本發(fā)明屬于復合生物材料制備領域，具體涉及一種vegf轉染殼聚糖組織修復材料的制備方法。
背景技術：
生物材料發(fā)展至今已經經歷了三個主要階段。自20世紀80年代以來，以醫(yī)療、保健及增進生活質量等為目的的生物醫(yī)用材料取得了快速的發(fā)展，已經有超過50種植入器械被應用于臨床，一般來源于技術成熟的工程材料，并且具有生物相容性和缺損組織替代功能，例如已廣泛應用于臨床的心人工血管、人工關節(jié)和人工腎等。上述生物醫(yī)用材料，具有一個普遍的共性:生物惰性。即生物醫(yī)用材料發(fā)展所遵循的原則是盡量將受體對植入器械的異物反應降到最低。從上世紀80年代到90年代，生物醫(yī)用材料領域的重點逐漸由生物惰性轉向生物活性和可控降解性，開發(fā)了第二代生物醫(yī)用材料及產品。
20世紀90年代后期，第三代生物材料是伴隨著組織工程學的建立、發(fā)展而迅速發(fā)展起來的。以組織工程生物材料支架為代表，其綜合了工程科學和生命科學原理，為種子細胞提供了適合其生長、基質合成及發(fā)揮其他功能的生物學空間，克服了以往單一的細胞移植中細胞不易成活、基質合成能力低下等缺點，為組織工程化組織的構建提供了細胞載體和結構支架。這類生物醫(yī)用材料將生物活性材料與可降解材料這兩個獨立的概念結合起來，在可降解材料上進行分子修飾，引起細胞整合素的相互作用，誘導細胞增殖、分化，以及細胞外基質的合成與組裝。但目前所應用于組織工程的生物材料的性能還有待進一步提高，不能滿足現(xiàn)代醫(yī)藥的需求。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種vegf轉染殼聚糖組織修復材料的制備方法，進一步提高了組織修復材料的細胞粘附性及生物活性。
本發(fā)明采用以下技術方案：
一種vegf轉染殼聚糖組織修復材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：將1mllb液體培養(yǎng)基和20μl、10％v/v葡萄糖置于離心管中，將1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到離心管中，置于30℃，120-260rpm/min，震蕩培養(yǎng)過夜，得vegf懸液；
步驟二：將350mg明膠溶解于60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解制得明膠溶液；
步驟三：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二酰亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恒溫水槽中40℃攪拌48小時后，將溶液置于透析袋中，放入盛有超純水的燒杯中，并置于電熱恒溫水槽于40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟四：取出透析袋中殘留的溶液，置于-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置于凍干機上干燥48h，得粘附性明膠；
步驟五：將粘附性明膠制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調節(jié)水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟六：稱取0.2g殼聚糖，溶于40ml去離子水中，配制質量體積比為20％的殼聚糖溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體及0.5ml冰醋酸，調節(jié)ph至5.0混合攪拌均勻得殼聚糖溶液；
步驟七：稱取8g明膠，溶于40m1去離子水中，充分振蕩后將溶液置于50℃水浴箱，待溶解后轉入培養(yǎng)皿中，放入4℃冰箱，凝固后得固體凝膠；
步驟八：將殼聚糖溶液加入固體凝膠表面，浸泡5-7分鐘，然后移出殼聚糖溶液，再加入清水浸泡1分鐘，每浸泡一次殼聚糖溶液為1層，共做15層；將固體凝膠取出，放入裝有37℃水的容器中，隨著明膠基底逐漸熔化，其表面有薄膜析出，即得殼聚糖納米膜；
步驟九：將多巴胺修飾溶液均勻噴涂于殼聚糖納米膜表面，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸鹽緩沖液(pbs)漂洗3次；
步驟十：將殼聚糖納米膜浸泡于vegf懸液中48h得vegf轉染殼聚糖組織修復材料。
步驟一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化學研究所伊藤ナノ醫(yī)工學研究室提供。
優(yōu)選的，步驟三中所述的透析袋殘留分子量為10000da。
優(yōu)選的，所述的步驟三中超純水用量為漫過透析袋。
優(yōu)選的，步驟九中噴涂的厚度為5-30nm。
本發(fā)明的有益效果在于：
1)多巴胺是神經激素中的一種化合物，含有豐富的乙氨基和兒茶酚活性官能團，幾乎能粘附在任何機體的表面，尤其對于有機表面效果更佳。多巴胺修飾后的明膠的黏附性較高，且在材料表面上形成了聚合的多巴胺-明膠層。多巴胺的修飾，不僅提高了固定的明膠的含量，同時促進了細胞的粘附，加強了材料表面的細胞相容性。
2)明膠分子結構上含有大量的羥基及少量的羧基和氨基，具有極強的親水性。因此，明膠分子中的羧基可以與多巴胺的氨基發(fā)生縮合反應。明膠具有其他合成材料無法比擬的生物相容性、可降解性以及生物活性。
3)vegf又稱血管通透性生長因子是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強的促血管生成細胞生長因子，明膠可以和生長因子相互作用而結合在一起，可以有效提高組織修復材料上生長因子的數(shù)量。
4)殼聚糖具有很好的生物降解性能，同時也具有良好的生物可吸收性和生物相容性，被視為細胞支架材料并廣泛運用在組織工程領域。殼聚糖是一種來源于海洋蟹類生物的天然多糖，無毒性而且有其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等均具有一定的抗菌效果。對細胞的粘附、遷移有促進作用。
具體實施方式
以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
實施例1
一種vegf轉染殼聚糖組織修復材料的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：將1mllb液體培養(yǎng)基和20μl、10％v/v葡萄糖置于離心管中，將1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到離心管中，置于30℃，120-260rpm/min，震蕩培養(yǎng)過夜，得vegf懸液；
步驟二：將350mg明膠溶解于60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解制得明膠溶液；
步驟三：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二酰亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恒溫水槽中40℃攪拌48小時后，將溶液置于透析袋中，透析袋殘留分子量為10000da，將透析袋放入盛有超純水的燒杯中，超純水用量為漫過透析袋的位置，并將燒杯置于電熱恒溫水槽于40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟四：取出透析袋中殘留的溶液，置于-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置于凍干機上干燥48h，得粘附性明膠；
步驟五：將粘附性明膠制成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調節(jié)水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟六：稱取0.2g殼聚糖，溶于40ml去離子水中，配制質量體積比為20％的殼聚糖溶液，另加入0.32g氯化鈉晶體及0.5ml冰醋酸，調節(jié)ph至5.0混合攪拌均勻得殼聚糖溶液；
步驟七：稱取8g明膠，溶于40m1去離子水中，充分振蕩后將溶液置于50℃水浴箱，待溶解后轉入培養(yǎng)皿中，放入4℃冰箱，凝固后得固體凝膠；
步驟八：將殼聚糖溶液加入固體凝膠表面，浸泡5-7分鐘，然后移出殼聚糖溶液，再加入清水浸泡1分鐘，每浸泡一次殼聚糖溶液為1層，共做15層；將固體凝膠取出，放入裝有37℃水的容器中，隨著明膠基底逐漸熔化，其表面有薄膜析出，即得殼聚糖納米膜；
步驟九：將多巴胺修飾溶液均勻噴涂于殼聚糖納米膜表面，噴涂的厚度為5-30nm，并于37℃干燥箱干燥12h后，用磷酸鹽緩沖液(pbs)漂洗3次；
步驟十：將殼聚糖納米膜浸泡于vegf懸液中48h得vegf轉染殼聚糖組織修復材料。
步驟一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化學研究所伊藤ナノ醫(yī)工學研究室提供。
細胞粘附實驗：取培養(yǎng)的huvec細胞，消化，細胞計數(shù)，以5×103cell/ml密度接種在實施例1制得的組織修復材料及空白對照組殼聚糖材料上，每孔1ml，接種0.5h、1h、2h后，用無菌的pbs溶液漂洗，鏡下觀察并照相計數(shù)，結果見下表1?？梢钥闯鼋涍^多巴胺修飾后的殼聚糖組織修復材料所粘附的細胞數(shù)量明顯多于沒有經過修飾的空白對照組的細胞數(shù)量。
表1
細胞增殖實驗：取培養(yǎng)的huvec細胞，消化，細胞計數(shù)，以5×103cell/ml密度接種在實施例1制得的組織修復材料及空白對照組殼聚糖材料上，每孔1ml，隔兩天換液，接種5day后，細胞計數(shù)試劑盒wst-8檢測材料表面的細胞活性，結果見表2，可以得出經過多巴胺修飾后的殼聚糖組織修復材料的細胞活性略高于空白實驗組的細胞活性。
表2