本發(fā)明屬于熒光金納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于神經(jīng)逆向示蹤的ctb-aunds復(fù)合物、制備方法及其在神經(jīng)逆向示蹤方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

金屬納米點(nds)作為一種尺寸接近于費米波長的粒子而展現(xiàn)出的新穎光學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)等性質(zhì)，成為已報道的眾多熒光納米材料中不可或缺的組成部分(chem.soc.rev.，2012，41，3594-3623)。其中熒光au納米點可調(diào)的熒光、良好的生物相容性，特別是優(yōu)異的熒光穩(wěn)定性，使其可以廣泛應(yīng)用于諸如生物傳感、癌癥治療、生物體成像等生物醫(yī)藥領(lǐng)域(small.，2013，9，413-420)。

神經(jīng)系統(tǒng)在人體生命活動中起著主導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)示蹤技術(shù)是神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)再生研究中最常用的方法之一，與其他已報道的檢測手段相比，該方法可更直觀地檢測出神經(jīng)損傷部位，準(zhǔn)確地反應(yīng)神經(jīng)再生水平和神經(jīng)功能恢復(fù)的程度。由于傳統(tǒng)神經(jīng)示蹤劑合成過程復(fù)雜、檢測耗時長、熒光信號弱以及熒光穩(wěn)定性低等原因，限制了其在臨床診斷中的應(yīng)用(science，1972，176，1416-1417)。所以急需開發(fā)一種合成過程簡單、檢測耗時短、熒光量子效率高且穩(wěn)定性強的新型神經(jīng)示蹤劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于神經(jīng)逆向示蹤的ctb-aunds復(fù)合物、制備方法及其在神經(jīng)逆向示蹤方面的應(yīng)用。本發(fā)明首先制備用于神經(jīng)逆向示蹤的紅色熒光金納米點具有高熒光效率，高穩(wěn)定性和低毒性；進一步將紅色熒光au納米點與無細胞毒性的霍亂毒素b亞基(ctb)相連接，形成ctb-aunds復(fù)合物。將這種復(fù)合物注射入大鼠的坐骨神經(jīng)處，其能夠靶向性地與神經(jīng)細胞的細胞膜發(fā)生特異性結(jié)合，并沿著細胞膜逆向傳輸，并且金納米點的熒光性質(zhì)可在大鼠體內(nèi)神經(jīng)部位長時間保持。這種兼具高穩(wěn)定性、特異性結(jié)合細胞膜的ctb-aunds，可以作為一種逆向神經(jīng)示蹤劑，用于示蹤神經(jīng)細胞。

制備的熒光au納米點粒徑均勻且尺寸小于3nm(圖1)，具有良好的紅色熒光(圖2)。將熒光au納米點與ctb相連，形成ctb-aunds復(fù)合物。將其注射入大鼠背根神經(jīng)節(jié)后，該ctb-aunds復(fù)合物可以沿著大鼠背根神經(jīng)節(jié)逆向傳輸，最后到達脊髓部位(圖3)。這種兼具有熒光效率高、熒光穩(wěn)定性好的ctb-aunds可以作為一種逆行傳輸?shù)臒晒馍窠?jīng)示蹤劑應(yīng)用于神經(jīng)示蹤領(lǐng)域。

本發(fā)明所述的一種用于神經(jīng)逆向示蹤的紅色熒光金納米點的制備方法，其步驟如下所述：

1)在濃度為0.1～500mmol/l(優(yōu)選為0.1～100mmol/l，進一步優(yōu)選為10～100mmol/l)的含有巰基的水溶性化合物(可以是谷胱甘肽，含巰基的氨基酸，含巰基的蛋白等)作穩(wěn)定劑的水溶液中，加入與含有巰基的水溶性化合物等摩爾的ag⁺離子溶液(可以是agno3、ch3cooag、agf、ag2so4、agclo4等的水溶液)，常溫攪拌10～30min后，加入1mol/lnaoh溶液，調(diào)節(jié)ph至5～8(優(yōu)選為6～7)，至溶液無色透明；再向上述溶液中加入水合肼作為還原劑，水合肼(n2h4·h2o)與ag⁺離子的摩爾比為1～10：1；然后在常溫下攪拌12h～48h(優(yōu)選為24h～48h，進一步優(yōu)選為36h～48h)，反應(yīng)結(jié)束后，向溶液中加入異丙醇(其體積為溶液體積的2～20倍)作為沉淀劑，沉淀離心后得到的固體產(chǎn)物即為ag納米點，將ag納米點分散在水溶液中(總體積為1～50ml)，備用；

2)應(yīng)用電化學(xué)交換反應(yīng)，以銀納米點為模板，用金離子刻蝕銀納米點，形成金納米點：在濃度為10～500mmol/l(優(yōu)選為50～500mmol/l，進一步優(yōu)選為50～100mol/l)的ag納米點水溶液中加入濃度為10～500mmol/l(優(yōu)選為50～500mmol/l，進一步優(yōu)選為50～100mmol/l)的含有au³⁺的溶液(可以是haucl4，aucl3等的水溶液)，ag⁺與au³⁺的摩爾比為1～2：1，加入1mol/lnaoh溶液，調(diào)節(jié)ph至5～11(優(yōu)選為6～10，進一步優(yōu)選為8～10)，然后在60～100℃下攪拌2～8小時(優(yōu)選為2～6小時，進一步優(yōu)選為2～4小時)，反應(yīng)結(jié)束后離心，向清液中加入異丙醇(其體積為溶液體積的2～10倍)作為沉淀劑，沉淀離心后得到的固體產(chǎn)物即為紅色熒光au納米點，將紅色熒光au納米點分散在水溶液中(總體積為1～20ml)，備用；

3)將步驟2)得到的具有高穩(wěn)定性、高熒光效率的紅色熒光au納米點與能夠特異性結(jié)合神經(jīng)細胞的靶向試劑相連接，制備出一種ctb-aunds復(fù)合物，即能夠特異性結(jié)合神經(jīng)細胞的神經(jīng)示蹤劑：將神經(jīng)靶向試劑霍亂毒素b亞基(ctb)粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta(乙二胺四乙酸)的tris緩沖溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其濃度達到0.1～100mg/ml(優(yōu)選為0.1～10mg/ml，進一步優(yōu)選為1～10mg/ml)；在4℃環(huán)境下，將上述溶液用3500分子量的滲析袋滲析3～5天，以除去溶液中的金屬離子；在濃度為0.01～100mg/ml(優(yōu)選為0.01～10mg/ml，進一步優(yōu)選為0.1～1mg/ml)的au納米點的水溶液中加入濃度為0.1～10mg/ml(優(yōu)選為0.1～5mg/ml，進一步優(yōu)選為0.1～1mg/ml)edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)的tris溶液，au³⁺與edc的摩爾比為10～100：1，以及濃度為0.1～10mg/ml(優(yōu)選為0.1～5mg/ml，進一步優(yōu)選為0.1～1mg/ml)nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)的tris溶液，au³⁺與nhs的摩爾比為10～100：1，攪拌30～50min；最后加入上述含有神經(jīng)靶向試劑的溶液，神經(jīng)靶向試劑霍亂毒素b亞基(ctb)與au納米點的質(zhì)量比為0.05～50：1(優(yōu)選為0.5～20：1，進一步優(yōu)選為1～10：1)，在搖床上室溫反應(yīng)4h～24h(優(yōu)選為4h～12h，進一步優(yōu)選為8h～12h)；將所得產(chǎn)物用3500分子量的滲析袋在4℃下滲析5～10天，以除去體系中的小分子；將滲析后的溶液凍干，并分散于tris緩沖液(1～10ml)中，得到ctb-aunds復(fù)合物，即能夠特異性結(jié)合神經(jīng)細胞的神經(jīng)示蹤劑。

一種用于神經(jīng)逆向示蹤的ctb-aunds復(fù)合物，其是由上述方法制備得到。

本發(fā)明所制備的ctb-aunds復(fù)合物用于靶向示蹤神經(jīng)細胞功能具有以下優(yōu)點：ctb-aunds復(fù)合物產(chǎn)物熒光效率高，穩(wěn)定性優(yōu)良，表現(xiàn)出良好的光學(xué)性質(zhì)和水溶性，特別是具有靶向神經(jīng)的功能。將之注射入大鼠的背根神經(jīng)節(jié)，可沿著神經(jīng)逆向傳輸至脊髓處，其具有紅色熒光(發(fā)射波長為607nm)，避免了肌體自發(fā)熒光的干擾，生物毒性低，生物相容性好。另外這種制備方法易于操作，條件溫和，重復(fù)性好，適合大量生產(chǎn)。

附圖說明

圖1：實施例1所制備的熒光au納米點tem圖，其平均粒徑尺寸為2.5nm左右，圖1中插圖為au納米點的高分辨透射電鏡照片，顯示au納米點的晶格間距為

圖2：實施例1所制備的熒光au納米點的熒光光譜圖，光譜表明au納米點的最佳激發(fā)波長為415nm，最佳發(fā)射波長為604nm，圖2中插圖為光學(xué)照片，顯示au納米點的水溶液為淡黃色，且在水中分散性較好，在紫外燈照射下，顯示明亮的紅色熒光；

圖3：實施例3所得到的ctb-aunds注射前后組織切片照片，圖3a是未注射ctb-aunds的背根神經(jīng)節(jié)切片，從圖中只能看到肌體的自發(fā)藍色熒光。圖3b是在大鼠的背根神經(jīng)節(jié)處注射ctb-aunds的切片，從圖中可以看到整個背根神經(jīng)節(jié)各處都顯示ctb-aunds的明亮紅色熒光。圖3c是注射ctb-aunds五天后，大鼠脊髓的組織切片，從圖中可以清晰看到脊髓中分散著ctb-aunds的點狀紅色熒光。說明ctb-aunds可以特異性靶向神經(jīng)細胞，且可以從注射點即背根神經(jīng)節(jié)，逆向傳輸至大鼠脊髓處。

具體實施方式

實施例1

熒光au納米點的制備：在制備紅色熒光au納米點之前，首先制備ag納米點為模板，具體步驟為：稱取0.1535g的谷胱甘肽和0.0845g的agno3溶解于10ml水中，攪拌10min后，向體系中逐滴加入濃度為1m的naoh，調(diào)節(jié)溶液ph為6.5，此時整個體系為無色溶液。再向溶液中加入1mln2h4·h2o，在室溫下避光攪拌48h后，得到橙紅色溶液，證明ag納米點已經(jīng)產(chǎn)生。向溶液中加入50ml異丙醇作為沉淀劑，離心后得到的固體產(chǎn)物即為ag納米點，將沉淀分散于10ml水中，得到濃度約為50mm的ag納米點水溶液。

向裝有5ml水的燒瓶中加入500μl上述合成的ag納米點水溶液(50mm)，再加入250μlhaucl4溶液(50mm)(au與ag的摩爾用量比為1：2)，向燒瓶中逐滴加入1m的naoh溶液，至ph為9，然后在80℃及加熱條件下攪拌4h，溶液中出現(xiàn)agcl黑色沉淀。將整個溶液在8000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min除去沉淀，然后向清液中加入30ml異丙醇作為沉淀劑，離心后得到的固體產(chǎn)物即為au納米點，將沉淀分散于5ml水中，即得到濃度約為2mm的紅色熒光au納米點水溶液。熒光au納米點的粒徑尺寸為2.5nm左右。

實施例2

ctb-aunds復(fù)合物的制備：將ctb粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta的tris緩沖溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其濃度達到1mg/ml。在4℃環(huán)境下，將上述溶液用3500分子量的滲析袋滲析3天，以除去溶液中的金屬離子后，待用。量取5ml已制備好的紅色熒光au納米點水溶液(0.5mg/ml)加入20ml的燒瓶中，然后依次加入2ml含有3.1mg/mledc的tris溶液、2ml含有2.4mg/mlnhs的tris溶液，攪拌30min。將2ml的1mg/ml的ctb溶液加入燒瓶中后，將燒瓶置于搖床上，室溫反應(yīng)8h。將所得產(chǎn)物用3500分子量的滲析袋在4℃下滲析7天，以除去體系中的小分子。將滲析后的溶液凍干(約為50mg)，并分散于tris緩沖液中，使其濃度為10mg/ml，得到ctb-aunds復(fù)合物溶液，即能夠特異性結(jié)合神經(jīng)細胞的神經(jīng)示蹤劑。

實施例3

組織切片的制備及熒光成像。在對大鼠注射ctb-aunds復(fù)合物溶液5天后，以質(zhì)量分數(shù)為10％的水合三氯乙醛將大鼠深度麻醉，然后通過其左心室依次靜脈注射含有質(zhì)量分數(shù)為0.9％的生理鹽水和質(zhì)量分數(shù)為4％的多聚甲醛。小心地切開大鼠腰背部，取出雙側(cè)l4和l5背根神經(jīng)節(jié)以及脊髓腰椎節(jié)段，以固定劑處理3h，儲存在含有質(zhì)量分數(shù)為30％蔗糖的pbs緩沖液(ph＝7.4)中脫水過夜。以冰凍切片機分別切取厚度為15μm的l4和l5背根神經(jīng)節(jié)縱向切片、20μm的腰髓縱向切片和30μm的橫向切片。將制備好的組織切片置于熒光顯微鏡下，分別以4×、10×和20×的放大倍數(shù)觀察，整個過程在避光條件下操作。

實施例4

熒光au納米點的制備：在制備au納米點之前，首先制備ag納米點為模板，具體步驟為：稱取0.1688g的谷胱甘肽和0.103g的agclo4溶解于10ml水中，攪拌10min后，向體系中逐滴加入濃度為1m的naoh，調(diào)節(jié)溶液ph為7，此時整個體系為無色溶液。再向溶液中加入1mln2h4·h2o，在室溫下避光攪拌36h后，得到橙紅色溶液，證明ag納米點已經(jīng)產(chǎn)生。向溶液中加入50ml異丙醇作為沉淀劑，離心后得到的固體產(chǎn)物即為ag納米點，將沉淀分散于10ml水中，得到濃度約為50mm的ag納米點溶液。

向裝有5ml水的燒瓶中加入500μl上述合成的ag納米點溶液(50mm)，再加入250μlhaucl4溶液(50mm)(au與ag的摩爾用量比為1:2)，向燒瓶中逐滴加入1m的naoh溶液，至ph為7.5，然后在80℃及加熱條件下攪拌3h，溶液中出現(xiàn)agcl黑色沉淀。將整個溶液在8000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min除去沉淀，然后向清液中加入30ml異丙醇作為沉淀劑，離心后得到的固體產(chǎn)物即為au納米點，將沉淀分散于5ml水中，即得到濃度約為2mm的紅色熒光au納米點溶液。熒光au納米點的粒徑尺寸為2.1nm左右。

ctb-aunds復(fù)合物的制備：將ctb粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta的tris緩沖溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其濃度達到1mg/ml。在4℃環(huán)境下，將上述溶液用3500分子量的滲析袋滲析3天，以除去溶液中的金屬離子后，待用。量取5ml已制備好的紅色熒光au納米點(0.5mg/ml)加入20ml的燒瓶中，然后依次加入2ml含有0.6mg/mledc的tris溶液、2ml含有0.5mg/mlnhs的tris溶液，攪拌30min。將2ml的1mg/ml的ctb溶液加入燒瓶中后，將燒瓶置于搖床上，室溫反應(yīng)6h。將所得產(chǎn)物用3500分子量的滲析袋在4℃下滲析5天，以除去體系中的小分子。將滲析后的溶液凍干(約為50mg)，并分散于tris緩沖液中，使其濃度為10mg/ml，即可得到能夠特異性結(jié)合神經(jīng)細胞的神經(jīng)示蹤劑。

實施例5

熒光au納米點的制備：在制備au納米點之前，首先制備ag納米點為模板，具體步驟為：稱取0.0678g的半胱氨酸(含巰基的氨基酸)和0.0843g的agno3溶解于10ml水中，攪拌10min后，向體系中逐滴加入濃度為1m的naoh，調(diào)節(jié)溶液ph為7，此時整個體系為無色溶液。再向溶液中加入1mln2h4·h2o，在室溫下避光攪拌36h后，得到橙紅色溶液，證明ag納米點已經(jīng)產(chǎn)生。向溶液中加入50ml異丙醇作為沉淀劑，離心后得到的固體產(chǎn)物即為ag納米點，將沉淀分散于10ml水中，得到濃度約為50mm的ag納米點溶液。

向裝有5ml水的燒瓶中加入500μl上述合成的ag納米點溶液(50mm)，再加入250μlhaucl4溶液(50mm)(au與ag的摩爾用量比為1:2)，向燒瓶中逐滴加入1m的naoh溶液，至ph為7.5，然后在80℃及加熱條件下攪拌3h，溶液中出現(xiàn)agcl黑色沉淀。將整個溶液在8000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min除去沉淀，然后向清液中加入30ml異丙醇作為沉淀劑，離心后得到的固體產(chǎn)物即為au納米點，將沉淀分散于5ml水中，即得到濃度約為2mm的紅色熒光au納米點溶液。熒光au納米點的粒徑尺寸為2.3nm左右。

ctb-aunds復(fù)合物的制備：將ctb粉末溶解于含有0.2mnacl、3mmnan3、1mmedta的tris緩沖溶液(0.05m，ph＝7.5)中，使其濃度達到1mg/ml。在4℃環(huán)境下，將上述溶液用3500分子量的滲析袋滲析3天，以除去溶液中的金屬離子后，待用。量取4ml已制備好的紅色熒光au納米點(0.5mg/ml)加入20ml的燒瓶中，然后依次加入2ml含有0.6mg/mledc的tris溶液、2ml含有0.5mg/mlnhs的tris溶液，攪拌30min。將2.5ml的1mg/ml的ctb溶液加入燒瓶中后，將燒瓶置于搖床上，室溫反應(yīng)6h。將所得產(chǎn)物用3500分子量的滲析袋在4℃下滲析5天，以除去體系中的小分子。將滲析后的溶液凍干(約為50mg)，并分散于tris緩沖液中，使其濃度為8mg/ml，即可得到能夠特異性結(jié)合神經(jīng)細胞的神經(jīng)示蹤劑。