：新久咳嗽；痰中帶血；黃疸；水腫；淋證；白帶；經(jīng)閉痛經(jīng)；風(fēng)濕痹痛；跌打損傷；睪丸腫痛。

田基黃：清熱解毒，利濕退黃，消腫散瘀。用于濕熱黃疸，腸癰，目赤腫痛，熱毒瘡腫；近有用于急慢性肝炎、早期肝硬化、肝區(qū)疼痛，闌尾炎，乳腺炎，肺膿腫。

濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸虛瘀錯雜，病程纏綿，遷延難愈。方中茵陳為君。大量研究證實，茵陳有清熱解毒，利膽退黃的功效，現(xiàn)代研究其利膽作用：茵陳蒿水煎液可使大鼠膽汁流量明顯增加。對膽汁成分的研究結(jié)果證明，膽汁中的膽固醇、磷脂的排出明顯降低，膽汁脂質(zhì)組成(pl/ba，ch/pl)也有改變，能增加膽汁中固體物、膽酸和膽紅素的排出量；對肝臟的作用：茵陳色原酮對四氯化碳及半乳糖胺所引起的大鼠肝細胞損傷，有濃度依賴的對抗作用。茵陳乙醇提取物對大鼠肝臟微粒體羥基酶活力有誘導(dǎo)作用，還能促進肝臟水解過程，有利于毒物排泄。茵陳蒿湯和茵陳的成分不但對藥物性肝損害的細胞有保護作用，而且對內(nèi)因性生理性細胞死亡也有抑制作用。方中重用茵陳，不僅在于利濕退黃作用，同時還能夠保肝降酶，恢復(fù)肝功能，促進膽紅素的結(jié)合與排泄，故尊為君藥。大黃在古方中為治陽黃要藥，大黃可明顯降低alt值，促進肝細胞再生和rna合成，刺激人體產(chǎn)生干擾素，促進膽汁、膽紅素和膽汁酸分泌，松弛奧迪氏括約肌，疏通肝內(nèi)毛細血管，恢復(fù)肝細胞功能，阻止輕型肝炎向重型肝炎轉(zhuǎn)化，減少并發(fā)癥，降低死亡率。大黃還可作為治療肝纖維化的有效藥物。田基黃藥理作用在于利尿、利膽，其功效為清熱解毒，利濕退黃，消腫散瘀。以上二藥之功效及藥理作用切中病機，可匡扶茵陳，協(xié)同加強其療效，故為臣藥。蘇木在《本草綱目》中為蘇枋木，少用則和血，多用則破血，功用有類紅花?！侗静萁?jīng)疏》：蘇方木，凡積血與夫產(chǎn)后血脹悶欲死，無非心、肝二經(jīng)為病，此藥咸主入血，辛能走散，敗濁瘀積之血行，則二經(jīng)清寧，而諸證自愈。瞿麥，《本草備要》說：“降心火，利小腸，逐膀胱邪熱，為治淋要藥?！逼涮攸c是能入血分、清血熱，故治血淋、尿血時常用。一般多與炒梔子、黃柏炭、海金沙、白茅根、燈心炭等同用，并有活血袪瘀的作用，在本方中起利尿通淋退黃，破血通經(jīng)的作用。平地木始載于《李氏草秘》?！毒V目拾遺》在“葉底紅”條引《李氏草秘》云：“葉下紅，一名平地木。長五六寸，莖圓，葉下生紅子，生山隰等處?！睘槊耖g常用的中草藥之一，根、葉可祛風(fēng)除濕，散瘀止痛，通經(jīng)活絡(luò)。蘇木、瞿麥、平地木通過活血散瘀、利濕通絡(luò)來達到協(xié)同作用“去瘀血，生新血，流利經(jīng)脈”，改善肝臟微循環(huán)，為佐助之藥。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明中藥6味藥清熱利濕，化瘀退黃，使?jié)裥皬亩愣觯S出竅，諸藥合用，相須相使，相得益彰，共奏退黃之效而無損傷脾胃之弊。本發(fā)明中藥療效確切、無毒副作用、安全可靠。

附圖說明

圖1為健康清潔級sd大鼠各組肝臟組織形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果，其中，a：空白對照組；b：anit模型組；c：低劑量退黃合劑+anit組；d：中劑量退黃合劑+anit組：e：高劑量退黃合劑+anit組。

圖2為健康清潔級sd大鼠各組肝組織中icam-1表達水平，其中，a：空白對照組；b：anit模型組；c：低劑量退黃合劑+anit組；d：中劑量退黃合劑+anit組：e：高劑量退黃合劑+anit組。

具體實施方式

實施例1

制備本發(fā)明的治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸的中藥，各樣品由表1中所示的重量份數(shù)的原料制成，制備方法為：取配方量的各原料粉碎為細末、混勻。

表1治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸中藥組方

本發(fā)明中藥可做成合劑又可煎服，還可制成丸劑或膠囊或片劑。合劑每次喝30ml，每日三次。

或用水煎服：一日一劑，煎煮兩遍。取表1中的任一樣品一份(每份樣品中各組分的克數(shù)如表1中配方所示)，先用600ml涼水浸泡一小時，第一遍煮沸后，改文火再煎30分鐘，取汁150ml；第二遍加涼水400ml，煮沸后改文火煎煮40分鐘，取汁150ml，兩遍煎出藥液混合，早、中、晚飯后30分鐘各服100ml。

實施例2用本發(fā)明中藥治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸

一、對象和方法

設(shè)計：采用隨機、平行、對照試驗方法。選用退黃合劑(a)和茵梔黃顆粒(b)對照，即對照觀察a和b治療濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸的療效，以比較a和b改善臨床癥狀的強度；借助現(xiàn)代檢查技術(shù)，通過對實驗前后兩組患者tbil、dbil、dbil/tbil、alt、ast檢測比對，觀察其干預(yù)水平。

單位：重慶市中醫(yī)院肝病科病房和門診。

對象：選擇2011年8月～2014年12月在重慶市中醫(yī)院肝病科門診和住院的濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸患者60例。

納入標準：凡符合以下全部條件者，方可納入為觀察病例：(1)符合各種病因引起的肝炎(尤其是慢性乙型肝炎)診斷標準及中醫(yī)濕熱瘀阻的診斷標準；(2)病程在半年以上；(3)年齡>18歲，性別不限；(4)知情同意，愿者受試。

附：慢性乙型肝炎的西醫(yī)診斷標準：參照2000年9月中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)會西安會議聯(lián)合修定的《病毒性肝炎防治方案》中有關(guān)慢性乙型病毒性肝炎的診斷標準而制定：(1)急性肝炎病程超過半年，或原有乙型肝炎或hbsag攜帶史，本次又因同一病原再次出現(xiàn)肝炎癥狀、體征及肝功能異常者。(2)發(fā)病日期不明或雖無肝炎病史，但肝臟病理學(xué)檢查符合慢性肝炎，或根據(jù)癥狀、體征、化驗及b超檢查綜合分析符合慢性肝炎者。(3)血清乙肝病毒感染指標：hbsag、hbeag、抗一hbc及hbv一dna陽性。凡符合上述(1)、(2)、(3)任一項者可診斷為慢性乙型病毒性肝炎，同時符合第(3)項者，可診斷為慢性乙型肝炎病毒活動性復(fù)制。

慢性病毒性肝炎臨床上可分為輕、中、重度。

(1)輕度：臨床癥狀、體征輕微或缺如，肝功能指標僅1項或2項輕度異常；

(2)中度：癥狀、體征、實驗室檢查居于輕度和重度之間；

(3)重度：有明顯或持續(xù)的肝炎癥狀，如乏力、納差、腹脹、尿黃等，伴有肝病面容、肝掌、蜘蛛痣、脾大并排除其他原因，且無門靜脈高壓者。實驗室檢查血清alt和/或ast反復(fù)或持續(xù)升高，白蛋白降低或a/g比值異常、丙種球蛋白明顯升高。除前述條件外，凡白蛋白≤32.9/l，膽紅素大于5倍正常上限、凝血酶原活動度60％一40％，膽堿脂酶<2500u/l，四項檢測中有一項達上述程度者即可診斷為慢性重度肝炎。

中醫(yī)證候診斷標準：濕熱瘀阻證的辨證標準

參照2002年發(fā)布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》慢性乙型肝炎濕熱瘀阻證中醫(yī)辨證標準：

主證：黃疸。

次證：(1)胸悶；(2)倦怠困重；(3)脅痛；(4)腹脹；(5)口苦；(6)納呆；(7)大便溏而不爽；(8)舌苔黃或白膩，質(zhì)黯紅或有瘀斑；(9)脈濡數(shù)或滑數(shù)。

辨證要求：備主證或具備主證加次證中的任何2項者。

癥狀記分標準

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中的療效標準擬訂：見表1

表1中醫(yī)癥狀體征分級量化表

注：舌、脈不計分。

病情分級標準：見表2

表2病情分級標準

①輕度：總積分＜9。②中度：總積分9-15。③重度：總積分≥16。

選擇同期符合納入標準的病例60例，按隨機數(shù)字表法分治療組34例、對照組26例(包括本院門診和住院患者)，兩組性別、年齡、病程等臨床資料差異無顯著性(p＞0.05)，具有可比性。

試驗用藥及給藥方法:兩組均于治療前1周開始直至療程結(jié)束停用其他影響療效判定的中藥和西藥，治療組用實施例1制備的樣品6制備的退黃合劑口服，每次30ml，日3次；對照組用茵梔黃顆粒(魯南制藥股份有限公司)2袋，日3次。

兩組均以4周為1療程

觀察內(nèi)容:(一)基本情況：⑴一般資料：姓名(觀察表用漢語拼音縮寫)、出生日期、性別、家庭住址、電話等。⑵病史：目前的主要癥狀或不適是——黃疸、脅痛、腹脹、惡心嘔吐、口苦納呆等；本次發(fā)作病程(日)；本次發(fā)作近期治療情況：有無藥物治療。⑶既往史：既往是否有嚴重疾病及服藥情況。⑷試驗前基礎(chǔ)體檢情況：身高、體重、心率、血壓、呼吸、體溫、ecg、軀體檢查等。(二)安全性觀察：(1)一般體檢項目檢查(2)血、尿常規(guī)檢查(3)心、肝、腎功能檢查(4)可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)(包括不良反應(yīng)的臨床表現(xiàn)，檢測指標異常、嚴重程度、消除方法和時間，以客觀評價其安全性)。(三)療效性觀察:(l)臨床癥狀：觀察黃疸、脅痛、食欲、乏力腹脹、舌苔、脈象等，采用積分法記錄。每2周觀察記錄1次。(2)理化檢查指標：肝功能指標(alt、ast、alp、tbil、dbil)，每2周檢查1次。

1疾病療效判定標準

(l)完全應(yīng)答(顯效)：alt恢復(fù)，tbil、dbil、dbil/tbil正常；

(2)部分應(yīng)答(有效)：alt恢復(fù)，tbil、dbil下降70％；

(3)無應(yīng)答(無效)：未達到上述指標者；

(4)總有效率＝(完全應(yīng)答十部分應(yīng)答)/總病例數(shù)。

2中醫(yī)癥候療效評定標準

(1)臨床痊愈：癥狀體征消失或基本消失證候積分減少95％

(2)顯效：癥狀體征明顯改善，證候積分減少70％

(3)有效：癥狀體征均有好轉(zhuǎn)，證候積分減少30％

(4)無效：癥狀體征均無明顯改善，甚或加重證候積分減少不足30％

3安全性評估標準

1級：安全，無任何不良反應(yīng)。

2級：比較安全，如有不良反應(yīng)，不需做任何處理可繼續(xù)給藥。

3級：有安全問題，有中等程度不良反應(yīng)，做處理后繼續(xù)給藥。

4級：因不良反應(yīng)終止實驗。

4統(tǒng)計分析

臨床研究的數(shù)據(jù)資料采用spss18.0統(tǒng)計軟件：根據(jù)觀察指標及數(shù)據(jù)不同，計量資料先進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性及方差齊性時采用t檢驗，方差不齊時用t’檢驗，不符合正態(tài)性時用秩和檢驗，p<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)處理后做出結(jié)論。脫落分析：兩組總脫落率和由于不良事件而脫落率的比較將采用x2檢驗。

二、結(jié)果

1描述性統(tǒng)計

參與者數(shù)量分析：按意向處理分析，60例患者全部進入結(jié)果分析，無脫落者。治療組34例，男性24例，女性10例；對照組26例，男性20例，女性6例。60例患者均符合各種病因引起的肝炎(尤其是慢性乙型肝炎)診斷標準及中醫(yī)濕熱瘀阻的診斷標準，病程在半年以上。兩組例數(shù)、年齡、性別、臨床癥狀及實驗室檢查差異均無顯著性(p>0.05)，具有可比性。

2統(tǒng)計推斷

2.1兩組患者治療前后中醫(yī)癥狀和體征積分值比較，見表3

表3兩組患者治療前后中醫(yī)癥狀和體征積分比較(n＝60)

*與本組治療前比較，p<0.05

2.2兩組癥狀消失時間比較，見表4

表4兩組患者癥狀消失時間比較(n＝60)

治療組與對照組患者癥狀消失時間比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但治療組患者癥狀消失時間較對照組快，相對來說療程短。

2.3兩組患者療效比較治療組34例，痊愈1例，顯效19例，有效10例，無效4例，總有效率為88.24％(30/34)，愈顯率為67.65％(23/34)。對照組26例，顯效6例，有效14例，無效6例，總有效率76.92％(20/26)，愈顯率為23.08％(6/26)。

2.4兩組治療前后臨床指標變化比較，見表5。

表5兩組治療前后臨床指標比較(n＝60)

注：同組治療前后自身比較，*p＜0.05,**p＜0.01

結(jié)果表明，治療組和對照組均能有效改善肝臟炎癥指標和膽紅素代謝指標(p＜0.05)，但以治療組更為明顯，治療組總有效率和愈顯率顯著高于對照組。提示退黃合劑對濕熱瘀阻型肝細胞性黃疸有顯著療效，對肝臟炎癥指標(alt、ast、ggt)、膽紅素代謝指標(tbil、dbil、dbil/tbil的變化)、凝血功能等實驗室指標有明顯改善作用。

3不良事件和副反應(yīng)

治療組和對照組用藥期間均無不良反應(yīng)，兩組治療后血常規(guī)、尿常規(guī)檢測無明顯變化，未出現(xiàn)嚴重肝腎功能損害及出血等副作用。無因副反應(yīng)而脫落者。實施例3本發(fā)明中藥對anit致膽汁淤積性肝損傷的保護作用

1材料

1.1實驗動物

健康清潔級sd大鼠，雌雄各半，重量180-220克，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：scxk(渝)20070001。

1.2藥品與試劑

退黃合劑(規(guī)格1g/ml,采用實施例1中的樣品6制備)，異硫氰酸-1-萘酯(anit)為上海阿拉丁公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)、堿性磷酸酶(alp)、總膽紅素(tbil)、直接膽紅素(dbil)、髓過氧化物酶(mpo)和超氧化物歧化酶(sod)測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，ecl化學(xué)發(fā)光和bca蛋白定量試劑盒(美國pierce公司)，大鼠巨噬細胞炎性蛋白(macrophageinflammatoryprotein,mip)-2elisa檢測試劑盒、細胞間粘附分子(intercellularadhesionmolecule-1,icam)-1和-actin抗體(英國abcam公司)。

2方法

2.1動物分組和給藥

將動物隨機分成五組，即空白對照組，anit模型組、低、中、高劑量退黃合劑+anit組，每組12只。正常組給等容積的生理鹽水，anit模型組大鼠一次性灌胃150mg/kg。低、中、高劑量退黃合劑+anit組，分別用退黃合劑5、15和30g/kg·d灌胃三天，最后一次給藥后半小時再一次性灌服150mg/kganit。大鼠在anit灌胃48h后處死，分別取血清和肝組織用于以下的實驗分析。

2.2血清轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、膽紅素測定

取大鼠血液，離心(3000r/min,10min)后取血清，按試劑盒說明書分別檢測血清中alt、ast、alp、dbil和tbil。

2.3肝臟組織形態(tài)學(xué)分析

取部分肝臟組織，4％多聚甲醛固定后梯度酒精脫水后石蠟包埋、切片、he染色，光學(xué)顯微鏡×200倍下觀察肝組織形態(tài)變化。

2.4酶聯(lián)免疫法檢測肝組織中mip-2生成量

分別取肝組織200mg用加入蛋白酶抑制劑的組織裂解液提取總蛋白,并測定總蛋白濃度。隨后按elisa試劑盒說明測定肝組織中mip-2含量，以每mg總蛋白標準化。

2.5肝組織中sod和mpo活性檢測

用上述提取總蛋白按試劑盒說明檢測sod活性，以每mg總蛋白標準化。另取大鼠肝組織200mg提取總蛋白，然后檢測肝組織內(nèi)mpo的活性，并計算每克肝組織中mpo的活性。

2.6免疫印跡法檢測肝組織中icam表達量

稱取100mg肝組織，研磨后裂解組織、提取蛋白，bca法蛋白定量。取40g蛋白上樣，sds-page電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1h；加入一抗4℃冰箱封閉過夜；次日脫洗3次，二抗孵育1h，再脫洗5次后，ecl顯色，x光片曝光，洗片。

2.7統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)以x±s表示，運用spss軟件對兩樣本均數(shù)t檢驗,p<0.05表示有統(tǒng)計差異。

3結(jié)果

3.1各組血清轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶和膽紅素的實驗結(jié)果

如表6示，與空白對照組相比，anit模型組血清中alt、ast和alp酶的活性明顯增高，同時血清中直接膽紅素(dbil)和總膽紅素(tbil)也顯著增加(p<0.01)；而相對于anit模型組，低、中、高劑量退黃合劑+anit組血清中alt、ast和alp活性以及dbil和tbil呈劑量依賴性地降低，特別是在高劑量退黃合劑+anit組(p<0.01)。

表6各組大鼠血清中alt、ast、alp、dbil和tbil結(jié)果比較(n＝7)

注：與空白對照組比較，△p<0.01；與anit模型組比較，*p<0.05,**p<0.01

3.2各組肝臟組織形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果

各實驗組肝臟組織切片he染色結(jié)果如圖1，空白對照組，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，膽管區(qū)無明顯異常，但在anit模型組的肝臟中，可見大量炎性細胞浸潤，肝細胞變性、壞死，膽管上皮細胞結(jié)構(gòu)破壞。退黃合劑可改善anit導(dǎo)致的這些病理改變，特別是在高劑量組，可見肝細胞壞死明顯減少，膽管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰。

3.3各組肝組織中mip-2,mpo和sod的實驗結(jié)果

通過對肝組織內(nèi)mip-2、mpo和sod的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見表7)，比較空白對照組anit模型組肝內(nèi)mip-2生成和mpo活性顯著增高(p<0.01)，但sod的活性卻明顯降低(p<0.01)；相對于anit模型組，退黃合劑呈劑量依賴地抑制mip-2生成和mpo的活性，但卻增高sod的活性。

表7各組大鼠肝組織中mpo和sod活性及mip-2生成量結(jié)果比較(n＝6)

注：與空白對照組比較，△p<0.01；與anit模型組比較，*p<0.05,**p<0.01

3.4各組肝組織中icam-1表達的實驗結(jié)果

免疫印跡法分別檢測肝組織中icam-1表達情況見圖2。以內(nèi)參蛋白-actin的表達量標準化后，相對于空白對照組，anit模型組肝組織中icam-1的表達明顯上調(diào)，然而這種上調(diào)icam-1可被退黃合劑呈劑量依賴地下調(diào)。

4結(jié)論

anit是一種肝毒性物質(zhì)，主要影響膽管上皮細胞和肝細胞，導(dǎo)致肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷，表現(xiàn)為血液中膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶的顯著增高。本實驗發(fā)現(xiàn)，退黃合劑可呈劑量依賴性地改善anit誘導(dǎo)的這種肝損傷，包括減少轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶的活性，降低血清中直接膽紅素和總膽紅素的含量，減輕肝臟的病理性改變。因此，退黃合劑對anit致膽汁淤積性肝炎有保護作用。

先前的研究證實，中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在anit致膽汁淤積性肝炎扮演著重要的作用。anit損傷膽管細胞和肝細胞，釋放一系列介質(zhì)，通過募積大量的中性粒細胞，產(chǎn)生活性氧，引起肝臟的炎癥反應(yīng)，加重膽汁淤積和肝臟的壞死。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)anit處理的大鼠肝臟中mpo活性顯著增高，而退黃合劑劑量依賴地抑制mpo的活性。由于mpo是中性粒細胞特異性標志分子，因此，這一結(jié)果提示，退黃合劑能有效地減輕肝臟中性粒細胞的浸潤。另外，浸潤的中性粒細胞通過nadph氧化酶生成大量活性氧，氧化肝臟中的還原酶如sod等，阻斷這些還原酶的活性?；诖?，我們也分析肝臟中sod活性，其結(jié)果也顯示，退黃合劑明顯改善anit抑制的sod活性。mip-2被認為是促進中性粒細胞浸潤的最主要趨化因子，它通過和中性粒細胞上的cxcr2受體結(jié)合，吸引中性粒細胞的募集。xu等在研究中發(fā)現(xiàn)，anit致肝內(nèi)中性粒細胞浸潤，是通過誘導(dǎo)肝細胞釋放mip-2實現(xiàn)的，cxcr2敲除的肝臟內(nèi)中性粒細胞明顯減少，且anit誘導(dǎo)的肝損傷也顯著減輕。通過酶聯(lián)免疫法進一步檢測肝組織內(nèi)mip-2的含量，我們發(fā)現(xiàn)：相似于mpo的結(jié)果，退黃合劑也呈劑量依賴性地抑制anit誘導(dǎo)的肝內(nèi)mip-2的生成。事實上，在炎癥細胞浸潤過程中，除了趨化因子，也涉及到一些粘附分子。icam-1是一個重要的粘附分子，能介導(dǎo)大多炎性細胞如巨噬細胞、中性粒細胞等的浸潤，icam-1和mac-1參與肝臟內(nèi)中性粒細胞的募集和活化。通過免疫印跡法我們也發(fā)現(xiàn)退黃合劑能抑制anit上調(diào)的icam-1的表達。

實驗證明，本發(fā)明中藥是一種有效的肝臟保護和降低黃疸的中藥方劑，其作用機制可能涉及到通過降低mip-2的生成和icam-1的表達，從而減輕肝臟中性粒細胞引起的炎癥反應(yīng)。