本發(fā)明涉及雷公藤甲素及其衍生物的一種新用途，具體涉及一種雷公藤甲素及其衍生物在制備治療和/或預(yù)防肺損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性呼吸道窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome，ards)是一類臨床重癥疾病，ards發(fā)病原因多樣，包括誤吸、嚴重肺部感染等直接病因和嚴重創(chuàng)傷、彌漫性血管內(nèi)凝血、休克等間接病因。ards具體發(fā)病機制目前尚未完全明了，較為公認的是病原微生物及其它損傷因素破壞呼吸系統(tǒng)組織和細胞、淋巴細胞過度活化，導(dǎo)致促炎/抗炎反應(yīng)失衡，炎癥因子過度釋放導(dǎo)致肺毛細血管損傷，引發(fā)氧合功能障礙。ards治療手段有呼吸支持、藥物治療等，這些治療藥物包括糖皮質(zhì)激素、神經(jīng)肌肉阻斷劑、中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗氧化劑、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、β2腎上腺素受體激動劑、血管擴張劑等，盡管有很多種類的藥物被用于ards的治療，但多個報道顯示ards死亡率仍達到30％～50％。

ards治療中采用糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid)是為了緩解過度的急性炎癥反應(yīng)，在臨床上用途很多，其中一類用途是病毒感染導(dǎo)致的ards治療，如應(yīng)用于重癥急性呼吸綜合征(sars)冠狀病毒、h1n1型流感病毒、禽流感病毒引起的ards。但其療效并未取得廣泛認可，多個文獻報道顯示該類藥物用于ards治療療效有限，且因為引起股骨頭壞死等副反應(yīng)，限制了其應(yīng)用范圍。甲潑尼龍(methylprednisolone，me)是臨床上常用的糖皮質(zhì)激素類藥物，糖皮質(zhì)激素可以換算成甲潑尼龍當量進行使用，在國內(nèi)常用于ards的治療。

中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)最重要的組成部分之一，中藥的免疫調(diào)節(jié)作用已在臨床治療中得到廣泛應(yīng)用。但中藥成分復(fù)雜，難以標準化、定量化測定其效果。我們使用細胞模型從中藥材來源活性分子中篩選具有免疫抑制效應(yīng)的分子，從208個純化藥物分子發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素(triptolide，tp)的免疫抑制最強，雷公藤甲素也稱為雷公藤內(nèi)酯醇，分子式為c20h24o6，化學(xué)物質(zhì)登錄號為cas#38748-32-2，分子結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示：

是一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯類化合物，是雷公藤多甙中活性分子之一，是雷公藤多苷的主要有效成分。雷公藤甲素的免疫抑制效應(yīng)很強，主要應(yīng)用于類風濕性疾病、腎病綜合征、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病及腫瘤治療，常用的藥劑方式有雷公藤片、雷公藤多苷片、昆明山海棠片等。目前，尚未見到雷公藤多苷及雷公藤甲素被用于ards治療的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種雷公藤甲素及其衍生物在制備治療和/或預(yù)防肺損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明第一方面提供了雷公藤甲素及其衍生物在制備治療和/或預(yù)防肺損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。

其中，所述肺損傷疾病包括急性肺損傷疾病或慢性肺損傷疾病。

其中，所述肺損傷疾病包括急性呼吸窘迫綜合征、急性肺損傷、特發(fā)性肺纖維化、博來霉素誘發(fā)的肺纖維化、機械呼吸機誘發(fā)的肺損傷、慢性阻塞性肺病慢性支氣管炎和肺氣腫中的至少一種。

其中，所述肺損傷疾病包括病毒感染引起的急性呼吸窘迫綜合征。

其中，所述雷公藤甲素及其衍生物作為單一活性成分或與其他藥學(xué)上可接受的活性成分構(gòu)成組合物以制備所述藥物。

其中，所述其他藥學(xué)上可接受的活性成分包括甘草次酸、甘草酸銨、甘草合劑、阿魏酸、白藜蘆醇、白芍總苷、鳳尾草提取物和金錢草提取物中的至少一種。

其中，所述藥物包括以下重量份數(shù)的組分：

其中，所述藥物與其他活性藥劑聯(lián)合使用，所述其他活性藥劑包括糖皮質(zhì)激素藥物。

其中，所述藥物的給藥方式包括局部給藥、消化道給藥或非消化道給藥。

其中，所述藥物的給藥方式包括口服、注射、呼吸道吸入或經(jīng)皮給藥。

其中，所述雷公藤甲素及其衍生物的用量按不同用藥途徑分別為：口服按0.5-10ug/kg體重/日，肌肉或靜脈注射按0.1-3ug/kg體重/日，呼吸道吸入按0.01-2ug/kg體重/日。

雷公藤甲素能顯著抑制佛波酯(pma)活化的淋巴細胞模型中g(shù)fp熒光蛋白(細胞活化胞內(nèi)指標)和p24抗原(細胞分泌的病毒抗原指標)的升高效應(yīng)，雷公藤甲素濃度越高，gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度越低，存在負的劑量-效應(yīng)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為-0.954和-0.945,p值分別為0.003和0.004。其原理為雷公藤甲素抑制了pma所導(dǎo)致的g0/g1期細胞比例升高和s期細胞比例下降，促使細胞周期停滯于未活化狀態(tài)，雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)細胞周期起到抑制淋巴細胞增殖、活化的作用；同時，也起到抑制病毒復(fù)制的作用。

附圖說明

圖1為各濃度雷公藤甲素對細胞周期分布的影響圖；

圖2為活細胞設(shè)門及三種熒光補償調(diào)整分析圖；

圖3為各劑量雷公藤甲素實驗組凋亡/死亡細胞分布圖。

具體實施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。

除非特殊聲明，所有本文中的技術(shù)性和科學(xué)名詞在該發(fā)明中和普遍使用的含義相同。盡管有些方法和材料的敘述可以用于本發(fā)明的描述。

本文中，“一”用于指一個或多于一個(比如至少一個)。舉例說明，“一種成分”的含義是一種成分或多于一種成分。

本文中，“組合”或者“藥物組合”指的是本發(fā)明中所使用的一種以上藥物的混合，使用藥物學(xué)上可接受的載體。藥物組合幫助藥物更容易到達病人或?qū)嶒瀯游锊≡?。條款中描述多種技術(shù)包括，并不局限于，靜脈給藥、口服、氣霧吸入、腸胃外、眼部、鼻腔、肺部和局部給藥。

本文中“疾病”指的是實驗動物的健康狀態(tài)不能維持穩(wěn)態(tài)，所以在本文中疾病不改善，動物的健康狀態(tài)持續(xù)惡化。

本文中“有效劑量”，“藥物學(xué)有效劑量”和“治療有效劑量”指非毒理性但足夠劑量能夠引起所需的生物學(xué)結(jié)果。這些結(jié)果包括減少或減輕疾病的特征癥狀或減弱疾病的病因，或者向其它生物學(xué)系統(tǒng)的良好方向發(fā)展。針對個體合適的治療劑量可根據(jù)常規(guī)實驗數(shù)據(jù)正常范圍得出。

本文中“病人”，“實驗對象”，“個體”可以相互轉(zhuǎn)化使用，對于實驗動物和實驗細胞而言也是如此，體內(nèi)和體外都一樣。在沒有限制的實施例中，病人，實驗對象和個體指的是人。

本文中，“藥物學(xué)可接受的”指的是一種材料，比如載體或者稀釋劑，他們本身不影響藥物的生物學(xué)活性，而且相對是無毒的，比如該材料可以注入個體體內(nèi)而不會引起不好的生物學(xué)反應(yīng)或和其攜帶的藥物發(fā)生嚴重的反應(yīng)。

本文中，“藥物學(xué)可接受的載體”指的是藥學(xué)上可接受的材料，組和或者載體，比如液體，固體填料，緩釋劑，穩(wěn)定劑，分散劑，懸浮劑，稀釋劑，賦形劑，增稠劑，溶劑或包封材料，他們的作用是運輸本發(fā)明中的有效成分，使其在患者體能發(fā)揮應(yīng)有的作用。一般而言，運輸是從一個器官，或者身體的某一部分到達另外一個器官或者身體的另外一個部分。每一個載體必須和各個配方成分相兼容，包括發(fā)明中的有效成分，使其對患者不產(chǎn)生負面影響。這些材料在藥物學(xué)上可接受的載體包括：糖類，比如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素，以及其衍生物，比如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油，例如花生油，棉籽油，紅花油，芝麻油，橄欖油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；表面活性劑；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩沖溶液；以及其它無毒在藥物學(xué)上配方相容物質(zhì)。

本文中，“藥物學(xué)上可接受的載體”也包括所有的表面涂料，抗菌和抗真菌制劑，吸收延遲劑，和與本發(fā)明中有用的化合物的活性相容的類似物，這些在生理學(xué)上能被病人所接受。

“藥物學(xué)上可接受的載體”也可以進一步包括發(fā)明中在藥物學(xué)上可接受的有效鹽成分。其它成分也包括制藥學(xué)上的成分組成，在條例中描述和使用的該項發(fā)明，比如在remington制藥學(xué)科學(xué)((genaro,ed.,mackpublishingco.,1985,easton,pa),在此引用作為參考。

本文中，“預(yù)防”含義為在給予了藥物后未發(fā)病的實驗者能避免或者延遲和疾病或狀況相關(guān)的癥狀發(fā)生。

本文中“治療”或者“治療過程”定義為使用治療上的藥物，比如本發(fā)明中的化合物(單獨使用或者跟其它藥物聯(lián)合使用)，用在病人，或者用在病人身體提取分離的組織或者細胞系(比如為了診斷和體外培養(yǎng))。該病人其具有本文考慮的病癥，病癥的癥狀或能發(fā)展成本文考慮的病癥的可能性，為了治愈，治療，減輕，改變，減弱，提高或者影響本文考慮的病癥和或者發(fā)展出該病癥狀的可能性。這些治療可以根據(jù)不同藥物基因組學(xué)的最新知識在適當情況下量體裁衣。

本發(fā)明實施方式提供了雷公藤甲素及其衍生物在制備治療和/或預(yù)防肺損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明實施方式中，所述肺損傷疾病包括急性肺損傷疾病或慢性肺損傷疾病。可選地，所述肺損傷疾病包括肺部急性炎癥性疾病。進一步可選地，所述肺損傷疾病包括急性呼吸窘迫綜合征、急性肺損傷、特發(fā)性肺纖維化、博來霉素誘發(fā)的肺纖維化、機械呼吸機誘發(fā)的肺損傷、慢性阻塞性肺病慢性支氣管炎和肺氣腫中的至少一種。具體地，所述肺損傷疾病包括病毒感染引起的急性呼吸窘迫綜合征。

本發(fā)明實施方式中，所述雷公藤甲素的衍生物包括雷公藤氯內(nèi)酯醇、琥珀酰雷公藤甲素單酯鈉、2-甲胺基乙酸雷公藤甲素酯檸檬酸鹽和5-羥基雷公藤內(nèi)酯醇中的至少一種。

本發(fā)明實施方式中，所述雷公藤甲素及其衍生物作為單一活性成分或與其他藥學(xué)上可接受的活性成分構(gòu)成組合物以制備所述藥物?？蛇x地，所述其他藥學(xué)上可接受的活性成分包括甘草次酸、甘草酸銨、甘草合劑、阿魏酸、白藜蘆醇、白芍總苷、鳳尾草提取物和金錢草提取物中的至少一種。本發(fā)明將雷公藤甲素與甘草次酸等成分組合使用，可以降低雷公藤甲素的毒性?？蛇x地，雷公藤甲素及其衍生物與所述其他藥學(xué)上可接受的活性成分的摩爾比為1:1-1:10。

本發(fā)明實施方式中，所述雷公藤甲素及其衍生物在制備治療和/或預(yù)防肺損傷疾病的藥物中的應(yīng)用的具體形式可以為雷公藤片、雷公藤多苷片或昆明山海棠片。

本發(fā)明實施方式中，所述藥物與其他活性藥劑聯(lián)合使用。其它活性藥劑是可以買到的，已知的可以預(yù)防或減輕肺損傷疾病癥狀的藥物。可選地，其它活性藥劑包括甲潑尼龍等糖皮質(zhì)激素。聯(lián)合使用時，甲潑尼龍可以是常規(guī)劑量或可以低于常規(guī)劑量。

本發(fā)明實施方式中，所述雷公藤甲素及其衍生物可與藥學(xué)上可接受的載體形成組合物。本文中，“藥學(xué)上可接受的載體”指的是藥學(xué)上可接受的材料或者載體，比如液體，固體填料，緩釋劑，穩(wěn)定劑，分散劑，懸浮劑，稀釋劑，賦形劑，增稠劑，溶劑或包封材料，他們的作用是運輸本發(fā)明中的有效成分，使其在患者體內(nèi)發(fā)揮應(yīng)有的作用。一般而言，運輸是從一個器官，或者身體的某一部分到達另外一個器官或者身體的另外一個部分。每一個載體必須和各個配方成分相兼容，包括發(fā)明中的有效成分，使其對患者不產(chǎn)生負面影響。這些材料在藥物學(xué)上可接受的載體包括：糖類，比如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素，以及其衍生物，比如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油，例如花生油，棉籽油，紅花油，芝麻油，橄欖油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；表面活性劑；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩沖溶液；以及其它無毒在藥物學(xué)上配方相容物質(zhì)。

合適的組成和給與藥物形式包括例如分散體，懸浮液，溶液，糖漿，顆粒，珠，粉末，丸劑，用于鼻或口服的液體噴霧劑，用于吸入的干粉或氣霧化制劑等。值得注意的是應(yīng)用于本發(fā)明的制藥方式和組成并不局限于本文中描述某種特定的方法和組成。

本發(fā)明實施方式中，所述藥物的給藥方式包括局部給藥、消化道給藥或非消化道給藥。局部給藥是指直接用藥于要影響的身體部位，包括：表皮給藥，呼吸道吸入給藥，灌腸給藥，眼部給藥，鼻腔給藥。消化道給藥，包括口服、肛門給藥。非消化道給藥包括經(jīng)動脈注射、靜脈注射、肌肉注射、心內(nèi)注射、皮下注射、骨髓腔內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、顱內(nèi)植入或透皮給藥?？蛇x地，所述藥物的給藥方式包括口服、注射或霧化吸入。

本發(fā)明實施方式中，所述藥物的給藥方式包括口服、注射、呼吸道吸入或經(jīng)皮給藥。

給藥方案可以影響有效量的組成成分。本發(fā)明治療制劑可以在發(fā)病前或者發(fā)病后給與實驗對象。此外，幾次分開的劑量以及交錯劑量可以每日或順序給藥，或者劑量可以連續(xù)輸注，或者可以是推注。還有，治療制劑的劑量可根據(jù)治療或預(yù)防情況的緊急情況按比例地增加或減少?？梢酝ㄟ^調(diào)整劑量方案以提供最佳治療效果。

向患者，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人施用本發(fā)明中的藥物可以使用已知的給藥程序，用本發(fā)明中陳述的疾病或紊亂的劑量和治療時間給與執(zhí)行。本研究中有效治療劑量需要根據(jù)不同因素來調(diào)整，包括病人疾病和紊亂的發(fā)展階段，年齡，性別，體重；還有治療藥物的活性。比如，可以每天施用幾個分開的劑量，或者可以按照治療情況的緊急情況按比例減少劑量。其中一個非限制性示例為本發(fā)明的治療藥物有效劑量范圍約為：口服按0.5-10ug/kg體重/日，肌肉或靜脈注射按0.1-3ug/kg體重/日，呼吸道吸入按0.01-2ug/kg體重/日。具體地，對呼吸內(nèi)科感冒發(fā)燒癥狀加重，出現(xiàn)ards癥狀患者，臨床檢驗顯示為呼吸道病毒感染，擬根據(jù)情況，按上述劑量服用3-10天常規(guī)劑量的雷公藤甲素(每日分三次服用)。

在其中一個實施例中，本研究的藥物給與病人的頻率為一天一次到五次以上。在另一實施例中，本研究藥物給藥頻率可以是但并不局限于每天一次，每兩天一次，每三天一次，直到每周一次，每兩周一次。很明顯的是，目前給藥多種組合的頻率不盡相同，取決于但不局限于年齡，疾病和紊亂是否進行過治療，性別，健康狀況以及其它因素。因此，本發(fā)明不應(yīng)被理解為限于任何特定的劑量方案，并且給予任何患者的精確劑量和組合物，要通過考慮到患者的所有其他因素而進行物理確定后來決定。

可以理解的是每天給與的藥物可以但并不局限于每天一次，每兩天一次，每三天一次，每四天一次，每五天一次。比如說，針對每兩天給與的頻率，一天給與10μg，可以由周一開始給與第一個10μg，然后周三10μg，周五10μg，依次進行下去。

在患者狀態(tài)改善的情況下，根據(jù)醫(yī)生的判斷，可以連續(xù)給予本發(fā)明的藥物；或者，所施用的藥物的劑量暫時減少或暫時中止一段時間(比如“藥物假期”)。藥物假期的長短可以從2天到1年，包括2天，3天，4天，5天，6天，7天，10天，12天，15天，20天，28天，35天，50天，70天，100天，120天，150天，180天，200天，250天，280天，300天，320天，350天或者365天。藥物假期中劑量減少范圍是10％-100％，可包括10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,或者100％。

一旦病人出現(xiàn)癥狀改善，維持治療的劑量可以給與。另外，也可以將劑量或頻率，或者兩者都降低，如果患者的身體功能在疾病和紊亂情況下都有所改善。在其中一個實施例中，病人需要長期間斷性的智力，因為癥狀的反復(fù)出現(xiàn)和/或感染。

雷公藤甲素抑制了pma所導(dǎo)致的g0/g1期細胞比例升高和s期細胞比例下降，促使細胞周期停滯于未活化狀態(tài)，雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)細胞周期起到抑制淋巴細胞增殖、活化的作用；同時，也起到抑制病毒復(fù)制的作用。本發(fā)明雷公藤甲素及其衍生物可替代或與甲潑尼龍等糖皮質(zhì)激素類似物聯(lián)合使用，用于治療和/或預(yù)防肺損傷疾病，可以抑制過度免疫，尤其是肺部的過度免疫，改善癥狀，提高患者生存率。

為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用雷公藤甲素的藥理試驗及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。

我們擬將雷公藤甲素替代糖皮質(zhì)激素應(yīng)用于ards治療中，設(shè)計了專門的試驗驗證雷公藤甲素在毒性允許范圍內(nèi)其效果優(yōu)于甲潑尼龍，藥物毒性作用測試采用細胞凋亡試驗；同時測試這兩種藥物分子對細胞周期的影響，以闡述其藥物作用的機理。

試驗采用的細胞模型是以傳代淋巴細胞(急性t淋巴細胞白血病細胞系)為載體，將帶有綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)的基因及一段病毒基因整合入細胞中，gfp基因受到活化激發(fā)后可以在細胞中產(chǎn)生gfp蛋白，帶有g(shù)fp熒光蛋白的細胞比例越高，說明細胞模型的活化程度越高，以此模擬ards時肺部浸潤的淋巴細胞活化程度的升高；細胞模型中的病毒基因在受到激發(fā)時可以產(chǎn)生p24抗原并分泌至細胞培養(yǎng)液中，激發(fā)越強，細胞培養(yǎng)液中p24抗原的濃度越高，以此模擬感染所致ards時病原微生物在肺部組織大量繁殖，損傷組織和細胞。

佛波酯(phorbolester，pma)可以誘導(dǎo)細胞增殖、分化，影響細胞信號通路中多個分子的表達，是最強的的t淋巴細胞激活劑之一，本次實驗采用佛波酯作為激活劑作用于細胞模型，模擬ards時淋巴細胞被激發(fā)后的狀態(tài)。如果測試藥物能降低被pma激發(fā)的細胞模型中g(shù)fp陽性細胞百分比，說明該藥物可以抑制淋巴細胞過度的活化。如果測試藥物可以降低被pma激發(fā)的細胞模型p24抗原的表達強度，說明該藥物具有抑制病原微生物在細胞內(nèi)復(fù)制的作用。

測定表達gfp陽性細胞百分比可以通過流式細胞儀分析，細胞培養(yǎng)液中p24抗原濃度可以通過酶聯(lián)免疫試劑盒測定。凋亡試驗用于測定藥物對細胞模型的毒性，用于藥物使用濃度的參考。細胞周期試驗用于分析雷公藤甲素作用于細胞模型的機理。

如果試驗藥物的免疫抑制效果及毒性試驗數(shù)據(jù)優(yōu)于糖皮質(zhì)激素，那么候選藥物可以替代或與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用應(yīng)用于ards的治療。

1材料

1.1細胞株及培養(yǎng)基

細胞模型：帶有g(shù)fp熒光蛋白基因和p24抗原基因的jurkat傳代細胞株，用含10％胎牛血清(fbs)、鏈霉素100u/ml、青霉素100u/ml的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。1.2儀器

1.3主要試劑與耗材

1.4配制試劑

查詢藥物(雷公藤甲素、甲潑尼龍)的分子量，根據(jù)設(shè)定好的藥物儲備液濃度計算出需要稱取的藥物質(zhì)量，采用電子分析天平分別稱量所需藥物(雷公藤甲素20.1mm/l、甲潑尼龍20.1mm/l)，將中藥分子溶于溶劑dmso中，配置成所需濃度的藥物儲備液，放于-20℃冰箱儲存?zhèn)溆?。配制pma(佛波酯)儲備液，用dmso配成pma工作液(2μg/ml)，pma在細胞培養(yǎng)液中的終濃度為0.02μg/ml。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出細胞模型常規(guī)方法復(fù)蘇后，在37℃,5％的co2孵箱中進行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞，細胞狀態(tài)良好方可進行進一步的試驗。

2.2細胞懸液制備

取傳代培養(yǎng)24小時的細胞模型，離心后加入新鮮培養(yǎng)基制成細胞懸液，并采用細胞活力計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×10⁵個/ml。分別接種于24孔板中，細胞懸液體積為1800μl。

2.3藥物處理

設(shè)置3個對照組(空白組、dmso溶劑組、pma溶劑組)，設(shè)置3個藥物組，每組分別有5個藥物濃度，雷公藤甲素藥物組(0.04μmol/l、0.02μmol/l、0.01μmol/l、0.005μmol/l、0.0025μmol/l)、甲潑尼龍藥物組(400μmol/l、350μmol/l、300μmol/l、250μmol/l、200μmol/l)及雷公藤甲素和甲潑尼龍混合藥物組[(0.02+200)μmol/l、(0.01+175)μmol/l、(0.005+150)μmol/l、(0.0025+125)μmol/l、(0.00125+100)μmol/l]。

細胞培養(yǎng)板上每孔加入1800μl細胞懸液，對照組中的dmso組加入18μldmso、pma組加9μldmso+9μlpma，藥物組均加入9μlpma+9μl藥物。細胞培養(yǎng)板放置37℃5％co2恒溫培養(yǎng)箱24h后進行流式細胞分析，分別檢測gfp陽性細胞百分比、細胞凋亡及細胞周期變化。用帶內(nèi)標的雙抗體酶聯(lián)免疫法測定各孔細胞培養(yǎng)液中p24抗原濃度。

2.4流式細胞檢測

2.4.1gfp熒光信號強度的檢測

細胞模型處理24h后，將細胞吹吸混勻，取200μl細胞懸液到bd公司流式細胞上樣管內(nèi)，添加1000μlpbs，500g離心6min，倒去上清，加500μlpbs混勻，流式細胞儀上檢測不同濃度藥物處理后gfp陽性細胞百分比的變化。

2.4.2細胞周期檢測

細胞模型處理24h后，將細胞吹吸混勻，取出300μl細胞于流式細胞分析上樣管內(nèi)，按照bdcycletestplusdnareagentkit細胞周期試劑盒的實驗步驟處理細胞模型。最后用35μm濾膜流式上樣管過濾粘連細胞，用流式細胞儀488nm激發(fā)波長激發(fā)細胞，收集pi通路的線性熒光信號，分析不同藥物處理濃度對細胞周期的影響。

2.4.3細胞凋亡檢測

細胞模型處理24h后，將細胞吹吸混勻，取出300μl細胞于流式細胞分析上樣管內(nèi)，按照bd公司annexinv-fitc/pi細胞凋亡雙染試劑盒的實驗步驟處理細胞，放置冰浴中于一小時內(nèi)完成凋亡分析。

2.4.4細胞培養(yǎng)液p24抗原的檢測

將處理好的24孔板放于37℃，5％co2細胞培養(yǎng)箱中孵育24h后，收集細胞于1.5ml離心管中，300g離心5min，取細胞上清液進行檢驗。采用biorad公司p24抗原酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，繪制p24抗原內(nèi)標的標準曲線，計算出每個藥物濃度細胞模型對應(yīng)的p24抗原濃度。

3實驗結(jié)果

3.1雷公藤甲素、甲潑尼龍與兩種藥物聯(lián)合使用抑制效應(yīng)分析

表1-3中數(shù)據(jù)分別是三次試驗gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度(兩個指標)的均值±標準差(m±std)。從表1-表3數(shù)據(jù)可以看出，空白對照和溶劑對照gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度(兩個指標)均很低，為細胞模型未活化狀態(tài)；溶劑對照由于溶劑效應(yīng)導(dǎo)致兩個指標略高于空白對照；pma陽性活化對照兩個指標最高，為完全活化組。

表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著雷公藤甲素濃度遞減，gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度均逐漸升高，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度對數(shù)值與藥物濃度的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義，相關(guān)系數(shù)分別為-0.954和-0.945，p值分別為0.003和0.004，說明藥物的抑制作用隨著濃度的降低而下降。結(jié)合后續(xù)的細胞凋亡分析，雷公藤甲素終濃度為0.02μm時抑制效應(yīng)顯著而毒性較低，是比較好的應(yīng)用濃度。

雷公藤甲素按照濃度梯度每組減半的趨勢遞減，甲潑尼龍由于抑制效應(yīng)偏低而高濃度時毒性較大，不同藥物組濃度梯度下降間隔短。表2數(shù)據(jù)可以看出，甲潑尼龍對gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度均有一定抑制效應(yīng)，也有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，但抑制效應(yīng)不如雷公藤甲素強，尤其表現(xiàn)在p24抗原濃度的下降斜率較小。即使在最高濃度400μm濃度，其抑制效果也不如0.02μm濃度的雷公藤甲素，而細胞凋亡比例已明顯超過雷公藤甲素。

表3數(shù)據(jù)可以看出，與雷公藤甲素單獨使用相比，雷公藤甲素和甲潑尼龍的聯(lián)合使用較單獨使用具有更強的抑制效應(yīng)而細胞凋亡下降，也就是說具有好的協(xié)同效應(yīng)，這種協(xié)同效應(yīng)在低濃度組(雷公藤甲素0.01-0.005μm)更明顯。

表1雷公藤甲素對gfp和p24抗原表達抑制效應(yīng)分析(m±std)

表2甲潑尼龍對gfp和p24抗原表達抑制效應(yīng)分析(m±std)

表3雷公藤甲素與甲潑尼龍混合物對gfp和p24抗原表達抑制效應(yīng)分析

(m±std)

3.2雷公藤甲素與甲潑尼龍對細胞周期的影響

表4-5中數(shù)據(jù)分別是三次試驗細胞周期g0/g1期、g2/m期和s期細胞所占總細胞數(shù)百分比的均值±標準差。三次試驗，不同藥物采用的空白對照、溶劑對照和pma陽性活化對照是一樣的。圖1為各濃度雷公藤甲素對細胞周期分布的影響圖。其中，圖1中a、b、c分別是空白對照、溶劑效應(yīng)組、pma陽性活化對照圖形，圖1中d、e、f雷公藤甲素藥物濃度分別為0.01、0.02、0.04μm時圖形。每個圖左側(cè)的峰為g0/g1期細胞峰，右側(cè)矮峰為g2/m期細胞峰，中間為s期細胞峰。

根據(jù)表4-5三個對照數(shù)據(jù)以及圖1分析，空白對照和溶劑對照g0/g1期細胞所占比例(g0/g1期細胞)最低，由于溶劑效應(yīng)，溶劑對照g1期細胞高于空白對照。pma陽性活化對照g0/g1期細胞顯著高于空白對照和溶劑對照，而s期細胞所占比例(s期細胞)顯著低于空白對照和溶劑對照，這說明細胞活化時，g0/g1期細胞增加，s期細胞下降。g2/m期細胞所占比例(g2/m期細胞)在細胞活化時也有下降，但變化不大(如圖1中a、b、c所示)。

從表4中數(shù)據(jù)可以看出，隨著雷公藤甲素濃度的增加，細胞模型的細胞周期發(fā)生較為規(guī)律性變化，雷公藤甲素低濃度時(0.0025、0.005、0.01μm)抑制效應(yīng)低，g0/g1期細胞甚至高于陽性活化對照；在高濃度時(0.02、0.04μm)，g0/g1期細胞開始逐步下降；0.04μm時，由于高濃度雷公藤甲素抑制了細胞的活化，g0/g1期細胞已經(jīng)降低到接近于溶劑對照。隨著雷公藤甲素濃度的增加，s期細胞的變化與g0/g1期細胞相反，雷公藤甲素低濃度時(0.01μm)抑制效應(yīng)低，s期細胞甚至高于陽性活化對照；在高濃度時(0.02、0.04μm)，s期細胞逐步上升，0.04μm時，由于高濃度雷公藤甲素抑制了細胞的活化，s期細胞已經(jīng)升高到接近于溶劑對照(如圖1中d、e、f所示)。

由此推測雷公藤甲素與pma同時加入細胞模型，抑制了pma所導(dǎo)致的g0/g1期細胞比例升高和s期細胞比例下降，促使細胞周期停滯于未活化狀態(tài)，雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)細胞周期起到抑制細胞增殖、活化的作用。gfp熒光蛋白和病毒基因的表達在這個過程中同時受到抑制，gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度下降。

甲潑尼龍作為常用的免疫抑制藥物，其對細胞周期的作用效果類似于雷公藤甲素，但在最高濃度400μm時，其g0/g1期細胞大于0.04μm雷公藤甲素，s期細胞小于0.04μm雷公藤甲素，說明其對細胞增殖的抑制效果弱于雷公藤甲素。

表4雷公藤甲素對細胞周期變化的劑量-效應(yīng)關(guān)系(m±std)

表5甲潑尼龍對細胞周期變化的劑量-效應(yīng)關(guān)系(m±std)

3.4雷公藤甲素與甲潑尼龍對細胞凋亡的影響

3.4.1流式細胞凋亡分析示意圖

圖2為活細胞設(shè)門及三種熒光補償調(diào)整分析圖；圖3為各劑量雷公藤甲素實驗組凋亡/死亡細胞分布圖。其中，圖2a為流式物理圖，圖2b為調(diào)節(jié)gfp和7-aad熒光補償圖，圖2c為調(diào)節(jié)gfp和anexin-v熒光補償圖；gfp-a為gfp熒光蛋白的熒光強度，7-aad為標記細胞死活的熒光染料信號強度，anexin-ⅴpe為標記凋亡信號的熒光分子的熒光強度。圖3中a、b和c分別為0.01、0.02、0.04um的雷公藤甲素所致早、晚期凋亡示意圖，圖中apopotosis為早期凋亡細胞，dead+apo為晚期凋亡細胞，deadcell為死細胞，livingcell為活細胞。

從圖3中可以看出，從0.01μm至0.04μm，隨著藥物濃度升高，右上象限(晚期凋亡細胞)和右下象限(早期凋亡細胞)細胞百分比逐漸升高，尤其在雷公藤甲素0.04μm濃度時，早期和晚期凋亡細胞所占比例明顯高于0.02μm濃度。

3.4.2不同濃度雷公藤甲素和甲潑尼龍對細胞凋亡/死亡的影響

從表6可以看出，雷公藤甲素在最高劑量0.04μm時早期凋亡和晚期凋亡細胞百分比明顯大于空白對照和溶劑對照，但濃度降低0.02μm時，細胞凋亡百分比迅速降低至與空白對照和溶劑對照接近的程度；甲潑尼龍250μm以上劑量時凋亡細胞百分比都明顯大于空白對照和溶劑對照(見表7)，但如果將濃度降低到250μm以下(200μm)，其對pma誘導(dǎo)的活化效應(yīng)的抑制作用已經(jīng)非常低，這說明雷公藤甲素在作用于細胞的終濃度0.02μm左右具有高效、低毒的藥用價值。

表8說明雷公藤甲素和甲潑尼龍聯(lián)合用藥并沒有增加同一個藥物濃度作用后細胞的凋亡率，而作用效果要強于兩種藥物的單獨作用，聯(lián)合用藥具有一定優(yōu)越性。

表6雷公藤甲素對早、晚期凋亡細胞百分比變化的劑量-效應(yīng)關(guān)系(m±std)

表7甲潑尼龍對早、晚期凋亡細胞百分比變化的劑量-效應(yīng)關(guān)系(m±std)

表8雷公藤甲素和甲潑尼龍混合物對早、晚期凋亡細胞百分比變化的劑量-效應(yīng)

關(guān)系(m±std)

從上述試驗結(jié)果可知，雷公藤甲素能顯著抑制pma活化的淋巴細胞模型中g(shù)fp熒光蛋白(細胞活化胞內(nèi)指標)和p24抗原(細胞分泌的病毒抗原指標)的升高效應(yīng)，雷公藤甲素濃度越高，gfp陽性細胞百分比和p24抗原濃度越低，存在負的劑量-效應(yīng)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.954和-0.945，p值分別為0.003和0.004。而甲潑尼龍即使在濃度高達400μm時，其抑制效果也不如0.02μm濃度的雷公藤甲素，而細胞凋亡比例已明顯超過0.02μm濃度的雷公藤甲素。其原理為雷公藤甲素抑制了pma所導(dǎo)致的g0/g1期細胞比例升高和s期細胞比例下降，促使細胞周期停滯于未活化狀態(tài)，雷公藤甲素通過調(diào)節(jié)細胞周期起到抑制細胞增殖、活化的作用。根據(jù)細胞凋亡分析，雷公藤甲素終濃度為0.02μm時抑制效應(yīng)顯著而毒性較低，是適宜的應(yīng)用濃度。與雷公藤甲素單獨使用相比，雷公藤甲素和甲潑尼龍的聯(lián)合使用較單獨使用具有更強的抑制效應(yīng)而細胞凋亡下降，具有良好的協(xié)同效應(yīng)，這種協(xié)同效應(yīng)在低濃度組(雷公藤甲素0.01-0.005μm)更明顯。因此，本發(fā)明雷公藤甲素及其衍生物可替代或與甲潑尼龍聯(lián)合使用，用于治療和/或預(yù)防肺損傷疾病。

實施例1：

雷公藤甲素口服片的制備：雷公藤甲素口服片劑以β-環(huán)糊精為輔料，可以減輕雷公藤甲素對胃腸道的刺激作用，具體制備方法為：首先將雷公藤甲素粉末溶于乙醇中成為100μm(36000μg/l)溶液，β-環(huán)糊精和雷公藤甲素按質(zhì)量比10:1-1000:1混合，充分攪拌混勻后用超聲波(超聲頻率40000hz)處理10-30分鐘，以制備雷公藤甲素β-環(huán)糊精包合物，干燥處理后制成片劑包裹糖衣做成成藥。每片成藥含雷公藤甲素40μg，按0.5-10μg/kg/日的量分三次服用。

實施例2：

經(jīng)呼吸道(經(jīng)口腔進氣管)吸入途徑的吸入劑：雷公藤甲素難溶于水，為了提高水溶性，盡量將雷公藤甲素分子分散，首先將雷公藤甲素粉末溶于dmso中成為100μm(36mg/l)溶液，按重量/體積比加入殼聚糖制成濃度0.6％(w/v)溶液，該溶液經(jīng)0.8μm微孔濾膜過濾后，噴霧干燥機制備微粒，參數(shù)設(shè)置如下：噴嘴直徑0.5mm，進口溫度110℃、氣流速度0.7m³·min^-1、霧化壓力200kpa。使用霧化或粉末噴劑時，每日吸入0.01-2ug/kg體重/日雷公藤甲素當量的藥物，每日三次。

實施例3：

口服液：首先將雷公藤甲素粉末溶于乙醇中成為100μm(36000μg/l)溶液，加熱混勻至完全溶解，緩慢加入5倍體積的水，水溫保持80℃，加入適量的甜蜜素和防腐劑，混勻后，冷卻靜置24小時后抽濾去除乙醇至濃度小于0.5％(v/v)，在這個過程中逐步添加80℃溫水補充損失的體積，分裝成10ml帶刻度玻璃瓶中，每瓶含雷公藤甲素60ug，0.22um濾膜過濾滅菌，無菌封口。按0.5-10μg/kg/日的量分三次服用。

實施例4：

注射液：首先將雷公藤甲素粉末溶于乙醇中成為100μm(36000μg/l)溶液，加熱混勻至完全溶解，緩慢加入17倍體積的水，水溫保持80℃，冷卻靜置24小時后抽濾去除乙醇至濃度小于0.5％(v/v)，在這個過程中逐步添加80℃溫水補充損失的體積，分裝成2ml玻璃瓶中，每瓶含雷公藤甲素20ug，0.22um濾膜過濾滅菌，無菌封口。按0.1-3μg/kg/日的量分三次使用。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。