本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種恢復(fù)抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落的方法。

背景技術(shù)：

抗生素是牧場(chǎng)治療或預(yù)防病原菌感染的常用藥品。由于抗生素能夠直接快速的殺滅病原菌，達(dá)到預(yù)防和治療致病微生物引起的相關(guān)疾病的目的，而且工業(yè)生產(chǎn)的抗生素價(jià)格低廉，作為奶牛疾病治療和預(yù)防的常備藥物而被廣泛應(yīng)用。

然而，越來越多的證據(jù)表明，無論抗生素的使用是否規(guī)范，都從兩方面威脅著人類和動(dòng)物的健康：1、抗生素的使用導(dǎo)致胃腸道微生物群落紊亂，對(duì)動(dòng)物免疫調(diào)節(jié)、抗感染能力、食物消化吸收能力等產(chǎn)生不利影響；2、抗生素作為脅迫因子，會(huì)促進(jìn)耐藥細(xì)菌的不斷進(jìn)化，從而導(dǎo)致耐藥微生物激增，降低了抗生素治療人類和動(dòng)物的致病菌感染的效果。2015年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，歐洲和美國(guó)當(dāng)年因感染耐藥病原菌導(dǎo)致的死亡人數(shù)為5萬人，預(yù)計(jì)到2050年，這一數(shù)字可增加至1000萬。而我國(guó)是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國(guó)和使用國(guó)，2007年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)抗生素年產(chǎn)量為21萬噸，其中46.1％應(yīng)用于畜牧業(yè)，畜產(chǎn)品中抗生素殘留及其累積攜帶的耐藥微生物可通過食物鏈傳遞給人類，因此，抗生素的使用也正面臨著巨大的挑戰(zhàn)。人們?cè)诓粩嗉涌扉_發(fā)新型抗生素或抗生素的替代物，但現(xiàn)階段抗生素的使用仍然具有不可替代性。因此，抗生素的使用不僅僅是保留或禁止的單項(xiàng)選擇，本技術(shù)方案提供了一種降低或消除抗生素對(duì)奶牛瘤胃微生物群落危害的方法。

微生物紊亂后難以恢復(fù)是抗生素使用的另一個(gè)潛在危害。在人和小鼠上的研究均表明，抗生素導(dǎo)致的腸道微生物群落紊亂在數(shù)月乃至數(shù)年后仍不能恢復(fù)，從而長(zhǎng)期影響了動(dòng)物的代謝和健康。奶牛的營(yíng)養(yǎng)消化高度依賴于健康的瘤胃微生物群落，抗生素的使用也導(dǎo)致了奶牛瘤胃微生物群落的長(zhǎng)期紊亂，降低了奶牛生產(chǎn)性能和健康水平。目前，還未有通過瘤胃微生物群落移植技術(shù)促進(jìn)抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落恢復(fù)的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)空白，本發(fā)明的目的是提供一種通過瘤胃微生物群落移植技術(shù)促進(jìn)抗生素使用后奶牛瘤胃微生物群落恢復(fù)的方法。

為了實(shí)現(xiàn)如上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種快速恢復(fù)抗生素使用后牛瘤胃微生物群落的方法，主要步驟包括：(1)獲得健康奶牛瘤胃菌群；(2)添加厭氧菌保護(hù)劑保護(hù)菌群；(3)移植給抗生素使用后的奶牛，達(dá)到快速恢復(fù)因抗生素而導(dǎo)致紊亂的瘤胃微生物群落的目的。

作為優(yōu)選，步驟(1)的健康奶牛選取健康成年奶牛，近3個(gè)月未有疾病記錄或使用抗生素，其所采食的日糧成分與受體奶牛保持一致。

作為優(yōu)選，步驟(1)的瘤胃菌群液獲取通過分離奶牛瘤胃菌群液獲得，主要為兩種途徑：a，使用真空抽吸瘤胃菌群液采集器，通過奶牛口腔采集瘤胃菌群液；b，使用健康瘺管牛，從瘺管處用真空抽吸瘤胃菌群液采集器進(jìn)行采集或人工手動(dòng)采集。所獲得瘤胃菌群液均需通過2層醫(yī)用紗布(孔徑為0.15mm)過濾去除食糜顆粒。

作為優(yōu)選，步驟(1)所獲得瘤胃菌群液通過帶蓋的水桶或密封塑料袋盛放。

作為優(yōu)選，步驟(1)獲得健康牛的瘤胃菌群液以后，使用ph計(jì)測(cè)定ph，ph為6.2～7范圍內(nèi)最佳，若ph<5.5，則瘤胃菌群液不能作為供體瘤胃菌群液使用。通過顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行瘤胃菌群液微生物濃度檢測(cè)，達(dá)到1*10⁸以上，為質(zhì)量合格的供體瘤胃菌群液。

作為優(yōu)選，步驟(2)厭氧菌保護(hù)劑成分為葡萄糖和巰基乙酸鈉，二者的質(zhì)量比為10:1。使用時(shí)，將厭氧菌保護(hù)劑預(yù)先溶解在37攝氏度清水中得到厭氧菌保護(hù)劑溶液，使葡萄糖的濃度為10g/l，巰基乙酸鈉的濃度為1g/l，現(xiàn)配現(xiàn)用。

作為優(yōu)選，步驟(2)在獲得瘤胃菌群液后及時(shí)加入?yún)捬蹙Ｗo(hù)劑溶液并輕柔攪拌，使其均勻分布在瘤胃菌群液中，厭氧菌保護(hù)劑溶液與瘤胃菌群液比例為1:9。

作為優(yōu)選，步驟(3)中瘤胃菌群受體奶牛為因抗生素使用而導(dǎo)致瘤胃微生物群落紊亂的奶牛。移植時(shí)機(jī)為距離最后一次抗生素使用后的12-24h。

作為優(yōu)選，步驟(3)移植給受體奶牛的方法為使用牛用口腔灌服器，將處理后的瘤胃菌群液泵入受體奶牛瘤胃。

作為優(yōu)選，步驟(3)每頭受體奶牛的移植量為5-15l。

作為優(yōu)選，步驟(3)每頭受體奶牛可以采用一次或多次灌注，如多次灌注，灌注間隔建議24h。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明通過使用健康瘤胃微生物群落移植的方法，能夠快速恢復(fù)經(jīng)過抗生素使用導(dǎo)致瘤胃微生物群落紊亂的牛的瘤胃微生物群落，紊亂微生物群落的恢復(fù)保證了奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化的正常進(jìn)行，同時(shí)也可抵御條件致病菌的入侵定植，必要時(shí)，可達(dá)到疾病防治的目的。

不僅如此，本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)便，直接使用瘤胃菌群液進(jìn)行菌群移植，減少了瘤胃菌群離心分離等繁瑣步驟，也更大限度的保障了菌群的活性。并且通過厭氧菌保護(hù)劑的添加保護(hù)了瘤胃菌群的活性，不再需要體外培養(yǎng)和富集步驟，避免了體外培養(yǎng)導(dǎo)致的瘤胃菌群丟失；最后，簡(jiǎn)明的操作步驟在牧場(chǎng)實(shí)踐中基本實(shí)現(xiàn)了瘤胃菌群的現(xiàn)采現(xiàn)用，并通過簡(jiǎn)單的保護(hù)劑添加保證了使用效果。因此，本發(fā)明所述的方法可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域、微生物技術(shù)領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的瘤胃菌群液移植后瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)變化示意圖。其中，小號(hào)圖標(biāo)代表每每頭牛在不同時(shí)間點(diǎn)上的樣品；大號(hào)圖標(biāo)代表每個(gè)組的均值；實(shí)線箭頭，對(duì)照組瘤胃微生物群落變化；虛線箭頭，瘤胃菌群液移植組微生物群落變化。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中的瘤胃菌群液移植后瘤胃微生物豐富度和多樣性示意圖。其中，使用豐富度指數(shù)來評(píng)價(jià)瘤胃微生物群落的物種種類豐富性，數(shù)值越大，表明該處理組的奶牛瘤胃微生物種類越多，數(shù)值越小，表明該處理組的奶牛瘤胃微生物種類越少；使用多樣性指數(shù)評(píng)價(jià)奶牛瘤胃中微生物微生物群落的多樣性，不僅考慮了群落豐富度，也加權(quán)了物種豐度信息。使用kruskal-wallis法進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，進(jìn)行組間比較。多樣性指數(shù)值越大，表明群落多樣性越高；指數(shù)值越小，表明群落多樣性越低。*p<0.1；**p<0.05；***p<0.01。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中的瘤胃菌群液移植后組內(nèi)瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性示意圖。其中，使用組內(nèi)β多樣性評(píng)價(jià)不同處理組微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使用kruskal-wallis法法進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，進(jìn)行組間比較。β多樣性值越接近于1，說明組內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，值越接近于0，說明組內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。*p<0.1；**p<0.05；***p<0.01。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

具體實(shí)施方式

1、試驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件

選取10頭年齡、體況相近健康奶牛作為試驗(yàn)動(dòng)物，5頭瘤胃瘺管牛作為供體牛(本試驗(yàn)基地已具備)，飼養(yǎng)場(chǎng)群體飼養(yǎng)，給予相同日糧，自由采食，自由飲水。

2、試驗(yàn)處理和樣品采集

(1)試驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建。每頭試驗(yàn)牛均按照治療劑量每次青霉素(800萬單位)和鏈霉素(500萬單位)進(jìn)行肌肉注射，早晚各進(jìn)行一次注射，連續(xù)注射14天。

(2)瘤胃菌群液獲取。瘤胃菌群液通過瘤胃瘺管從供體奶牛獲得，經(jīng)2層醫(yī)用紗布(孔徑0.15mm)過濾，取過濾液于帶蓋水桶中，取5ml瘤胃菌群液進(jìn)行ph值測(cè)定和顯微鏡計(jì)數(shù)，確認(rèn)瘤胃菌群液符合質(zhì)量要求。

(3)瘤胃菌群液保存。厭氧菌保護(hù)劑成分為為10g葡萄糖和1g巰基乙酸鈉，厭氧菌保護(hù)劑預(yù)先溶解在1l的37攝氏度清水中，得到厭氧保護(hù)劑溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。瘤胃菌群液取樣后，及時(shí)將厭氧菌保護(hù)劑溶液注入裝有瘤胃菌群液的水桶中，配置好的厭氧保護(hù)劑溶液與瘤胃菌群液比例按1:9比例混合，并輕柔攪拌，使其均勻分布在瘤胃菌群液中，然后及時(shí)密封水桶。

(4)瘤胃菌群移植。接受抗生素的試驗(yàn)?zāi)膛Ｔ谕瓿赡Ｐ蜆?gòu)建后被隨機(jī)分成2組，分別為對(duì)照組和瘤胃菌群液移植組。抗生素停用24小時(shí)后，對(duì)照組通過口腔插管法灌注10l清水；試驗(yàn)組通過口腔插管法灌注健康供體牛瘤胃菌群液，移植量為10l/頭，每天一次，每次間隔24小時(shí)，連續(xù)移植3天。

(5)樣品采集。在抗生素注射后第14天晨飼前采集瘤胃菌群液樣品，并采集對(duì)照組和移植組停用抗生素后4、11和18天(即移植后1、8和15天)的瘤胃菌群液，液氮保存，并盡快轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中。

3、樣品測(cè)定

瘤胃菌群液經(jīng)過dna提取和pcr擴(kuò)增等處理后，以16srdna的v3-v4區(qū)于illuminamiseq高通量平臺(tái)上測(cè)序，進(jìn)行微生物區(qū)系分析。

4、試驗(yàn)結(jié)果

使用微生物群落結(jié)構(gòu)pcoa分析描述抗生素使用后瘤胃微生物群落的恢復(fù)過程，對(duì)比不做處理的對(duì)照組，移植瘤胃菌群液以后，微生物群落在11天已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定，而對(duì)照組在18天后仍然沒有恢復(fù)到穩(wěn)定水平。圖1所示，在抗生素注射后第4天，對(duì)照組和瘤胃菌群液移植組的微生物群落顯著不同(p<0.01)；移植組第18天的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)于第11天沒有明顯差異，所以瘤胃菌群液移植組在第11天時(shí)，瘤胃微生物群落已經(jīng)達(dá)到了穩(wěn)定水平；對(duì)照組的瘤胃微生物，在第11天和第4天的群落結(jié)構(gòu)差異顯著(p<0.01)，第18天和第11天的群落結(jié)構(gòu)差異顯著(p<0.01)，對(duì)照組在18天內(nèi)，瘤胃微生物群落一直處于恢復(fù)過程中。因此，瘤胃菌群液移植對(duì)于奶牛抗生素使用后瘤胃微生物群落的快速恢復(fù)具有顯著效果。

通過微生物群落豐富度(richness)和多樣性(diversity)指標(biāo)來評(píng)估移植組和對(duì)照組瘤胃微生物在抗生素使用后的變化過程，結(jié)果表明瘤胃微生物群落移植促進(jìn)了瘤胃微生物群落豐富度和多樣性恢復(fù)。圖2所示，瘤胃菌群液移植組在4天、11天和18天的微生物群落豐富度均顯著高于抗生素使用后，而對(duì)照組在4天、11天和18天的豐富度與抗生素使用后沒有顯著差異。結(jié)果表明，瘤胃菌群液移植后，使得瘤胃微生物的豐富度快速上升并穩(wěn)定保持；對(duì)照組在18天內(nèi)微生物豐富度仍沒有發(fā)生顯著上升。試驗(yàn)組的微生物群落多樣性在第4天和第18天也顯著高于抗生素使用后，而對(duì)照組在18天內(nèi)，與抗生素使用后相比，微生物多樣性沒有顯著提升。因此，在奶牛經(jīng)過抗生素使用后，采用本發(fā)明中瘤胃菌群液移植的方法，能夠快速的提高瘤胃微生物群落的豐富度和多樣性，并在群落恢復(fù)后保持穩(wěn)定。

通過組內(nèi)β多樣性來評(píng)價(jià)不同時(shí)期微生物群落的穩(wěn)定性，結(jié)果表明瘤胃微生物群落移植可快速恢復(fù)瘤胃微生物群落穩(wěn)定性。圖3所示，抗生素使用后，瘤胃微生物群落穩(wěn)定性最低，對(duì)照組在自然恢復(fù)情況下穩(wěn)定性需要18天才顯著提高，而移植組在經(jīng)過瘤胃菌群液移植后，微生物群落穩(wěn)定性在第4、11和18天，均顯著高于抗生素使用后。因此，使用本發(fā)明中瘤胃菌群液移植的方法，可以快速提高抗生素使用后瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

以上試驗(yàn)結(jié)果表明：使用瘤胃菌群液移植的方法，能夠快速恢復(fù)瘤胃微生物群落，并顯著增加微生物群落的豐富度和多樣性，顯著提高群落穩(wěn)定性。因此，通過瘤胃菌群液移植的處理，可以顯著降低或消除抗生素對(duì)瘤胃微生物群落的破壞，快速有效的恢復(fù)微生物群落的健康，降低因抗生素使用對(duì)人類和動(dòng)物帶來的危害。