相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.119(e)要求于2009年4月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/171,705號(hào)和于2009年12月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/266,048號(hào)的權(quán)益，通過引用將兩篇專利申請(qǐng)全文并入本文。

關(guān)于序列表的聲明

以文本格式代替紙質(zhì)版提供本申請(qǐng)相關(guān)的序列表，并且在此通過引用并入本說明書。包含序列表的文本文件命名為480266_404pc_sequence_listing.txt。該文本文件為67kb，創(chuàng)建于2010年4月22日，并且在提交本說明書同時(shí)，通過efs-web以電子方式提交了該文本文件。

發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于治療慢性阻塞性肺病(copd)和哮喘的方法，具體而言，本發(fā)明涉及通過給予v型膠原(colv)或其耐受原性片段來治療copd和哮喘。

相關(guān)技術(shù)的描述

慢性阻塞性肺病(copd)是一類其中氣道變窄的肺部疾病。這導(dǎo)致進(jìn)出肺部的氣流受限，引起氣短。與哮喘不同，氣流受限可逆性較差，并通常隨時(shí)間持續(xù)惡化。copd也被稱為慢性阻塞性肺部疾病(cold)、慢性阻塞性氣道疾病(coad)、慢性氣流通氣受限(cal)和慢性阻塞性呼吸道疾病。術(shù)語(yǔ)“copd”包括兩種主要的疾病狀態(tài)—肺氣腫和慢性阻塞性支氣管炎。

肺氣腫中，很多肺泡之間的壁被損傷，導(dǎo)致它們喪失其形狀并變得松軟。這種損傷還能破壞肺泡壁，導(dǎo)致更少和更大的肺泡替代很多微小的肺泡。

慢性阻塞性支氣管炎中，氣道內(nèi)壁時(shí)常發(fā)炎和紅腫。這導(dǎo)致內(nèi)壁增厚。在氣道中形成很多厚的黏液，使其呼吸艱難。

大多數(shù)患有copd的人既患肺氣腫又患慢性阻塞性支氣管炎。因此，通用術(shù)語(yǔ)“copd”是更精確的。

慢性支氣管炎和肺氣腫最常由吸煙引起；大約90％患有copd的患者目前或者過去是吸煙者。盡管大約50％的吸煙者發(fā)展為慢性支氣管炎，但是僅有15％的吸煙者發(fā)展為不可逆的氣道阻塞。某些其它哺乳動(dòng)物，尤其是馬同樣會(huì)患copd。

與copd相關(guān)的氣道阻塞是進(jìn)行性的，可以伴隨氣道高反應(yīng)性，并且可以是部分可逆的。非特異的氣道高反應(yīng)還可能在copd的發(fā)展中起作用，并且可以預(yù)示吸煙者肺部功能的衰退速率加速。

copd是死亡和傷殘的主要原因。當(dāng)前其是美國(guó)和歐洲的第四大死亡原因。治療方針倡導(dǎo)早期檢測(cè)并執(zhí)行戒煙行動(dòng)以幫助降低由該疾病導(dǎo)致的發(fā)病率和死亡率。然而，由于諸多原因，早期檢測(cè)和診斷很難。

copd的發(fā)展需要花費(fèi)數(shù)年，并且吸煙者通常否認(rèn)由吸煙引起的任何有害效應(yīng)，將呼吸困難增強(qiáng)的早期警告信號(hào)歸因于年齡信號(hào)。同樣，支氣管炎的急性發(fā)作通常不被全科醫(yī)生認(rèn)為是copd的早期信號(hào)。很多患者表現(xiàn)出多于一種疾病(例如，慢性支氣管炎或哮喘性支氣管炎)的特征，使得精確診斷成為一種挑戰(zhàn)，尤其是在早期疾病時(shí)。同樣，很多患者并不尋求醫(yī)療幫助，直到他們?cè)馐芨鼑?yán)重的與肺功能減弱相關(guān)的癥狀時(shí)，例如呼吸困難、持續(xù)咳嗽和產(chǎn)生痰。因此，絕大多數(shù)患者沒有被診斷或治療直到他們處于更晚期的疾病階段時(shí)。

哮喘是折磨數(shù)百萬人群的氣道異質(zhì)性障礙。氣道炎癥、高反應(yīng)性和梗阻可以表征該疾病狀態(tài)。該疾病通常引起支氣管平滑肌系統(tǒng)的痙攣，并且影響上呼吸道和下呼吸道。有數(shù)種形式的哮喘，特征為嚴(yán)重程度不同。例如，輕度哮喘被界定為哮鳴的短暫發(fā)作，具有或不具有呼吸困難或咳嗽。中度哮喘被界定為哮鳴和呼吸困難，并且可以具有或不具有咳嗽和咳痰，但是通常會(huì)干擾日?；顒?dòng)和/或睡眠。重度哮喘的特征為由于呼吸困難導(dǎo)致能力喪失，并且受影響的患者通常無法正常進(jìn)食或睡眠，極其焦慮并且經(jīng)常會(huì)疲憊不堪。被稱為哮喘持續(xù)狀態(tài)的疾病狀態(tài)是最嚴(yán)重的哮喘形式，通常需要加強(qiáng)住院治療，并且甚至?xí)旅Ｔ摷膊〉陌l(fā)生可能是由于過敏性和非過敏性兩種機(jī)制。

盡管有數(shù)種可用來緩解與哮喘相關(guān)的癥狀和不適的治療，但是都沒有治愈。此外，目前的治療通常會(huì)引起副作用，使不適加重并發(fā)生其他致人虛弱的疾病狀態(tài)。輕度哮喘通常用β-腎上腺素藥以及抗組胺藥來治療，尤其對(duì)于兒童而言，從而預(yù)防或抑制間歇性發(fā)作。中度和重度哮喘通常用腎上腺素藥劑和支氣管擴(kuò)張藥以及皮質(zhì)類固醇來治療。由抗哮喘性藥劑導(dǎo)致的其它作用限制了它們的廣泛應(yīng)用，所述其它影響包括頭痛、疲勞、口干、神經(jīng)質(zhì)以及某些情況下的成癮和物質(zhì)濫用。理解哮喘的發(fā)病機(jī)理和治療的最新進(jìn)展在amjrespircritcaremed.2008may15；177(10):1068-73中更全面地討論。

由于哮喘在兒童和成年人中如此普遍，因此一直需要能治療這種疾病或至少能緩解這種疾病所伴隨的癥狀而不會(huì)引起不需要的副作用的藥劑。同樣，一直需要用于治療copd的組合物和方法。本發(fā)明提供了用于治療copd和哮喘的組合物和方法以及詳細(xì)描述中所描述的其它優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明概述

本發(fā)明一方面提供了治療慢性阻塞性肺病的方法，包括給予copd患者治療有效量的v型膠原或其耐受原性片段。在本文所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，copd患者患有肺氣腫和/或慢性阻塞性支氣管炎。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過口服給藥，并且可以以0.1mg-0.5mg的劑量給藥。在另一實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過靜脈內(nèi)給藥、通過肺內(nèi)灌注給藥、通過吸入給藥或通過肌內(nèi)給藥。在某些實(shí)施方案中，還可以使用不同途徑的組合。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述方法還包括給予copd患者支氣管擴(kuò)張藥、皮質(zhì)類固醇或用于copd的其它已知治療。

本發(fā)明另一方面提供了治療哮喘的方法，包括給予哮喘患者治療有效量的v型膠原或其耐受原性片段。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過口服給藥，并且可以以0.1mg-0.5mg的劑量給藥。在其它實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過靜脈內(nèi)給藥、通過肺內(nèi)灌注給藥、通過吸入給藥或通過肌內(nèi)給藥。在另一實(shí)施方案中，所述方法還包括給予哮喘患者皮質(zhì)類固醇、支氣管擴(kuò)張藥和/或白三烯調(diào)節(jié)劑或用于哮喘的其它已知治療。

本發(fā)明另一方面提供了在有發(fā)展成慢性阻塞性肺病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中預(yù)防慢性阻塞性肺病的發(fā)展的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的v型膠原或其耐受原性片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過口服給藥，并且可以以0.1mg-0.5mg的劑量給藥。在其它實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過靜脈內(nèi)給藥、通過肺內(nèi)灌注給藥、通過吸入給藥或通過肌內(nèi)給藥，并且可以通過這些途徑的組合來給藥。

本發(fā)明另一方面提供了在有發(fā)展成哮喘風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中預(yù)防哮喘的發(fā)展和惡化的方法，包括給予所述個(gè)體治療有效量的v型膠原或其耐受原性片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過口服給藥，并且在某些實(shí)施方案中，可以以0.1mg-0.5mg的劑量給藥。在另一實(shí)施方案中，v型膠原或其耐受原性片段通過靜脈內(nèi)給藥、通過肺內(nèi)灌注給藥、通過吸入給藥、通過肌內(nèi)給藥或通過這些途徑中一種或多種的組合來給藥。

本發(fā)明一方面提供了將copd或哮喘患者鑒定為用于v型膠原耐受療法的候選者的方法，包括將來自所述患者的血液樣品的至少一部分與v型膠原或其抗原性片段接觸；以及測(cè)量與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體的水平(即測(cè)量v型膠原特異性抗體的水平)；其中與v型膠原結(jié)合的抗體的存在指示copd或哮喘。在這方面中，v型膠原特異性抗體的水平可以與本文所述的其它臨床因素聯(lián)合用于診斷copd和哮喘。在一個(gè)實(shí)施方案中，將v型膠原或其抗原性片段結(jié)合于珠子上。在另一實(shí)施方案中，所述測(cè)量包括將與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體與熒光標(biāo)記的抗igg抗體接觸；以及通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與結(jié)合于v型膠原上的抗體結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗igg抗體的量。

本發(fā)明另一方面提供了鑒定有發(fā)展成copd或哮喘風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體的方法，包括：將來自所述個(gè)體的血液樣品的至少一部分與v型膠原或其抗原性片段接觸；以及測(cè)量與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體的水平(即測(cè)量v型膠原特異性抗體的水平)；其中與v型膠原結(jié)合的抗體的存在與更高的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，所述更高的風(fēng)險(xiǎn)比在沒有與v型膠原結(jié)合的抗體的個(gè)體中所預(yù)期的風(fēng)險(xiǎn)更高。在一個(gè)實(shí)施方案中，將v型膠原或其抗原性片段結(jié)合于珠子上。在另一實(shí)施方案中，所述測(cè)量包括將與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體與熒光標(biāo)記的抗igg抗體接觸；以及通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與結(jié)合于v型膠原上的抗體結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗igg抗體的量。

在診斷或測(cè)量發(fā)展成copd或哮喘的風(fēng)險(xiǎn)的方法的某些實(shí)施方案中，所述方法中所用的抗igg抗體檢測(cè)所有igg亞型。在其它實(shí)施方案中，所述抗igg抗體特異性地檢測(cè)igg1亞型、或igg2亞型、或igg3亞型或igg4亞型。在這方面中，在疾病進(jìn)展中可能發(fā)生一種亞型至另一種亞型的轉(zhuǎn)變，并且這可能指示疾病的惡化。因此，一種亞型隨時(shí)間增加可能指示疾病的惡化。

本發(fā)明另一方面提供了監(jiān)測(cè)個(gè)體中copd或哮喘進(jìn)展的方法，包括將來自所述個(gè)體的第一血液樣品的至少一部分與v型膠原或其抗原性片段接觸；測(cè)量第一血液樣品中與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體的水平；將在較晚時(shí)間點(diǎn)采自所述個(gè)體的第二血液樣品的至少一部分與v型膠原或其抗原性片段接觸；測(cè)量第二血液樣品中與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體的水平；以及將第二血液樣品中與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體的水平與第一血液樣品中與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體的水平進(jìn)行比較；其中與第一樣品相比，第二樣品中與v型膠原結(jié)合的抗體的水平增加指示copd或哮喘在惡化，并且與第一樣品相比，第二樣品中與v型膠原結(jié)合的抗體的水平降低指示copd或哮喘的改善。copd和哮喘的其它臨床指征可以與本文所提供的方法聯(lián)合使用。在某些實(shí)施方案中，特定igg亞型(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)的抗v型膠原抗體的增加指示copd或哮喘的進(jìn)展。在某些實(shí)施方案中，將v型膠原或其抗原性片段結(jié)合于珠子上。在另一實(shí)施方案中，所述測(cè)量包括將與v型膠原或其抗原性片段結(jié)合的抗體與熒光標(biāo)記的抗igg抗體接觸；以及通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與結(jié)合于v型膠原上的抗體結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗igg抗體的量。在用于監(jiān)測(cè)進(jìn)展的方法的某些實(shí)施方案中，所述抗igg抗體檢測(cè)所有igg亞型。在其它實(shí)施方案中，所述抗igg抗體特異性地檢測(cè)igg1、igg2、igg3或igg4亞型。

結(jié)合以下詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些方面和其它方面將變得明顯。

附圖簡(jiǎn)要說明

圖1是顯示copd患者中抗v型膠原抗體升高的柱形圖。

圖2是顯示哮喘患者中抗v型膠原抗體升高的柱形圖。

圖3顯示在靜脈內(nèi)給予v型膠原之后，對(duì)小鼠中卵白蛋白誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)的預(yù)防。除了colv(每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)n＝2-5)之外所有組中的n＝5。

圖4a-4e是顯示通過靜脈內(nèi)給予col(v)而在肺單核細(xì)胞中誘導(dǎo)ifn-γ轉(zhuǎn)錄本的柱形圖。進(jìn)行定量pcr來顯示il-4、il-5、il-13、ifn-γ和il-10細(xì)胞因子。只有col(v)iv在肺單核細(xì)胞中誘導(dǎo)ifn-γ轉(zhuǎn)錄本。數(shù)據(jù)表示從每組5只小鼠合并的肺單核細(xì)胞的rna。

發(fā)明的詳細(xì)描述

v型膠原

膠原蛋白是主要由羥脯氨酸(hyp)、甘氨酸(gly)和脯氨酸(pro)組成的重復(fù)氨基酸序列所形成的多肽鏈。膠原是人體中所見的最豐富的蛋白之一，在正常(非受傷)皮膚組織的真皮層中包含約80-85％的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)。

基于序列同一性和功能，將膠原分成數(shù)種類型。i型、ii型和iii型膠原分子構(gòu)成大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的主要纖維。i型形成約90％的身體膠原，并且是骨、皮膚和腱的主要成分。ii型構(gòu)成軟骨的主要纖維。膠原纖維以剛性板狀排列于骨中，以平行束狀排列于腱中，并以致密網(wǎng)狀排列于軟骨中。i型和較少量的iii型構(gòu)成腱和皮膚。iv型膠原分子構(gòu)成存在于基膜中的非常纖細(xì)、平滑的纖維。v型膠原(colv)是存在于肺中的小膠原(madriandfurthmayr,humanpathology,11:353-366,1980)，并且位于細(xì)支氣管周的結(jié)締組織(madriandfurthmayr,am.j.pathol.,94:323-332,1979)、肺泡間質(zhì)組織(konomietal.,1984)和毛細(xì)血管基膜(madriandfurthmayr,1979,同上)中。已知的其它膠原類型超過12種，但是還沒有得到很好的表征。

膠原多肽鏈的特征為由重復(fù)甘氨酸-x-y三聯(lián)體和球狀n-末端和c-末端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成核心螺旋結(jié)構(gòu)域。三條這樣的鏈以超螺旋彼此環(huán)繞，從而產(chǎn)生單個(gè)繩子樣的膠原分子。

以前的工作已經(jīng)表明，對(duì)colv的自身免疫性與慢性同種移植異常(包括閉塞性細(xì)支氣管炎、閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征(bos))、肺同種移植排斥和具有患ipf的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)(參見例如，美國(guó)專利7,348,005和wo2007/120947)。此外，這項(xiàng)工作表明colv的給予能誘導(dǎo)對(duì)同種抗原和colv的耐受(參見例如，wo2007/120947；圖10)。然而，在本發(fā)明之前，在哮喘或copd中沒有表明colv與自身免疫性的關(guān)聯(lián)。事實(shí)上，以前的發(fā)現(xiàn)表明，患copd的患者沒有抗col(v)的dth應(yīng)答，這顯著不同于沒有患已知肺病的正常個(gè)體中所見的情況(參見wo2007/120947,實(shí)施例2；圖3)。因此，本發(fā)明是意料不到的，在于盡管以前觀察到患copd的患者與正常對(duì)照相比沒有升高的抗colv的dth應(yīng)答，但是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，copd患者具有升高的抗colv抗體(參見例如，實(shí)施例1、圖1)。

因此，本發(fā)明涉及在copd和哮喘患者中或有發(fā)展成這些疾病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中誘導(dǎo)對(duì)colv的耐受。

colv多核苷酸和多肽序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。本發(fā)明的示例性colv多核苷酸和多肽包括但不限于，智人膠原，v型，α1(col5a1)，mrnancbi參照序列：nm_000093.3gi:89276750版本(seqidno:1)；α1v型膠原前蛋白原[智人]：登錄號(hào)np_000084，gi:89276751版本(seqidno:2)；智人膠原，v型，α2(col5a2)，mrna，登錄號(hào)nm_000393，gi:89363016版本(seqidno:3)；α2v型膠原前蛋白原[智人]，登錄號(hào)np_000384，gi:89363017版本(seqidno:4)；智人膠原，v型，α3(col5a3)，mrna，登錄號(hào)nm_015719、nm_015719.3，gi:110735434(seqidno:5)；膠原，v型，α3前蛋白原[智人]，登錄號(hào)np_056534，np_056534.2版本，gi:110735435(seqidno:6)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的，前原膠原在細(xì)胞中被加工成原膠原，該原膠原從細(xì)胞輸出并最終形成膠原原纖維和纖維。因此，本發(fā)明明確考慮原膠原和本文所述的已加工的或成熟形式的膠原蛋白。在這方面中，例如，seqidno:4的氨基酸1-26對(duì)應(yīng)于信號(hào)肽，其在加工期間被切割，氨基酸27-1229是膠原α-2(v)鏈，且氨基酸1230-1499對(duì)應(yīng)于c-末端前肽。本文具體公開的序列中的這些位置可被本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別，并且可通過其中提供序列批注的各種公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。還應(yīng)當(dāng)注意，膠原蛋白的某些氨基酸在加工期間被修飾(例如，脯氨酸成為羥脯氨酸)。成熟的、修飾形式的v型膠原鏈，尤其是α-2鏈?zhǔn)潜疚拿鞔_考慮的。如其它地方所指出的，本發(fā)明中所用的v型膠原及其α鏈可以從多種來源純化或重組產(chǎn)生。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”以其常規(guī)含義使用，即作為氨基酸的序列。多肽并不限制于特定長(zhǎng)度的產(chǎn)物，因此，多肽定義包括肽、寡肽和蛋白，并且這類術(shù)語(yǔ)本文可互換使用，除非明確指出不是這樣。該術(shù)語(yǔ)還不指或排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，天然存在的或非天然存在的糖基化、乙酰化、磷酸化等以及領(lǐng)域內(nèi)已知的其它修飾。多肽可以是整個(gè)蛋白或其子序列。本發(fā)明背景下的特定目的多肽是包含耐受原性片段的氨基酸子序列。

另一方面，本發(fā)明提供了這樣的多肽片段，該多肽片段包含本文所示的膠原多肽組合物的至少約5、10、15、20、25、50或100個(gè)連續(xù)氨基酸或更多，包括所有中間長(zhǎng)度，所述膠原多肽組合物例如seqidno:2、4或6所示的那些或seqidno:1、3或5序列中所示的多核苷酸序列所編碼的那些。

另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的多肽組合物的變體。本發(fā)明通常包括的多肽變體沿其長(zhǎng)度與本文所示的多肽序列通常表現(xiàn)出至少約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性(按下述確定)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的多肽片段和變體是本文所述的免疫學(xué)上耐受原性的。

本文所用的術(shù)語(yǔ)多肽“變體”是通過一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、添加和/或插入而通常不同于本文具體公開的多肽的多肽。這類變體可以是天然存在的或可以是合成產(chǎn)生的，例如通過修飾一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的上述多肽序列，并按本文所述評(píng)價(jià)它們的耐受原活性和/或利用領(lǐng)域內(nèi)公知的任何技術(shù)。

在很多情況下，變體含有保守型取代。“保守型取代”是指氨基酸被具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸所取代，使得肽化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可預(yù)料到該多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性基本未改變?？梢栽诒景l(fā)明的多核苷酸和多肽結(jié)構(gòu)中進(jìn)行修飾，并仍能獲得編碼具有期望特性(例如，具有耐受原性特性)的變體或衍生多肽的功能性分子。當(dāng)希望改變多肽的氨基酸序列來產(chǎn)生等同的甚至改進(jìn)的本發(fā)明多肽的耐受原性變體或部分時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常按照表1改變編碼dna序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子。

例如，在蛋白結(jié)構(gòu)中，某些氨基酸可以被其他的氨基酸取代，而不會(huì)造成與諸如抗體的抗原結(jié)合區(qū)或基底分子的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)的相互結(jié)合能力的明顯損失。由于是蛋白的相互作用能力和性質(zhì)限定了該蛋白的生物學(xué)功能活性，因此可以在蛋白序列中進(jìn)行某些氨基酸序列的取代，以及當(dāng)然也可在其基礎(chǔ)dna編碼序列中進(jìn)行取代，并仍可獲得具有相似性質(zhì)的蛋白。因而已考慮到，可以在所公開的組合物的肽序列或編碼所述肽的相應(yīng)dna序列中進(jìn)行各種改變，而不會(huì)造成它們的耐受原性功效或活性的明顯損失。

表1

在進(jìn)行這些改變時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮氨基酸的親水指數(shù)。本領(lǐng)域內(nèi)普遍理解親水氨基酸指數(shù)在賦予蛋白相互作用的生物學(xué)功能中的重要性(kyteanddoolittle,1982，通過引用并入本文)。已接受氨基酸的相對(duì)親水特性與得到的蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而該二級(jí)結(jié)構(gòu)隨之限定了該蛋白與諸如酶、底物、受體、dna、抗體、抗原等其它分子的相互作用?；诎被岬氖杷院碗姾商匦裕糠N氨基酸具有指定的親水指數(shù)(kyteanddoolittle,1982)。這些值是：異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

本領(lǐng)域內(nèi)已知，某些氨基酸可以被具有相似親水指數(shù)或評(píng)分的其它氨基酸取代，而仍產(chǎn)生具有相似生物學(xué)活性的蛋白，即仍獲得生物學(xué)功能等同的蛋白。在進(jìn)行這些改變時(shí)，親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，并且更特別優(yōu)選的是在±0.5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。美國(guó)專利4,554,101(具體通過引用全文并入本文)陳述，蛋白最局部的平均親水性(由其鄰近氨基酸的親水性導(dǎo)致)與該蛋白的生物學(xué)性質(zhì)相關(guān)。

如美國(guó)專利第4,554,101號(hào)詳述，已將下述親水性值指定給氨基酸殘基：精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。應(yīng)當(dāng)理解，氨基酸可以被具有相似親水性值的另一氨基酸取代，且仍獲得生物學(xué)上等同的，尤其是免疫學(xué)上等同的蛋白。在這類改變中，親水性值在±2以內(nèi)的氨基酸的取代是優(yōu)選的，特別優(yōu)選的是在±1以內(nèi)的氨基酸的取代，并且更特別優(yōu)選的是在±0.5以內(nèi)的那些氨基酸的取代。

如上文所述，氨基酸取代因而通常基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)的相似性，例如，它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。綜合考慮了上述各種特性的示例性取代是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且包括：精氨酸與賴氨酸、谷氨酸與天冬氨酸、絲氨酸與蘇氨酸、谷氨酰胺與天冬酰胺、以及纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸。

此外，可以進(jìn)一步修飾任何多核苷酸以增加體內(nèi)穩(wěn)定性。可能的修飾包括但不限于，在5'和/或3'末端添加側(cè)翼序列、在主鏈中使用硫代磷酸或2'o-甲基而不是磷酸二酯酶連接和/或包含諸如肌苷、q核苷和和懷丁苷的非常規(guī)堿基以及乙酰基、甲基、巰基和其它修飾形式的腺嘌呤、把嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。

還可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)的相似性進(jìn)行氨基酸取代。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸，帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸，以及帶有具有相似親水性值的不帶電荷極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括：亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢源肀Ｊ匦透淖兊钠渌被峤M包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。變體還可以含有非保守型改變或可選擇地含有非保守型改變。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，變體多肽與天然序列的區(qū)別在于5個(gè)或更少的氨基酸的取代、缺失或添加。還可以(或可選擇地)通過例如對(duì)多肽的耐受原性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性具有最小影響的氨基酸的缺失或添加來修飾變體。

如上文所述，多肽在蛋白的n末端可以包含信號(hào)(或前導(dǎo))序列，其在翻譯的同時(shí)或在翻譯后指導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)移。多肽還可以與連接物或其他序列綴合，以便于多肽的合成、純化或鑒定(例如，多聚組氨酸)，或用于增強(qiáng)多肽與固相載體的結(jié)合。例如，多肽可以與免疫球蛋白fc區(qū)綴合。

當(dāng)比較多肽序列時(shí)，如果兩個(gè)序列中的氨基酸序列在如下文所述進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)比對(duì)時(shí)是相同的，則可以認(rèn)為所述兩個(gè)序列是“同一的”。通常通過在比較窗中比較序列來進(jìn)行兩個(gè)序列間的比較，從而鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。本文所用的“比較窗”是指至少約20個(gè)連續(xù)位置、通常30-約75個(gè)、40-約50個(gè)連續(xù)位置的節(jié)段，其中在將序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位置的參考序列最佳比對(duì)后，可以將所述序列與參考序列進(jìn)行比較。

可以使用lasergene生物信息學(xué)軟件套裝中的megalign程序(dnastar,inc.,madison,wi)，使用默認(rèn)參數(shù)，進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。該程序包括以下參考文獻(xiàn)中描述的數(shù)種比對(duì)方案：dayhoff,m.o.(1978)amodelofevolutionarychangeinproteins-matricesfordetectingdistantrelationships(蛋白質(zhì)的進(jìn)化改變模型-用于檢驗(yàn)遠(yuǎn)距離關(guān)系的矩陣)；indayhoff,m.o.(ed.)atlasof蛋白sequenceandstructure(蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜),nationalbiomedicalresearchfoundation,washingtondcvol.5,suppl.3,pp.345-358；heinj.(1990)unifiedapproachtoalignmentandphylogenes(比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)方法)pp.626-645；methodsinenzymology(酶學(xué)方法)vol.183,academicpress,inc.,sandiego,ca；higgins,d.g.andsharp,p.m.,cabios5:151-153(1989)；myers,e.w.andmullerw.,cabios4:11-17(1988)；robinson,e.d.,comb.theor11:105(1971)；saitou,n.nei,m.,mol.biol.evol.4:406-425(1987)；sneath,p.h.a.andsokal,r.r.,numericaltaxonomy–theprinciplesandpracticeofnumericaltaxonomy(數(shù)值分類法-數(shù)值分類法的原理和實(shí)踐),freemanpress,sanfrancisco,ca(1973)；wilbur,w.j.andlipman,d.j.,proc.natl.acad.,sci.usa80:726-730(1983)。

可選擇地，可以通過以下來進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)：smithandwatermanadd.apl.math2:482(1981)的局部同一性算法、needlemanandwunschj.mol.biol.48:443(1970)的同一性比對(duì)算法、pearsonandlipmanproc.natlacad.sci.usa85:2444(1988)的相似性方法搜索、這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta,geneticscomputergroup(gcg),575sciencedr.,madison,wi)、或檢查。

適于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是blast和blast2.0算法，其分別描述于altschuletal.nucl.acidsres.25:3389-3402(1977)和altschuletal.j.mol.biol.215:403-410(1990)中。例如，可以按照本文所述的參數(shù)使用blast和blast2.0，從而確定本發(fā)明多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)可以公開獲得進(jìn)行blast分析的軟件。對(duì)于氨基酸序列而言，可以將評(píng)分矩陣用于計(jì)算累積評(píng)分。在以下情況時(shí)停止每個(gè)方向的字符命中延伸：當(dāng)累積比對(duì)評(píng)分從其最大達(dá)到的值下降量x時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的累積而使累積評(píng)分達(dá)到0或低于0時(shí)；或達(dá)到任一序列的末端時(shí)。blast算法參數(shù)w、t和x決定了所述比對(duì)的靈敏度和速度。

在一個(gè)優(yōu)選的方法中，通過在至少20個(gè)位置的比較窗中比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來確定“序列同一性百分比”，其中，與用于兩個(gè)序列最佳比對(duì)的參考序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗中的多肽序列的一部分可以包含20％或更少的、通常為5％-15％、或10％-12％的添加或缺失(即，空位)。通過以下來計(jì)算百分比：確定兩個(gè)序列中都存在的相同氨基酸殘基的位置數(shù)量來產(chǎn)生配對(duì)位置數(shù)，將配對(duì)位置數(shù)除以參考序列中(即窗的大小)的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。

在其它示例性的實(shí)施方案中，多肽可以是包含多個(gè)本文所述的多肽的融合多肽，或者可以是包含至少一個(gè)本文所述的多肽和一段無關(guān)序列(例如用于純化的組氨酸標(biāo)簽或?qū)螂?的融合多肽。例如，融合伴侶可以有助于以高于天然重組蛋白的產(chǎn)量表達(dá)蛋白(表達(dá)增強(qiáng)子)?？梢赃x擇其它的融合伴侶，以增加多肽的溶解性或使多肽能靶向于所需的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。其它融合伴侶包括促進(jìn)多肽純化的親和性標(biāo)簽。在某些實(shí)施方案中，融合伴侶能增加多肽的耐受原性或提高其通過細(xì)胞的攝入。在其它實(shí)施方案中，融合伴侶包含免疫應(yīng)答增強(qiáng)子。

通常可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備融合蛋白，包括化學(xué)綴合。優(yōu)選地，在表達(dá)系統(tǒng)中，融合多肽作為重組多肽表達(dá)，允許以高于非融合多肽的水平產(chǎn)生。簡(jiǎn)單而言，可以分別組裝編碼多肽組分的dna序列，并將其連入合適的表達(dá)載體中。使用或不使用肽連接物將編碼一種多肽組分的dna序列的3'端與編碼第二多肽組分的dna序列的5'端連接，這樣序列的讀碼框是同相的。這允許翻譯為同時(shí)保留兩個(gè)組分多肽的生物活性的單一融合多肽。

可以用肽連接物序列將第一和第二多肽組分隔開足以確保每種多肽折疊成其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的距離。用本領(lǐng)域內(nèi)公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這類肽連接物序列并入融合多肽?？梢曰谙铝幸蛩剡x擇合適的肽連接物序列：(1)它們采取柔韌的、伸展的構(gòu)象的能力；(2)它們不會(huì)采取與第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力；和(3)可以與所述多肽功能表位反應(yīng)的疏水或帶電殘基的缺乏。優(yōu)選的肽連接物序列包含gly、asn和ser殘基。諸如thr和ala的其它接近中性的氨基酸也可以用于連接物序列中。可以有效地用作連接物的氨基酸序列包括公開于marateaetal.,gene40:39-461985；murphyetal.,proc.natl.acad.sci.usa83:8258-82621986；美國(guó)專利第4,935,233號(hào)和第4,751,180號(hào)中的那些氨基酸序列。通常，連接物序列的長(zhǎng)度可以為1-約50個(gè)氨基酸。當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌梢杂脕砀糸_功能結(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需n末端氨基酸區(qū)時(shí)，不需要連接物序列。

將連接的dna序列可操縱地連接于合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件。負(fù)責(zé)dna表達(dá)的調(diào)節(jié)元件僅位于編碼第一多肽的dna序列的5'。同樣，終止翻譯所需的終止密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)僅位于編碼第二多肽的dna序列的3'。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及融合多肽和編碼它們的多核苷酸。其中所述融合伴侶包含能引導(dǎo)多肽進(jìn)入內(nèi)體/溶酶體區(qū)域的導(dǎo)向信號(hào)，如美國(guó)專利第5,633,234號(hào)中所描述。當(dāng)與該導(dǎo)向信號(hào)融合時(shí)，本發(fā)明的耐受原性多肽會(huì)更有效地聯(lián)合mhcii類分子，從而為該多肽特異的合適的cd4⁺t細(xì)胞提供增強(qiáng)的體內(nèi)刺激。

可以利用各種公知的合成和/或重組技術(shù)制備本發(fā)明的多肽，后者將在下文進(jìn)一步描述。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)通過合成方法產(chǎn)生的多肽、一部分或其它變體通常小于約150個(gè)氨基酸。在一個(gè)示例性的實(shí)例中，利用任何商業(yè)上可獲得的固相技術(shù)來合成這類多肽，例如merrifield固相合成方法，其中氨基酸被相繼添加到生長(zhǎng)的氨基酸鏈上。參見merrifield,j.am.chem.soc.85:2149-2146,1963。用于多肽自動(dòng)合成的設(shè)備可購(gòu)自諸如perkinelmer/appliedbiosystemsdivision(fostercity,ca)的供應(yīng)商，并且可以按照廠商的說明書進(jìn)行操縱。

通常，本發(fā)明的多肽組合物(包括融合多肽)是分離的?！胺蛛x的”多肽是從其原來的環(huán)境中移出的多肽。例如，如果將天然存在的蛋白或多肽與天然系統(tǒng)中的部分或所有的共存物質(zhì)分開，則該天然存在的蛋白或多肽是分離的。優(yōu)選地，這類多肽還被純化，例如是至少約90％純的，更優(yōu)選為至少約95％純的和最優(yōu)選為至少約99％純的。

colv蛋白可以從多種來源純化或可以從商業(yè)來源(collaborativebiomedicalproducts/becton,dickinsonandcompany,franklinlakes,njusa)購(gòu)買。為了實(shí)施一些實(shí)施方案，可能必須獲得純的或基本純的膠原或其耐受原性片段、表位或抗原部分。通過多種途徑可易于獲取這些材料例如v型膠原或其片段，包括但不限于動(dòng)物來源、人尸體或重組方式。其它方法包括部分消化諸如v型膠原的膠原。在這方面中，人類v型膠原可從人尸體或其它來源提取，并通過差別nacl沉淀來純化(seyerandkang,1989)。例如，將胎盤組織切碎、洗滌并懸浮于含有0.2mnacl的0.5m乙酸中，并于4℃用胃蛋白酶消化。從離心的樣本吸出上清，收集沉淀并重復(fù)提取方案。將兩次消化的上清混合，并通過差別nacl沉淀從0.5m乙酸上清中純化col(v)(smithetal.,1985；seyerandkang,1989)。v型膠原通?？扇苡?.7mnacl中，并在1.2mnacl中沉淀。

對(duì)于這些需要純化α(v)鏈的實(shí)施方案而言，可以重復(fù)乙酸溶解和nacl沉淀的循環(huán)，直到獲得具有α-鏈比值、α1(v)/α2(v)大約為2的v型制劑，該比值是通過sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(smithetal.,1985)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它合適的方法來測(cè)定的?？梢酝ㄟ^deae-纖維素層析(seyerandkang,1989)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，例如proteinpurificationprotocols,ed.shawndoonan,humanapress,1996)中所描述的那些方法實(shí)現(xiàn)α1(v)與α2(v)的分離?？蓮闹刺幡?(v)與α2(v)鏈，并通過之前所報(bào)道的sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(smith,jr.etal,1985)來確認(rèn)純度?？梢詫⑼暾腸ol(v)或α1(v)與α2(v)鏈稀釋于pbs(0.5mg/ml)或其它合適的緩沖液中直到使用。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明膠原蛋白的多核苷酸。示例性的多核苷酸是seqidno:1、3和5中所示的那些和它們編碼本文所述的膠原蛋白的耐受原性片段的片段。

術(shù)語(yǔ)“dna”和“多核苷酸”在本文實(shí)質(zhì)上是可交換使用的，是指已從特定物種的總基因組dna分離出的dna分子。本文所用的“分離的”表示多核苷酸基本上遠(yuǎn)離其它編碼序列，以及該dna分子不含大部分無關(guān)的編碼dna，例如大量的染色體片段或其它功能基因或多肽編碼區(qū)。當(dāng)然，這是指最初分離的dna分子，并且不排除后來通過人工添加到該節(jié)段上的基因或編碼區(qū)。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明的多核苷酸組合物包括基因組序列、基因組外序列和質(zhì)粒編碼的序列以及表達(dá)或被改造來表達(dá)蛋白、多肽、肽等的較小的工程基因節(jié)段。這類區(qū)段可以是天然分離的，或人工合成修飾的。

可以利用任何成熟的技術(shù)來鑒定、制備和/或操縱本發(fā)明的多核苷酸組合物(通常參見，sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual(分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)),coldspringharborlaboratories,coldspringharbor,ny,1989；ausubeletal.(2001currentprotocolsinmolecularbiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)),greenepubl.assoc.inc.&johnwiley&sons,inc.,ny,ny)及其它類似的參考文獻(xiàn))。

可利用多種模板依賴性的方法來擴(kuò)增樣品中所存在目的靶序列。公知的擴(kuò)增方法之一是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr^tm)，這在美國(guó)專利第4,683,195號(hào)、第4,683,202號(hào)和第4,800,159號(hào)中有詳細(xì)描述，通過引用將每一篇全文并入本文。

任何其它模板依賴性的方法，其中多數(shù)是pcrtm擴(kuò)增技術(shù)的衍化是領(lǐng)域內(nèi)已知且易于利用的。舉例來說，一些這類方法包括例如描述于歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)320,308和美國(guó)專利第4,883,750號(hào)中的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(稱為lcr)、描述于pct國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)pct/us87/00880中的qβ復(fù)制酶、鏈置換擴(kuò)增(sda)和修復(fù)鏈反應(yīng)(rcr)。其它擴(kuò)增方法描述于英國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?202328和pct國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)pct/us89/01025中。其它核酸擴(kuò)增方法包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(tas)(pct國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo88/10315)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)和3sr。歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)329,822描述了涉及循環(huán)合成單鏈rna(“ssrna”)、ssdna和雙鏈dna(dsdna)的核酸擴(kuò)增方法。pct國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)wo89/06700描述了基于啟動(dòng)子/引物序列與靶單鏈dna(“ssdna”)雜交，隨后轉(zhuǎn)錄出該序列的很多rna拷貝的核酸序列擴(kuò)增方案。諸如“race”(frohman,1990)和“單側(cè)pcr”(ohara,1989)的其它擴(kuò)增方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。

利用公知技術(shù)可以使用本發(fā)明多核苷酸的擴(kuò)增部分從合適的文庫(kù)(例如，腫瘤cdna文庫(kù))分離出全長(zhǎng)基因。

還如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的，本發(fā)明的多核苷酸可以是單鏈的(編碼或反義)或雙鏈的，并且可以是dna(基因組、cdna或合成物)或rna分子。rna分子可以包括hnrna分子和mrna分子，所述hnrna分子包含內(nèi)含子并且以一對(duì)一的方式對(duì)應(yīng)于dna分子，而所述mrna分子不含內(nèi)含子。其它編碼或非編碼序列可以，但不需要，存在于本發(fā)明的多核苷酸中，并且多核苷酸可以，但不需要，與其他的分子和/或支持物質(zhì)連接。

多核苷酸可以包含天然序列(即，編碼本發(fā)明的多肽/蛋白或其一部分的內(nèi)源序列)，或可以包含編碼這類序列的變體或衍生物，優(yōu)選耐受原性變體或衍生物的序列。

在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與本文在seqidno:1、3和5中所提供的序列具有大量同一性的多核苷酸變體，例如，利用本文所述的方法(例如，如下文討論的，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的blast分析)，包含與本發(fā)明的多核苷酸序列相比具有至少70％的序列同一性，優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，通過考慮密碼簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀碼框定位等，這些值可以被適當(dāng)調(diào)整以確定兩個(gè)核苷酸序列所編碼的蛋白的對(duì)應(yīng)的同一性。

通常，多核苷酸變體可以包含一個(gè)或多個(gè)取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選使得由該變體多核苷酸所編碼的多肽的耐受原活性相對(duì)于本文具體展示的多核苷酸序列所編碼的多肽沒有顯著減弱。術(shù)語(yǔ)“變體”還應(yīng)當(dāng)被理解為包括異種來源的同源基因。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了多核苷酸片段，其包含與本文所公開的一個(gè)或多個(gè)序列相同或互補(bǔ)的序列的不同長(zhǎng)度的連續(xù)區(qū)段，或由這些區(qū)段組成。例如，本發(fā)明提供的多核苷酸包含至少約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多個(gè)本發(fā)明所公開的一個(gè)或多個(gè)序列的連續(xù)核苷酸，以及所有的中間長(zhǎng)度，或者由至少約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多個(gè)本發(fā)明所公開的一個(gè)或多個(gè)序列的連續(xù)核苷酸，以及所有的中間長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸組成。應(yīng)當(dāng)容易理解，此處的“中間長(zhǎng)度”表示所提到的值之間的任何長(zhǎng)度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括跨越200-500、500-1,000等的所有整數(shù)?？梢栽诒疚乃龅亩嗪塑账嵝蛄械囊欢嘶騼啥搜由焯烊恍蛄兄形匆姷钠渌塑账?。位于所公開序列的任一端或位于所公開序列的兩端的這個(gè)其它序列可以由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸組成。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供能夠在中度至高度嚴(yán)緊條件下與本文提供的多核苷酸序列，或該多核苷酸的片段，或該多核苷酸的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸組合物。雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的。為了說明的目的，適于測(cè)試本發(fā)明的多核苷酸與其他多核苷酸雜交的中度嚴(yán)緊條件包括：在5×ssc、0.5％sds、1.0mmedta(ph8.0)的溶液中預(yù)先洗滌；在5×ssc中、于50℃-60℃過夜雜交；然后，用含有0.1％sds的2×ssc、0.5×ssc和0.2×ssc中的每一種、于65℃洗滌20分鐘，洗滌兩次。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，容易操縱雜交的嚴(yán)緊度，例如通過改變雜交溶液的鹽含量和/或改變進(jìn)行雜交時(shí)的溫度。例如，在另一實(shí)施方案中，合適的高度嚴(yán)緊雜交條件包括上文所討論的那些條件，除此之外，要將雜交溫度提高到例如60-65℃或65-70℃。

在一個(gè)實(shí)施方案中，這類多核苷酸變體編碼這樣的多肽，其具有本文具體展示的多肽序列的至少約50％、優(yōu)選至少約70％，且更優(yōu)選至少約90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的耐受原活性水平。

不考慮編碼序列自身的長(zhǎng)度，本發(fā)明的多核苷酸或其片段可以與其它dna序列組合，所述其它dna序列例如啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、其它限制性酶切位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其它編碼節(jié)段等，從而它們的總長(zhǎng)度可以有相當(dāng)大的變化。因此，應(yīng)當(dāng)考慮到，可以使用幾乎任何長(zhǎng)度的核酸片段，總長(zhǎng)度優(yōu)選地受在計(jì)劃的重組dna流程中制備和使用的便利性的限制。例如，本發(fā)明的多種實(shí)施中可考慮使用總長(zhǎng)度為約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50個(gè)堿基對(duì)等(包括所有中間長(zhǎng)度)的示例性的多核苷酸節(jié)段。

當(dāng)比較多核苷酸序列時(shí)，如果兩個(gè)序列中的核苷酸序列在如下文所述進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)比對(duì)時(shí)是相同的，則可以認(rèn)為所述兩個(gè)序列是“同一的”。通常通過在比較窗中比較序列來進(jìn)行兩個(gè)序列間的比較，從而鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。本文所用的“比較窗”是指至少約20個(gè)連續(xù)位置、通常30-約75個(gè)、40-約50個(gè)連續(xù)位置的節(jié)段，其中在將序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位置的參考序列最佳比對(duì)后，可以將所述序列與參考序列進(jìn)行比較。

可以使用lasergene生物信息學(xué)軟件套裝中的megalign程序(dnastar,inc.,madison,wi)，使用默認(rèn)參數(shù)，進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。該程序包括以下參考文獻(xiàn)中描述的數(shù)種比對(duì)方案：dayhoff,m.o.(1978)amodelofevolutionarychangeinproteins-matricesfordetectingdistantrelationships(蛋白質(zhì)的進(jìn)化改變模型-用于檢驗(yàn)遠(yuǎn)距離關(guān)系的矩陣)；indayhoff,m.o.(ed.)atlasof蛋白sequenceandstructure(蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜),nationalbiomedicalresearchfoundation,washingtondcvol.5,suppl.3,pp.345-358；heinj.unifiedapproachtoalignmentandphylogenes(比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生的標(biāo)準(zhǔn)方法)pp.626-645(1990)；methodsinenzymology(酶學(xué)方法)vol.183,academicpress,inc.,sandiego,ca；higgins,d.g.andsharp,p.m.,cabios5:151-153(1989)；myers,e.w.andmullerw.,cabios4:11-17(1988)；robinson,e.d.,comb.theor11:105(1971)；saitou,n.nei,m.,mol.biol.evol.4:406-425(1987)；sneath,p.h.a.andsokal,r.r.,numericaltaxonomy–theprinciplesandpracticeofnumericaltaxonomy(數(shù)值分類法-數(shù)值分類法的原理和實(shí)踐),freemanpress,sanfrancisco,ca(1973)；wilbur,w.j.andlipman,d.j.,proc.natl.acad.,sci.usa80:726-730(1983)。

可選擇地，可以通過以下來進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)：smithandwatermanadd.apl.math2:482(1981)的局部同一性算法、needlemanandwunschj.mol.biol.48:443(1970)的同一性比對(duì)算法、pearsonandlipmanproc.natlacad.sci.usa85:2444(1988)的相似性方法搜索、這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta,geneticscomputergroup(gcg),575sciencedr.,madison,wi)、或檢查。

適于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是blast和blast2.0算法，其分別描述于altschuletal.nucl.acidsres.25:3389-3402(1977)和altschuletal.j.mol.biol.215:403-410(1990)中。例如，可以按照本文所述的參數(shù)使用blast和blast2.0，從而確定本發(fā)明多核苷酸的序列同一性百分比。通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)可以公開獲得進(jìn)行blast分析的軟件。在一示例性的實(shí)例中，對(duì)于核苷酸序列而言，可以使用參數(shù)m(對(duì)于一對(duì)配對(duì)殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分；總是>0)和n(對(duì)于不配對(duì)殘基的罰分；總是<0)來計(jì)算累積評(píng)分。在以下情況時(shí)停止每個(gè)方向的字符命中延伸：當(dāng)累積比對(duì)評(píng)分從其最大達(dá)到的值下降量x時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的累積而使累積評(píng)分達(dá)到0或低于0時(shí)；或達(dá)到任一序列的末端時(shí)。blast算法參數(shù)w、t和x決定了所述比對(duì)的靈敏度和速度。blast程序(對(duì)于核苷酸序列而言)使用以下默認(rèn)值：字長(zhǎng)(w)11、期望(e)10、blosum62評(píng)分矩陣(參見henikoffandhenikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))比對(duì)、(b)50、期望(e)10、m＝5、n＝-4和雙鏈比較。

優(yōu)選地，通過在至少20個(gè)位置的比較窗中比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來確定“序列同一性百分比”，其中，與用于兩個(gè)序列最佳比對(duì)的參考序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗中的多核苷酸序列的一部分可以包含20％或更少的、通常為5％-15％、或10％-12％的添加或缺失(即，空位)。通過以下來計(jì)算百分比：確定兩個(gè)序列中都存在的相同核酸堿基的位置數(shù)量來產(chǎn)生配對(duì)位置數(shù)，將配對(duì)位置數(shù)除以參考序列中(即窗的大小)的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，有很多核苷酸序列編碼本文所述的多肽。這些多核苷酸中的某些與任何天然基因的核苷酸序列具有低的同源性。雖然如此，本發(fā)明特別考慮到由于密碼子使用中的差異而不同的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。等位基因是由于一個(gè)或多個(gè)諸如核苷酸的缺失、添加和/或取代的突變而改變的內(nèi)源基因。所得到的mrna和蛋白可以，但不需要，具有改變的結(jié)構(gòu)或功能?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定等位基因(例如雜交、擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較)。

因此，在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，使用諸如定點(diǎn)誘變的誘變方法來制備本文所述的多肽的耐受原性變體和/或衍生物。通過該方法，可以通過對(duì)編碼多肽序列的基礎(chǔ)多核苷酸進(jìn)行誘變而在該多肽序列中產(chǎn)生特定的修飾。這些技術(shù)為制備并測(cè)試序列變體提供了簡(jiǎn)易的方法，例如通過在多核苷酸中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列改變而并入一個(gè)或多個(gè)上述的修飾。

定點(diǎn)誘變?cè)试S通過使用能編碼所需突變的dna序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數(shù)量的鄰近核苷酸來產(chǎn)生突變體，所述鄰近核苷酸用于提供大小和序列復(fù)雜性足以在待跨越的缺失位點(diǎn)的兩側(cè)形成穩(wěn)定雙螺旋的引物序列?？梢栽谒x的多核苷酸序列中利用突變來提高、改變、減低、修飾或以其它方式改變?cè)摱嗪塑账嶙陨淼男再|(zhì)和/或改變所編碼的多肽的性質(zhì)、活性、組成、穩(wěn)定性或一級(jí)序列。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明人考慮對(duì)所公開的多核苷酸序列進(jìn)行誘變，從而改變所編碼多肽的一種或多種性質(zhì)，例如多肽的耐受原性。定點(diǎn)誘變技術(shù)是領(lǐng)域內(nèi)公知的，且廣泛用于產(chǎn)生多肽和多核苷酸兩者的變體。例如，定點(diǎn)誘變常用來改變dna分子的特定部分。在這類實(shí)施方案中，利用通常包含約14至約25個(gè)核苷酸或大約長(zhǎng)度的引物，在待改變的序列位點(diǎn)的兩側(cè)均具有約5至約10個(gè)殘基。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，定點(diǎn)誘變技術(shù)通常使用既能以單鏈又能以雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于定點(diǎn)誘變中的典型載體包括諸如m13噬菌體的載體。這些噬菌體容易買到，并且其使用通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。雙鏈質(zhì)粒也常用于定點(diǎn)誘變中，其排除了將目的基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)入噬菌體中的步驟。

通常，首先通過獲得單鏈載體或雙鏈載體的解鏈的兩條鏈來進(jìn)行本文的定點(diǎn)誘變，所述載體在其序列中包含編碼所需肽的dna序列。通常通過合成法制備攜帶所需突變序列的寡核苷酸引物。然后將該引物與單鏈載體退火，并利用諸如大腸桿菌聚合酶iklenow片段的酶進(jìn)行dna聚合，從而完成突變攜帶鏈的合成。因此，形成其中一條鏈編碼原始非突變序列和第二鏈攜帶所需突變的異源雙螺旋。然后，用該該異源雙螺旋載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇包含攜帶突變序列排列的重組載體的克隆。

利用定點(diǎn)誘變制備編碼所選肽的序列變體的dna節(jié)段提供了一種產(chǎn)生具有潛在用途的種類的工具，并且這并不意味著是受限的，因?yàn)檫€有可以獲得肽的序列變體和編碼該變體的dna序列的其它方式。例如，可以用諸如羥胺的誘變劑處理編碼所需肽序列的重組載體，從而獲得序列變體。關(guān)于這些方法和方案的具體詳述見于maloyetal.,1994；segal,1976；prokopandbajpai,1991；kuby,1994；和maniatisetal.,1982的教導(dǎo)，將每一篇通過引用并入本文，用于該目的。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸定點(diǎn)誘變方法”是指模板依賴的過程和載體介導(dǎo)的增殖，該增殖導(dǎo)致特定核酸分子的濃度相對(duì)于其初始濃度有所提高，或?qū)е驴蓹z測(cè)信號(hào)濃度的提高，例如擴(kuò)增。本文所用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸定點(diǎn)誘變方法”意指涉及引物分子的模板依賴性延伸的過程。術(shù)語(yǔ)模板依賴的過程是指rna或dna分子的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列由公知的互補(bǔ)性堿基配對(duì)原則決定(參見例如，watson,1987)。通常，載體介導(dǎo)的方法涉及將核酸片段導(dǎo)入dna或rna載體中、載體的克隆擴(kuò)增和擴(kuò)增核酸片段的回收。美國(guó)專利第4,237,224號(hào)提供了這類方法的實(shí)例，通過引用將其全文并入本文。

在用于產(chǎn)生本發(fā)明多肽變體的另一方法中，可以利用如美國(guó)專利第5,837,458號(hào)所述的循環(huán)序列重組。在該方法中，進(jìn)行重組和篩選或選擇的重復(fù)循環(huán)，從而“演化出”本發(fā)明的具有例如增強(qiáng)的耐受原活性的個(gè)體多核苷酸變體。

在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明多肽或其融合蛋白或功能等同物的多核苷酸序列或多核苷酸序列片段可以用于重組dna分子中，從而指導(dǎo)多肽在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。由于遺傳密碼內(nèi)在的簡(jiǎn)并性，可以產(chǎn)生編碼基本上相同的或功能上等同氨基酸序列的其它dna序列，并且這些序列可以用來克隆和表達(dá)給定的多肽。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解地，在一些情況下，產(chǎn)生具有非天然存在的密碼子的編碼多肽的核苷酸序列是有利的。例如，可以選擇特定原核生物或真核生物宿主所偏好的密碼子來增加蛋白表達(dá)率或產(chǎn)生具有所需特性的重組rna轉(zhuǎn)錄本，所述所需特性例如比天然存在的序列所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本更長(zhǎng)的半衰期。

此外，可以使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法改造本發(fā)明的多核苷酸序列，從而為了多種原因改變多肽編碼序列，包括但不限于修飾基因產(chǎn)物的克隆、加工和/或表達(dá)的改變。例如，通過隨機(jī)斷裂和基因片段和合成寡核苷酸的pcr組裝而進(jìn)行的dna改組可用來改造核苷酸序列。此外，定點(diǎn)誘變可用來插入新的限制性位點(diǎn)、改變糖基化模式、改變密碼子偏好性、產(chǎn)生剪接變體或?qū)胪蛔兊取?/p>

在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，天然的、修飾的或重組的核酸序列可連接至異源序列，從而編碼融合蛋白。例如，為了篩查作為多肽活性抑制劑的肽文庫(kù)，編碼能用商購(gòu)抗體識(shí)別的嵌合蛋白可能是有用的。還可以對(duì)融合蛋白進(jìn)行改造使之在多肽編碼序列和異源蛋白序列之間含有切割位點(diǎn)，以便該多肽可被切割并從所述異源部分純化出來。

可以利用領(lǐng)域內(nèi)公知的化學(xué)方法全部或部分合成編碼所需多肽的序列(參見caruthers,m.h.etal.(1980)nucl.acidsres.symp.ser.215-223,horn,t.etal.(1980)nucl.acidsres.symp.ser.225-232)。可選擇地，可以利用合成多肽氨基酸序列或其一部分的方法來產(chǎn)生蛋白本身。例如，可以利用多種固相技術(shù)進(jìn)行肽合成(roberge,j.y.etal.(1995)science269:202-204)，并且例如利用abi431a肽合成儀(perkinelmer,paloalto,ca)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成。

可以利用制備型高效液相色譜(例如，creighton,t.(1983)proteins,structuresandmolecularprinciples,whfreemanandco.,newyork,n.y.)或領(lǐng)域內(nèi)可用的其它類似技術(shù)來基本上純化新合成的肽?？梢酝ㄟ^氨基酸分析或測(cè)序(例如，edman降解法)來確認(rèn)合成肽的組成。此外，在直接合成和/或利用化學(xué)方法與來自其它蛋白的序列或序列的任何部分進(jìn)行組合的過程中，多肽的氨基酸序列或其任何部分可被改變，從而產(chǎn)生變體多肽。

為了表達(dá)所需的多肽，可以將編碼多肽的核苷酸序列或功能等同物插入合適的表達(dá)載體中，即包含插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法構(gòu)建含有編碼目的多肽的序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括：體外重組dna技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。這些技術(shù)例如描述于sambrook,j.etal.(1989)molecularcloning,alaboratorymanual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè))和ausubeletal.(2001-2008currentprotocolsinmolecularbiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)),greenepubl.assoc.inc.&johnwiley&sons,inc.,ny,ny)。

多種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)可以用來包含和表達(dá)多核苷酸序列。這些表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)包括但不限于，諸如用重組噬菌體、質(zhì)粒、或粘粒dna表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的微生物；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，camv；煙草花葉病毒tmv)或用細(xì)菌表達(dá)載體(例如，ti或pbr322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。

表達(dá)載體中存在的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是與宿主細(xì)胞蛋白相互作用來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體的那些非翻譯區(qū)(增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5'和3'非翻譯區(qū))。這些元件在它們的強(qiáng)度和特異性上可以不同。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，當(dāng)克隆入細(xì)菌系統(tǒng)時(shí)，可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，諸如pbluescript噬菌粒(stratagene,lajolla,calif.)或psport1質(zhì)粒(gibcobrl,gaithersburg,md.)的雜合lacz啟動(dòng)子等。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，通常優(yōu)選來自哺乳動(dòng)物基因或來自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。如果有必要產(chǎn)生含有編碼多肽的序列的多拷貝的細(xì)胞系，則可以優(yōu)選地使用基于sv40或ebv的、帶有合適的選擇標(biāo)記的載體。

在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)表達(dá)的多肽的希望的用途，可以選擇多種表達(dá)載體中的任何一種。例如，當(dāng)大量需要時(shí)，例如用于誘導(dǎo)抗體時(shí)，可以使用指導(dǎo)容易純化的融合蛋白的高水平表達(dá)的載體。這類載體包括但不限于，諸如pbluescript(stratagene)的多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，其中將編碼目的多肽的序列與載體連接，與氨基末端met和隨后的β-半乳糖苷酶的7個(gè)殘基在同一讀碼框中，以便產(chǎn)生雜合蛋白；pin載體(vanheeke,g.ands.m.schuster(1989)j.biol.chem.264:5503-5509)等。pgex載體(promega,madison,wis.)也可以用來將外源多肽表達(dá)為具有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(gst)的融合蛋白。通常，這類融合蛋白是可溶的，并且可以通過谷胱甘肽瓊脂糖珠的吸附并隨后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫來容易地從裂解的細(xì)胞中純化。這些系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白可以被設(shè)計(jì)為包括肝素、凝血酶或因子xa蛋白酶切割位點(diǎn)，以便任意地從gst部分釋放克隆的目的多肽。

在釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)中，可以使用多種含有諸如α因子、醇氧化酶和pgh的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體。對(duì)于綜述而言，可以參見ausubeletal.(同上)和grantetal.(1987)methodsenzymol153:516-544。

如果使用植物表達(dá)載體，編碼多肽的序列的表達(dá)可以由多種啟動(dòng)子中的任何一種所驅(qū)動(dòng)。例如，諸如camv的35s和19s啟動(dòng)子的病毒啟動(dòng)子可以單獨(dú)使用或與來自tmv的ω前導(dǎo)序列聯(lián)合使用(takamatsu,n.(1987)emboj.6:307-311)?？蛇x擇地，可以使用諸如rubisco的小亞基或熱休克啟動(dòng)子的植物啟動(dòng)子(coruzzi,g.etal.(1984)emboj.3:1671-1680；broglie,r.etal.(1984)science224:838-843；以及winter,j.etal.(1991)resultsprobl.celldiffer.17:85-105)?？梢酝ㄟ^直接的dna轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染將這些構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞。這類技術(shù)描述于很多可普遍獲得的綜述中(參見例如，hobbs,s.ormurry,l.e.inmcgrawhillyearbookofscienceandtechnology(1992)mcgrawhill,newyork,n.y.；pp.191-196)。

還可以用昆蟲系統(tǒng)來表達(dá)目的多肽。例如，在一種這類系統(tǒng)中，將苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(acnpv)用作載體在草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)細(xì)胞或粉紋夜蛾(trichoplusia)幼蟲中表達(dá)外來基因?？梢詫⒕幋a多肽的序列克隆入病毒的非必需區(qū)，例如多角體蛋白基因，并置于多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下。編碼多肽的序列的成功插入會(huì)使多角體蛋白基因失活，并產(chǎn)生缺少衣殼蛋白的重組病毒。隨后，可以將所述重組病毒用于感染例如草地貪夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲，其中目的多肽可以表達(dá)(engelhard,e.k.etal.(1994)proc.natl.acad.sci.91:3224-3227)。

在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，通常可以使用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。例如，如果將腺病毒用作表達(dá)載體，則可以將編碼目的多肽的序列連入由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物中。病毒基因組的非必需e1或e3區(qū)中的插入可以用來獲得能在感染的宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽的活病毒(logan,j.andshenk,t.(1984)proc.natl.acad.sci.81:3655-3659)。此外，可以使用諸如魯斯氏肉瘤病毒(rsv)增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子來增強(qiáng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。

也可以使用特異的起始信號(hào)來實(shí)現(xiàn)編碼目的多肽的序列的更高效的翻譯。這些信號(hào)包括atg起始密碼子和鄰近的序列。如果將編碼多肽的序列、其起始密碼子和上游序列插入合適的表達(dá)載體中，則可以不需要其他的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，如果僅將編碼序列或其一部分插入，則應(yīng)該提供包括atg起始密碼子在內(nèi)的外源翻譯控制信號(hào)。此外，起始密碼子應(yīng)該在正確的讀碼框中以確保全部插入物的翻譯。外源翻譯元件和起始密碼子可以是不同來源的，可以是天然的或合成的。可以通過包含適于所用的特定細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來增強(qiáng)表達(dá)效率，諸如文獻(xiàn)中描述的那些增強(qiáng)子(scharf,d.etal.(1994)resultsprobl.celldiffer.20:125-162)。

此外，可以基于宿主細(xì)胞株調(diào)節(jié)插入的序列的表達(dá)或以所需的方式加工所表達(dá)的蛋白的能力來選擇宿主細(xì)胞株。多肽的這些修飾包括但不限于，乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和?；Ｇ懈畹鞍椎摹扒霸毙问降姆g后加工也可以用來促進(jìn)正確的插入、折疊和/或功能?？梢赃x擇諸如cho、cos、hela、mdck、hek293和wi38的、對(duì)于這類翻譯后活性具有特異性的細(xì)胞體系和特征機(jī)制的不同宿主細(xì)胞，以確保外源蛋白的正確修飾和加工。

為了長(zhǎng)期、高產(chǎn)量地產(chǎn)生重組蛋白，通常優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化穩(wěn)定表達(dá)目的多核苷酸的細(xì)胞系，所述表達(dá)載體可以在同一載體或分別的載體上含有病毒復(fù)制起點(diǎn)和/或內(nèi)源表達(dá)元件以及選擇標(biāo)記基因。引入載體后，在將細(xì)胞轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基之前，可以允許細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天。選擇標(biāo)記的目的是賦予對(duì)于選擇的抗性，并且選擇標(biāo)記的存在允許成功表達(dá)引入的序列的細(xì)胞的生長(zhǎng)和恢復(fù)?？梢杂眠m合細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的抗性克隆。

可以用任何數(shù)量的選擇系統(tǒng)來恢復(fù)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。這些選擇系統(tǒng)包括但不限于，可以分別在tk^－細(xì)胞或aprt^－細(xì)胞中使用的單純皰疹病毒胸苷激酶(wigler,m.etal.(1977)cell11:223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(lowy,i.etal.(1990)cell22:817-23)。此外，抗代謝物、抗生素或除草劑抗性可以被用作選擇的基礎(chǔ)；例如，賦予對(duì)氨甲喋呤的抗性的dhfr(wigler,m.etal.(1980)proc.natl.acad.sci.77:3567-70)；賦予對(duì)氨基糖苷類、新霉素和g-418的抗性的npt(colbere-garapin,f.etal(1981)j.mol.biol.150:1-14)；以及分別賦予對(duì)氯磺隆和草胺磷乙酰轉(zhuǎn)移酶的抗性的als或pat(murry，同上)。其它選擇基因已有描述，例如，允許細(xì)胞利用吲哚來代替色氨酸的trpb，或允許細(xì)胞利用組胺醇來代替組氨酸的hisd(hartman,s.c.andr.c.mulligan(1988)proc.natl.acad.sci.85:8047-51)?？梢晿?biāo)志物已獲得普遍應(yīng)用，這類標(biāo)志物如花青素、β-葡糖苷酸酶及其底物gus、以及熒光素酶及其底物熒光素，這類標(biāo)記不僅廣泛用于鑒定轉(zhuǎn)化株，而且用于對(duì)歸因于特異性載體系統(tǒng)的瞬時(shí)或穩(wěn)定蛋白表達(dá)進(jìn)行定量(rhodes,c.a.etal.(1995)methodsmol.biol.55:121-131)。

盡管標(biāo)志基因表達(dá)的存在與否能提示同時(shí)存在目的基因，但是標(biāo)志基因的存在和表達(dá)需要被證實(shí)。例如，如果將編碼多肽的序列插入標(biāo)志基因序列中，則可以通過標(biāo)志基因功能的缺失來鑒定含有序列的重組細(xì)胞?？蛇x擇地，可以將標(biāo)志基因與編碼多肽的序列串聯(lián)置于一個(gè)啟動(dòng)子的控制下。標(biāo)志基因響應(yīng)于誘導(dǎo)或選擇的表達(dá)通常能同時(shí)表明串聯(lián)基因的表達(dá)。

可選擇地，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法來識(shí)別含有并表達(dá)所需多核苷酸序列的宿主細(xì)胞。這些方法包括但不限于，dna-dna或dna-rna雜交和蛋白生物測(cè)定或免疫測(cè)定技術(shù)，蛋白生物測(cè)定或免疫測(cè)定技術(shù)包括例如，用于對(duì)核酸或蛋白進(jìn)行檢測(cè)和/或定量的基于膜、溶液或芯片的技術(shù)。

使用對(duì)產(chǎn)物特異的多克隆或單克隆抗體檢測(cè)和測(cè)量多核苷酸編碼的產(chǎn)物的表達(dá)的多種方法在領(lǐng)域內(nèi)是已知的。實(shí)例包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、放射性免疫測(cè)定(ria)和熒光活化細(xì)胞分選(facs)。利用與給定多肽上的兩個(gè)非干擾表位起反應(yīng)的單克隆抗體的基于雙點(diǎn)、單克隆的免疫測(cè)定對(duì)于某些應(yīng)用可以是優(yōu)選的，但是還可以利用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。這些測(cè)定和其他測(cè)定描述于hampton,r.etal.(1990；serologicalmethods,alaboratorymanual(血清學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)),apspress,stpaul.minn.)和maddox,d.e.etal.(1983；j.exp.med.158:1211-1216)等中。

廣泛多種的標(biāo)記物和綴合技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以用于各種核酸和氨基酸測(cè)定中。產(chǎn)生用于檢測(cè)多核苷酸相關(guān)序列的標(biāo)記的雜交或pcr探針的手段包括寡核苷酸標(biāo)記、缺口平移、末端標(biāo)記或使用標(biāo)記的核苷酸的pcr擴(kuò)增?？蛇x擇地，可以將序列或其任何部分克隆入載體中，用于產(chǎn)生mrna探針。這類載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且是可商業(yè)購(gòu)得的，并且可以通過添加諸如t7、t3或sp6的合適的rna聚合酶和標(biāo)記的核苷酸來體外合成rna探針。可以使用多種可商業(yè)購(gòu)得的試劑盒進(jìn)行這些步驟。可以使用的合適的報(bào)告分子或標(biāo)記包括放射性核素、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑或產(chǎn)色劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。

可以在適合蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和回收的條件下，培養(yǎng)用目的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。根據(jù)序列和/或所用的載體，重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白可以是分泌的或包含在細(xì)胞內(nèi)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解地，可以將包含本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)載體設(shè)計(jì)為包含指導(dǎo)編碼的多肽通過原核生物或真核生物細(xì)胞膜的分泌的信號(hào)序列?？梢杂闷渌闹亟M構(gòu)造，將編碼目的多肽的序列與編碼有助于可溶蛋白純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列連接起來。這類有助于純化的結(jié)構(gòu)域包括但不限于，允許對(duì)固定化金屬進(jìn)行純化的諸如組氨酸-色氨酸模塊的金屬螯合肽、允許對(duì)固定化免疫球蛋白進(jìn)行純化的蛋白a結(jié)構(gòu)域和在flags延伸/親和純化系統(tǒng)中所用的結(jié)構(gòu)域(immunexcorp.,seattle,wash.)。在純化結(jié)構(gòu)域和所編碼的多肽之間包含可切割連接物序列，諸如對(duì)因子xa或腸激酶特異的那些序列(invitrogen.sandiego,calif.)，可用于促進(jìn)純化。一種這類表達(dá)載體提供了這樣的融合蛋白的表達(dá)，該融合蛋白含有目的多肽和編碼6個(gè)組氨酸殘基的核酸，以及位于核酸之后的硫氧還蛋白或腸激酶切割位點(diǎn)。如在porath,j.etal.(1992,prot.exp.purif.3:263-281)中所述，組氨酸殘基有助于在imiac(固定化金屬離子親和層析)上進(jìn)行純化，而腸激酶切割位點(diǎn)提供了一種從融合蛋白純化所需多肽的方法。對(duì)含有融合蛋白的載體的討論提供在kroll,d.j.etal.(1993；dnacellbiol.12:441-453)中。

除了重組產(chǎn)生方法，可以通過使用固相技術(shù)的直接肽合成來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽及其片段(merrifieldj.(1963)j.am.chem.soc.85:2149-2154)。可以用手動(dòng)技術(shù)或通過自動(dòng)化來進(jìn)行蛋白合成。例如，可以用appliedbiosystems的431a肽合成儀(perkinelmer)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成?？蛇x擇地，可以分別地化學(xué)合成不同片段并使用化學(xué)方法將片段組合來產(chǎn)生全長(zhǎng)分子。

耐受

免疫耐受被定義為對(duì)抗原，通常是參與引起疾病的抗原的免疫無應(yīng)答。盡管耐受可以通過不同途徑給予抗原來誘導(dǎo)，但是口服耐受是指抗原的口服給藥，這已經(jīng)在數(shù)種動(dòng)物模型中導(dǎo)致疾病活動(dòng)的抑制，包括實(shí)驗(yàn)自身免疫性腦脊髓炎——多發(fā)性硬化的嚙齒動(dòng)物模型、重癥肌無力、葡萄膜炎、胰島素依賴型糖尿病和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(fariaandweiner1999)。來自人類臨床試驗(yàn)的早期結(jié)果表明，口服耐受在自身免疫性葡萄膜炎、糖尿病、鎳過敏癥以及可能在多發(fā)性硬化中都是有效的(fariaandweiner1999；dudaetal.2000)。有數(shù)項(xiàng)研究報(bào)道了在器官移植中誘導(dǎo)口服耐受(sayeghetal.1996；hancocketal.1993；ishidoetal.1999；sayeghetal.1992a；sayeghetal.1992b)。在每篇報(bào)道中，通過在移植之前食用供體mhc來源的肽或食用異源細(xì)胞來誘導(dǎo)耐受(sayeghetal.1996；hancocketal.1993；ishidoetal.1999；sayeghetal.1992a；sayeghetal.1992b)。這些技術(shù)可有效預(yù)防對(duì)心臟和角膜同種移植物的排斥(sayeghetal.1996；hancocketal.1993；ishidoetal.1999；sayeghetal.1992a；sayeghetal.1992b；fariaandweiner1999)。在這些研究中，除了降低疾病活動(dòng)之外，由口服耐受所誘導(dǎo)的免疫抑制還可以通過響應(yīng)于靶抗原的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(dth)的下調(diào)以及細(xì)胞免疫和體液免疫的減弱來衡量(fariaandweiner1999；mayer2000；garsideandmowat1997)。

口服(和其它給藥途徑)耐受通過以下三種機(jī)制下調(diào)抗原特異的免疫應(yīng)答：1.抗原特異性細(xì)胞的活性抑制、2.抗原特異性細(xì)胞的克隆無反應(yīng)和3.抗原特異性細(xì)胞的克隆排除(fariaandweiner1999,milleretal.1991；chenetal.1994；chenetal.1995)。盡管所有三種機(jī)制可以在響應(yīng)于口服耐受時(shí)同時(shí)起作用，但是活性抑制和克隆無反應(yīng)是口服耐受所誘導(dǎo)的免疫抑制的關(guān)鍵機(jī)制(fariaandweiner1999)。

活性抑制描述的是一種淋巴細(xì)胞亞類以抗原特異的方式受到另一種物質(zhì)的調(diào)節(jié)。根據(jù)抗原和疾病狀態(tài)，抑制細(xì)胞可以是cd4+和/或cd8+t淋巴細(xì)胞，其從諸如脾或周圍淋巴結(jié)的外周淋巴組織遷移至疾病活動(dòng)位點(diǎn)。將這些細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至天然接受者已經(jīng)證實(shí)這些細(xì)胞對(duì)卵白蛋白誘導(dǎo)的超敏性和多發(fā)性硬化的嚙齒動(dòng)物模型中活性抑制的作用。由以下數(shù)據(jù)證實(shí)活性抑制的體外證據(jù)，來自動(dòng)物的耐受淋巴細(xì)胞能跨越transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)抑制其它抗原特異性t淋巴細(xì)胞的增殖(fariaandweiner1999；milleretal.1991)。

克隆無反應(yīng)是指抗原特異性t淋巴細(xì)胞的無應(yīng)答，其特征為暴露于抗原之后增殖減弱，并且參與數(shù)種動(dòng)物模型的口服耐受。無反應(yīng)可能是由cd4+或cd8+t淋巴細(xì)胞自身、局部環(huán)境中其它t淋巴細(xì)胞或細(xì)胞所產(chǎn)生的可溶性抑制因子的結(jié)果，或者是因?yàn)楹线m輔刺激分子的表達(dá)降低(fariaandweiner1999)?？寺∨懦侵溉コ乖禺愋詔淋巴細(xì)胞，但是很少有報(bào)道是作為抗原口服耐受的機(jī)制(chenetal.1995)。

在口服耐受期間抑制免疫應(yīng)答的可溶性調(diào)節(jié)物主要來源于調(diào)節(jié)性或抑制性t淋巴細(xì)胞(fariaandweiner1999)。有五類t淋巴細(xì)胞通過其產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行描述：產(chǎn)生白細(xì)胞介素-2(il-2)和γ干擾素(γifn)的th1型；產(chǎn)生il-4和il-10的th2型；單獨(dú)產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tgf-β)或聯(lián)合產(chǎn)生非常低水平的il-4、il-10或γifn的th3型；產(chǎn)生高水平的il-10和低水平的tgf-β的tr1細(xì)胞(fariaandweineretal.1999；mayer2000；garsideandmowat1997；grouxetal.1997)；以及產(chǎn)生il-17的th17細(xì)胞(參見例如，immunolrev.2008,226:87-102；nature.2006may11；441(7090):235-8)。由于th3、th2和tr1-t淋巴細(xì)胞已被證實(shí)是口服耐受所誘導(dǎo)的活性抑制的主要調(diào)節(jié)物，所以tgf-β、il-4和il-10被認(rèn)為是該過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子(tengetal.1998；shietal.1999b)。來自baroneetal.等顯示在不存在這些細(xì)胞因子下所發(fā)生的口服耐受誘導(dǎo)的報(bào)道提示，其它調(diào)節(jié)物或細(xì)胞也能抑制免疫應(yīng)答(baroneetal.1998；shietal.1999a)。

盡管針對(duì)口服耐受的研究集中在抑制免疫應(yīng)答的t淋巴細(xì)胞來源的細(xì)胞因子，但是并非由t淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮已知是同種免疫應(yīng)答的有效抑制劑(garsideandmowat1997)。表明一氧化氮調(diào)節(jié)凋亡(其參與排斥應(yīng)答)的這些數(shù)據(jù)和其它數(shù)據(jù)(meyeretal.1998；kallioetal.1997；shiraishietal.1997；shiraishietal.1995；medot-pirenneetal.1999)提示一氧化氮可能是口服耐受的調(diào)節(jié)物并且阻止排斥應(yīng)答。tgf-β是一氧化氮合成的有效誘導(dǎo)物，并且是口服耐受中活性抑制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物(fariaandweiner1999；meyeretal.1998；vodovotzetal.1998；vodovitzetal.1999)。因此，在耐受宿主中由tgf-β誘導(dǎo)的免疫抑制在一定程度上可以由一氧化氮調(diào)節(jié)。然而，一氧化氮響應(yīng)于口服耐受的產(chǎn)生是未知的。

由apc誘導(dǎo)的抗原特異性t淋巴細(xì)胞的激活需要t淋巴細(xì)胞和apc之間的雙向相互作用。最初，apc呈遞與t細(xì)胞受體結(jié)合的mhc分子，這刺激t淋巴細(xì)胞上cd40-配體(cd40l)表達(dá)的上調(diào)。cd40l轉(zhuǎn)而與其受體，位于apc上的cd40結(jié)合。通過cd40的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)apc上cd80和cd86的表達(dá)，它們一旦與其受體，t淋巴細(xì)胞上的cd28結(jié)合，就會(huì)導(dǎo)致共刺激和隨后的t淋巴細(xì)胞激活(liuetal.1999；lietal.1999；ledermanandsiciu-foca1999)。盡管對(duì)口服耐受誘導(dǎo)的研究集中在t淋巴細(xì)胞功能上，最近來自taamsetal(1998)的研究報(bào)道了耐受誘導(dǎo)可以影響apc的功能，這與其他研究者的數(shù)據(jù)相似(wuetal.1998；finkelmanetal.1996；vineyetal.1998)。例如，wu.etal(1998)的報(bào)道顯示來自口服耐受小鼠淋巴結(jié)和脾的apc上cd80的表達(dá)降低，這提示無效的apc可有助于耐受接受者中受損t淋巴細(xì)胞的激活。此外，體外研究顯示抑制性t淋巴細(xì)胞能抑制apc中cd86的表達(dá)，這突出耐受如何誘導(dǎo)受損apc功能的另一機(jī)制(liuetal.1999；lietal.1999；ledermanandsiciu-foca1999)。

col(v)的給予除了能防止對(duì)自身的增殖應(yīng)答之外，還能防止對(duì)同種抗原的增殖應(yīng)答，并且能防止接受者肺部急性排斥病理的發(fā)展(參見例如，美國(guó)專利第7,348,005號(hào)；wo2007/120947)。因此，col(v)可以誘導(dǎo)對(duì)供體同種抗原和對(duì)自身的無反應(yīng)，或可選擇地，對(duì)供體抗原和對(duì)colv的增殖應(yīng)答的缺乏可能是由于同種抗原特異性肺淋巴細(xì)胞的克隆排除；或者可選地，可能是由于抑制細(xì)胞的活性。

不希望受理論的束縛，由colv誘導(dǎo)的耐受可以通過相關(guān)的抑制進(jìn)行誘導(dǎo)(參見例如，humimmunol.2008nov；69(11):715-20)。而且，認(rèn)為colv與淋巴細(xì)胞上膠原受體的差異結(jié)合導(dǎo)致可以涉及差異激活信號(hào)(參見例如，cellsignal.2006aug；18(8):1108-16)。例如，只有v型膠原誘導(dǎo)t細(xì)胞中的il-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

抗原的口服給藥是誘導(dǎo)周圍t細(xì)胞耐受性的有效方法。這種現(xiàn)象通常被稱為口服耐受，已經(jīng)在多種動(dòng)物自身免疫疾病模型中進(jìn)行了良好的研究，包括腦脊髓炎、葡萄膜炎、糖尿病、重癥肌無力和關(guān)節(jié)炎。然而，對(duì)誘導(dǎo)耐受的機(jī)制還不完全了解。所有已知的耐受誘導(dǎo)機(jī)制，包括克隆無反應(yīng)、克隆排除和受il-4、il-10或tgf-β調(diào)節(jié)介導(dǎo)的活性抑制都可以在口服耐受中發(fā)揮作用(fariaandweiner,1999)。通常，較高劑量的抗原被報(bào)道能誘導(dǎo)無反應(yīng)或克隆排除(chenetal.,1995；whitacreetal.,1991)，而低劑量能誘導(dǎo)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)和活性抑制(fariaandweiner,1999；chenetal.,1994)。在心臟移植的動(dòng)物模型中，同種脾細(xì)胞的口服給藥被證實(shí)在旁路th1激活和選擇性刺激誘導(dǎo)th-2來源的抑制性細(xì)胞因子(例如il-4)的耐受誘導(dǎo)中是有效的(hancocketal.,1993；ishidoetal.,1999)。

因此，口服耐受是通過向個(gè)體口服給藥抗原(即通過食用)來下調(diào)免疫應(yīng)答的方法。口服耐受的特征為系統(tǒng)性抗體產(chǎn)生的水平降低以及遲發(fā)型超敏反應(yīng)(dth)、t細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性反應(yīng)和移植排斥減弱(alpanetal.2001.j.immunol.166:4843-52；chenetal.1995.nature376:177-80；weiner.1997.imm.today.7:335-44；sayeghetal.1992.transplantation.53:163-6)。

本文還考慮用于誘導(dǎo)耐受的其它途徑，尤其是通過肌肉內(nèi)注射、皮下注射、皮內(nèi)注射和靜脈內(nèi)注射。本文在低劑量易于誘導(dǎo)耐受和高劑量能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的情況下考慮皮內(nèi)注射。s

對(duì)耐受的研究主要集中在耐受性抗原對(duì)t淋巴細(xì)胞功能的影響和t淋巴細(xì)胞在抑制免疫激活中的作用上(fariaandweiner1999；mayer2000；garsideandmowat1997)。然而，對(duì)任何抗原的免疫應(yīng)答需要apc和t淋巴細(xì)胞之間的相互作用，并且t淋巴細(xì)胞可以影響apc的功能(liuetal.1999；lietal.1999；ledermanandsiciu-foca1999)。因此，由來自耐受宿主的apc所呈遞的下調(diào)的抗原對(duì)于耐受誘導(dǎo)的貢獻(xiàn)可以間接地由于與抑制性t淋巴細(xì)胞的相互作用，或者可能由于耐受抗原對(duì)apc的直接影響。

因此，在本發(fā)明的某些方面中，本發(fā)明提供了恢復(fù)或增強(qiáng)copd和哮喘患者對(duì)colv的自我耐受的方法。一個(gè)實(shí)施方案是通過口服療法給予colv(yasufukuetal,2001；yasufuku,etal,2002)使其通過間隙進(jìn)入肺中或通過給藥方案上的其它脫敏策略來治療copd或哮喘的方法，所述給藥方案被設(shè)計(jì)成用于增強(qiáng)患者對(duì)膠原(包括但不必要限制于colv及其抗原性成分和變體)的耐受性。

“耐受原性片段”表示能誘導(dǎo)對(duì)全長(zhǎng)蛋白的耐受性的片段，該片段是所述全長(zhǎng)蛋白的片段(例如，全長(zhǎng)v型膠原及其耐受原性片段)。在某些實(shí)施方案中，耐受原性片段至少可以誘導(dǎo)對(duì)全長(zhǎng)v型膠原的耐受性，以及全長(zhǎng)v型膠原蛋白可以并且在某些實(shí)施方案中在誘導(dǎo)耐受性上可以比全長(zhǎng)膠原蛋白更加有效。然而，在某些實(shí)施方案中，耐受原性片段誘導(dǎo)對(duì)全長(zhǎng)v型膠原的耐受性，但是可以不會(huì)與全長(zhǎng)v型膠原蛋白同樣有效地誘導(dǎo)耐受性。這種耐受原性片段仍然可以用在本發(fā)明中，尤其當(dāng)所述耐受原性片段具有其它優(yōu)勢(shì)時(shí)，例如與全長(zhǎng)蛋白相比便制備或純化。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的，多種已知的測(cè)定可用于評(píng)價(jià)耐受性的誘導(dǎo)，包括檢測(cè)延遲型超敏反應(yīng)(dth)應(yīng)答、通過elisa或其它方法檢測(cè)細(xì)胞因子產(chǎn)生、t細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性測(cè)定、b細(xì)胞增殖測(cè)定、抗體產(chǎn)生等。這類測(cè)定是領(lǐng)域內(nèi)已知的，并且例如描述于currentprotocolsinimmunology(現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)),editedby:johne.coligan,adam.kruisbeek,davidh.margulies,ethanm.shevach,warrenstrober(2001johnwiley&sons,ny,ny)；ausubeletal.(2001currentprotocolsinmolecularbiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)),greenepubl.assoc.inc.&johnwiley&sons,inc.,ny,ny)；美國(guó)專利第7,348,005號(hào)中以及其它地方。

因此，耐受原性片段是諸如v型膠原或其任何一種或多種α鏈的耐受原性多肽的片段，該片段本身對(duì)于通過b細(xì)胞和/或t細(xì)胞的表面受體(例如，b細(xì)胞抗體受體或t細(xì)胞受體)來識(shí)別多肽的特異性b細(xì)胞和/或t細(xì)胞而言在免疫學(xué)上是耐受原性的(即誘導(dǎo)耐受性)。通常利用公知的技術(shù)來鑒定耐受原性片段，例如paul,fundamentalimmunology,3rded.,(ravenpress,1993)中以及其中所引用的參考文獻(xiàn)中所總結(jié)的那些技術(shù)。這類技術(shù)包括篩查有能力降低t細(xì)胞和/或b細(xì)胞反應(yīng)性的多肽。如本文所用，如果抗血清和抗體與抗原特異結(jié)合(即它們與elisa或其它免疫測(cè)定中的蛋白特異性地反應(yīng)并且與不相關(guān)的蛋白不發(fā)生可檢測(cè)到的反應(yīng))，則它們是“抗原特異性的”。可以按本文所述和利用公知技術(shù)來制備這類抗血清和抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽的耐受原性片段是以基本上不低于全長(zhǎng)多肽的耐受原活性的水平誘導(dǎo)b細(xì)胞和/或t細(xì)胞耐受性的一部分(例如，在諸如抗體產(chǎn)生的合適的測(cè)定中，可以通過elisa檢測(cè)和/或t細(xì)胞反應(yīng)性測(cè)定(t細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生測(cè)定)。優(yōu)選地，耐受原性部分的耐受原活性水平為全長(zhǎng)多肽耐受原活性的至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或高于約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些實(shí)例中，鑒定耐受原活性水平大于對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)多肽耐受原活性水平的耐受原性片段，例如，具有高于約100％、110％、120％、130％、140％或150％或更高的耐受原活性。

在某些實(shí)施方案中，可以利用計(jì)算機(jī)分析鑒定耐受原性片段，例如tsites程序(參見rothbardandtaylor,emboj.7:93-100,1988；deavinetal.,mol.immunol.33:145-155,1996)，其搜索具有激發(fā)th應(yīng)答潛能的肽基序?？梢园凑誦imas(parkeretal.,j.immunol.152:163,1994)和其它hla肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析來鑒定具有適于結(jié)合鼠和人i類或ii類mhc的基序的ctl肽?？蛇x擇地，可以利用確定的肽結(jié)合基序來鑒定與特定mhc分子結(jié)合的部分，例如rammenseeetal.,immunogenetics41:178-228,1995中所描述的那些基序。為了確認(rèn)與鼠和人i類或ii類mhc分子結(jié)合的肽，可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的肽結(jié)合測(cè)定。為了證實(shí)免疫原性或耐受原性，可以利用hlaa2或其它轉(zhuǎn)基因小鼠模型和/或利用樹突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或外周血細(xì)胞的體外刺激測(cè)定來測(cè)試肽。

應(yīng)當(dāng)指出，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的耐受原性片段還是免疫原性片段。在這方面中，如同本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的，高免疫原性片段，例如類似于colv的蛋白的優(yōu)勢(shì)免疫表位，當(dāng)正確給予時(shí)(例如，通常以低劑量持續(xù)一段時(shí)間)可以是耐受原性的。因此，本發(fā)明還考慮colv的免疫原性片段的鑒定和使用，其中這類免疫原性片段可用來誘導(dǎo)耐受性。在這方面中，免疫原性部分的免疫原活性水平為全長(zhǎng)多肽免疫原活性的至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或大于約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些實(shí)例中，鑒定免疫原活性水平大于對(duì)應(yīng)全長(zhǎng)多肽免疫原活性水平的免疫原性片段，例如，具有高于約100％、110％、120％、130％、140％或150％或更高的免疫原活性。

用來鑒定免疫原性片段的分析可以與用來鑒定耐受原性片段的分析一樣，包括利用諸如tsites程序(參見rothbardandtaylor,emboj.7:93-100,1988；deavinetal.,mol.immunol.33:145-155,1996)的計(jì)算機(jī)分析，所述tsites程序搜索具有激發(fā)th應(yīng)答潛能的肽基序?？梢园凑誦imas(parkeretal.,j.immunol.152:163,1994)和其它hla肽結(jié)合預(yù)測(cè)分析來鑒定具有適于結(jié)合鼠和人i類或ii類mhc的基序的ctl肽?？蛇x擇地，可以利用確定的肽結(jié)合基序來鑒定與特定mhc分子結(jié)合的部分，例如rammenseeetal.,immunogenetics41:178-228,1995中所描述的那些基序。為了確認(rèn)與鼠和人i類或ii類mhc分子結(jié)合的肽，可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的肽結(jié)合測(cè)定。為了證實(shí)免疫原性或耐受原性，可以利用hlaa2或其它轉(zhuǎn)基因小鼠模型和/或利用樹突細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或外周血細(xì)胞的體外刺激測(cè)定來測(cè)試肽。

本發(fā)明的方法中考慮使用完整的v型膠原或其具有耐受原或免疫原活性的成分α鏈的任何一種或多種。因此，v型膠原的耐受原性片段或免疫原性片段可以指完整v型膠原的片段或可以指任何一種成分α鏈的耐受原性或免疫原性片段。在某些實(shí)施方案中，本文所用的colv可以包含由三種α鏈組成的膠原分子。在其它實(shí)施方案中，colv可以包含α鏈的任何一種或多種，例如由seqidno:1、3或5所示的多核苷酸所編碼的seqidno:2、4或6所示的那些α鏈或這些α鏈的耐受原性片段或免疫原性片段。

在某些實(shí)施方案中，兩種或更多種耐受原性或免疫原性片段可以被同時(shí)使用、單獨(dú)給予、混在組合物中或作為融合蛋白。在這方面中，任何數(shù)量的耐受原性片段或免疫原性片段可用來誘導(dǎo)對(duì)colv的耐受性，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種耐受原性或免疫原性片段作為單獨(dú)的片段處于組合物中或作為融合蛋白(具有或不具有連接物)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以使用11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多種片段。

按照某些實(shí)施方案，可以利用多種免疫測(cè)定方法中的任何一種，例如通過elisa方法來完成對(duì)抗膠原抗體存在的檢測(cè)。如同通過參考標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定教科書所看到的，可以利用大量的免疫測(cè)定技術(shù)，這些包括但不限于非競(jìng)爭(zhēng)類型的單點(diǎn)和雙點(diǎn)或“夾心”測(cè)定以及傳統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。

夾心測(cè)定是最有用且常用的基于抗體的測(cè)定方法，并且可用來實(shí)施多個(gè)實(shí)施方案。夾心測(cè)定技術(shù)存在大量變型，并且所有都意圖包括在各實(shí)施方案中。簡(jiǎn)單而言，在用于檢測(cè)樣品中的抗體的典型測(cè)定中，將非標(biāo)記的抗原固定在固相基底上，并將待檢驗(yàn)的樣品與結(jié)合的抗原分子接觸。在一段合適的孵育時(shí)間，即持續(xù)足以允許形成抗體-抗原復(fù)合物的時(shí)間段之后，添加諸如抗人igg的二抗(標(biāo)記有能產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告分子)，并孵育，允許足以形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體的時(shí)間。洗掉任何未反應(yīng)的物質(zhì)，并通過觀察所述報(bào)告分子所產(chǎn)生的信號(hào)來測(cè)定樣品中待檢測(cè)的抗體的存在。例如通過簡(jiǎn)單觀察可視信號(hào)結(jié)果可以是定性的，或者通過將目的樣品所產(chǎn)生的信號(hào)與含有已知量的待檢測(cè)抗體的對(duì)照樣品進(jìn)行比較，可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。這種測(cè)定的變型包括同時(shí)測(cè)定，其中樣品和標(biāo)記抗體被同時(shí)添加到結(jié)合的抗原上。這些技術(shù)是公知的，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任何微小變型。在典型的夾心測(cè)定中，抗原是固定的，例如被共價(jià)或被動(dòng)地連接于固相表面。在一些實(shí)施方案中，所述固相表面通常為玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持體可以是管、珠、盤或微型板的形式或適于進(jìn)行免疫測(cè)定的其它任何表面。多種結(jié)合方法是領(lǐng)域內(nèi)已知的，并且通常由抗原與給定表面的交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合或物理吸附組成。然后在用于添加測(cè)驗(yàn)樣品的配制液中洗滌固定的抗原。然后將待測(cè)驗(yàn)的樣品等分與固定的抗原接觸，并在合適的條件(例如25℃)下孵育足以允許任何抗體與樣品中存在的膠原結(jié)合的時(shí)間段(例如2-40分鐘)。接觸時(shí)間的實(shí)際長(zhǎng)度、緩沖液條件、溫度等是易于調(diào)整的參數(shù)，并且對(duì)于給定的測(cè)驗(yàn)通常是容易獲得的。孵育之后，洗滌包含任何結(jié)合抗體的固定的抗原并干燥，并與所述結(jié)合抗體特異的二抗一起孵育，所述二抗例如抗人igg。二抗與用來指示二抗與抗體-固定的抗原復(fù)合物的結(jié)合的報(bào)告分子相連。

一種用于檢測(cè)抗colv抗體的特定方法描述于wo2007/120947中。具體而言，該珠子測(cè)定檢測(cè)抗v型膠原抗體，所述抗體可以存在于患自身免疫應(yīng)答v型膠原的患者的血清和/或肺灌洗液中。為該項(xiàng)測(cè)定提供v型膠原包被的珠子和其它必需試劑。簡(jiǎn)單而言，典型測(cè)定如下：1)用無菌pbs洗滌鏈霉親和素包被的珠子(例如，來自于polyscience,warrington,pa的那些)。并將珠子懸浮于合適體積的具有人v型膠原的pbs中。2)用抗人v型膠原抗體的兔抗體(bioten)(abeam,cambridge,ma)，按照上述1中相同的方法產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)照。3)對(duì)于每次測(cè)定，將偶聯(lián)的珠子在pbs中洗滌，并在pbs加肺灌洗液漿液中進(jìn)行孵育。然后用含有10％fcs的pbs洗滌珠子。4)然后將珠子懸浮于無菌pbs+10％fbs中，并在室溫下與二抗一起孵育。通常，使用與r-pe偶聯(lián)的抗人igg抗體(sigma,saintlouis)，但是如同本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，可以使用其它合適的抗體。在這方面中，在某些實(shí)施方案中，為了檢測(cè)疾病進(jìn)展中從一種亞型向另一種的轉(zhuǎn)變，可以使用抗人igg1-、igg2-、igg3-或igg4-特異性抗體。將珠子在含有10％fcs的pbs中洗滌，懸浮于pbs/fcs溶液中，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，可以向珠子測(cè)定中添加已知量的抗colv的抗血清或抗體。

通常，見于copd和哮喘患者中的抗colv抗體是igg，但是也可以存在其它抗體類型，例如igm。此外，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，抗v型膠原的igg抗體亞型隨疾病進(jìn)展發(fā)生改變，所述v型膠原可以存在于患者的血清和/或肺灌洗液中。在這方面中，igg亞型在疾病進(jìn)展中可以發(fā)生轉(zhuǎn)變，并且某些亞型可以指示疾病在惡化。因此，在疾病進(jìn)展中可以存在任何一種或多種igg亞型，例如igg1、igg2、igg3或igg4或以上的任何組合。本發(fā)明提供了利用本文所述的珠子測(cè)定檢測(cè)v型膠原特異的igg1、igg2、igg3、igg4亞型抗體的方法。如同本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的，igg亞型特異的抗體是可購(gòu)買得到的，并且可用于本文所述的方法中。在某些實(shí)施方案中，igg1的增加指示疾病在惡化。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)變成igg2亞型指示疾病在惡化。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)變成igg3亞型指示疾病在惡化。在另一實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)變成igg4亞型指示疾病在惡化。

組合物、藥物組合物和使用方法

可以通過用于提供相似功效的藥劑的任何可接受的給藥方式，以純形式或合適的藥物組合物來實(shí)施本發(fā)明的耐受原性化合物或組合物或其藥學(xué)可接受的鹽的給藥。如本文其它地方所指出的，本文所考慮的一種用于誘導(dǎo)耐受性的途徑是口服給藥。然而，還可以使用多種其它途徑中的任何一種，尤其包括靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、皮下注射以及其它途徑。可以通過將本發(fā)明的化合物與合適的藥學(xué)可接受的載體、稀釋液或賦形劑組合來制備本發(fā)明的藥物組合物，并且可以配制成固體、半固體、液體或氣態(tài)形式的制劑，例如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球和氣霧劑。此外，其它藥學(xué)活性組分(包括其它免疫抑制劑)和/或諸如鹽、緩沖液和穩(wěn)定劑的合適的賦形劑可以，但不需要存在于組合物中。

可以通過多種不同的途徑來實(shí)現(xiàn)給藥，包括口服、腸胃外、鼻、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或局部。給藥的優(yōu)選方式取決于待治療或預(yù)防的疾病狀態(tài)的性質(zhì)。給藥后，能降低、抑制、防止或延遲抗colv免疫應(yīng)答或這類應(yīng)答的臨床適應(yīng)癥的發(fā)生的量被認(rèn)為是有效的。

在某些實(shí)施方案中，所給予的量足以導(dǎo)致本文其它地方所述的免疫活性的降低(例如，t細(xì)胞應(yīng)答、b細(xì)胞應(yīng)答、抗colv抗體的水平等)。治療的精確劑量和持續(xù)時(shí)間是待治療疾病的函數(shù)，并且可以使用已知的測(cè)驗(yàn)方案通過經(jīng)驗(yàn)來確定或者通過在領(lǐng)域內(nèi)已知的模型系統(tǒng)中測(cè)驗(yàn)組合物并外推來確定。還可以進(jìn)行可控的臨床試驗(yàn)。劑量還可以隨待緩解的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度而改變。藥物組合物通常被配制和給藥以發(fā)揮治療有用的效應(yīng)同時(shí)降低不需要的副作用的。組合物可以一次給藥，或可以分成多個(gè)更小的劑量分多次給藥。對(duì)于任何具體的患者，可以按照患者需求隨時(shí)間調(diào)整具體的劑量方案。

本發(fā)明的組合物可以單獨(dú)給藥或與其它已知的治療結(jié)合，例如免疫抑制方案、放射療法、化學(xué)療法、移植、口服膠原療法、免疫療法、激素療法、光動(dòng)力療法。

給予這些組合物和相關(guān)藥物組合物的典型途徑因而包括但不限于，口服、局部、經(jīng)皮、吸入、肺內(nèi)灌注、腸胃外、舌下、口腔、直腸、陰道和鼻內(nèi)途徑。本文所用的術(shù)語(yǔ)腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、胸骨內(nèi)注射或灌輸技術(shù)。本發(fā)明的組合物被配制成一旦將該組合物給予患者時(shí)允許其中所含的活性成分可為生物所利用。被給予個(gè)體或患者的組合物采用一或多劑量的形式，其中例如，片劑可以是單劑量單位，且氣霧劑形式的本發(fā)明化合物的容器可以持有多個(gè)劑量單位。制備這類劑量形式的實(shí)際方法是已知的，或者對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的；例如，參見remington:thescienceandpracticeofpharmacy,20thedition(philadelphiacollegeofpharmacyandscience,2000)。在任何情況下，按本發(fā)明的教導(dǎo)，待給予的組合物含有治療有效量的本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療感興趣的疾病或疾病狀態(tài)。

本發(fā)明的藥物組合物可以為固體或液體的形式。一方面，載體是微粒，使得組合物例如為片劑或粉末的形式。載體可以是液體，所述組合物例如為口腔油、可注射的液體或氣霧劑(其例如可用于吸入給藥)。

在某些實(shí)施方案中，將治療化合物作為加壓氣霧劑或霧狀制劑通過吸入直接給予患者的肺。這類制劑可以含有多種已知的氣霧劑推進(jìn)劑中的任何一種，所述氣霧劑推進(jìn)劑可用于肺內(nèi)和/或鼻內(nèi)吸入給藥。此外，可以存在水，具有或不具有多種助溶劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑(例如，抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體和緩沖液)中的任何一種。對(duì)于待給予的來自多劑量容器的組合物而言，通常添加抗微生物劑。這類組合物還通常被過濾和滅菌，并且可以被凍干以提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性和改善溶解度。

當(dāng)意圖用于口服給藥時(shí)，藥物組合物優(yōu)選為固體或液體形式，其中本文所認(rèn)為的固體或液體形式包括半固體、半液體和凝膠形式。

作為用于口服給藥的固體組合物，可以將藥物組合物配制成粉末、顆粒、壓縮片劑、丸劑、膠囊、口香糖、薄脆餅或類似形式。這類固體組合物通常含有一種或多種惰性稀釋劑或可食用的載體。此外，可以存在一種或多種以下試劑：粘合劑，例如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；諸如淀粉、乳糖或糊精的賦形劑，諸如海藻酸、海藻酸鈉、primogel、玉米淀粉等的崩解劑；諸如硬脂酸鎂或sterotex的潤(rùn)滑劑；諸如膠態(tài)二氧化硅的助流劑；諸如蔗糖或糖精的甜味劑；諸如薄荷、甲基水楊酸或橙香精的調(diào)味劑和著色劑。

當(dāng)藥物組合物為膠囊，例如，明膠膠囊的形式時(shí)，除了上述類型的材料之外，其還可以含有諸如聚乙二醇或油的液體載體。

藥物組合物可以為液體形式，例如，酏劑、糖漿劑、溶液、乳劑或懸浮液。作為兩個(gè)實(shí)例，液體可用于口服給藥或用于注射遞送。當(dāng)意圖用于口服給藥時(shí)，優(yōu)選的組合物除了含有本化合物之外，還含有甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和鮮味劑中的一種或多種。在意圖通過注射給藥的組合物中，可以含有表面活性劑、防腐劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、懸浮劑、緩沖液、穩(wěn)定劑和等滲劑中的一種或多種。

本發(fā)明的液體藥物組合物，無論它們是溶液、懸浮液還是其它類似形式，都可以含有以下佐劑中的一種或多種：諸如注射用水的無菌稀釋液、鹽水、優(yōu)選生理鹽水、林格氏液、等滲氯化鈉、諸如合成的甘油一酯或甘油二脂的固定油(可以充當(dāng)溶劑或懸浮介質(zhì))、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；諸如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯的抗菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉的抗氧化劑；諸如乙二胺四乙酸的螯合劑；諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液和諸如氯化鈉和右旋糖的用于調(diào)整滲透壓的試劑。可以將腸胃外制劑封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的佐劑?？勺⑸涞乃幬锝M合物優(yōu)選是無菌的。

意圖用于腸胃外或口服給藥的本發(fā)明的液體藥物組合物含有本發(fā)明化合物的量應(yīng)當(dāng)使得可以獲取合適的劑量。通常，組合物中本發(fā)明化合物的量為至少0.01％。當(dāng)意圖用于口服給藥時(shí)，該量可以在組合物重量的0.1-約70％間變化。某些口服藥物組合物含有約4％-約75％的本發(fā)明的化合物。按照本發(fā)明，某些藥物組合物和制劑被制備成一腸胃外劑量單位含有0.01-10％重量比的稀釋前的本發(fā)明的化合物。

本發(fā)明的藥物組合物可意圖用于局部給藥，在這種情況下，載體可適于包含溶液、乳劑、軟膏或凝膠基質(zhì)，所述基質(zhì)例如可以包含以下的一種或多種：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油、諸如水和酒精的稀釋液以及乳化劑和穩(wěn)定劑。用于局部給藥的藥物組合物中可以存在增稠劑。如果意圖用于經(jīng)皮給藥，則所述組合物可以含有透皮貼劑或離子電滲療法裝置。局部制劑含有本發(fā)明化合物的濃度可以為約0.1-約10％w/v(每單位體積的重量)。

本發(fā)明的藥物組合物可意圖用于直腸給藥，例如為栓劑的形式，其可以在直腸中溶解并釋放藥物。用于直腸給藥的組合物可以含有油脂性基質(zhì)作為合適的無刺激性賦形劑。這類基質(zhì)包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。

本發(fā)明的藥物組合物可以含有多種物質(zhì)，其調(diào)整固體或液體劑量單位的物質(zhì)形式。例如，組合物可以含有能在活性成分周圍形成包被外殼的材料。能形成包被外殼的材料通常是惰性的，并且可以選自例如，糖、蟲膠和其它腸衣包被劑?？蛇x擇地，可以將活性成分包封在明膠膠囊中。

固體或液體形式的本發(fā)明的藥物組合物可以含有能與本發(fā)明化合物結(jié)合并進(jìn)而促進(jìn)所述化合物的遞送的試劑。具有這種能力的合適的試劑包括單克隆或多克隆抗體、蛋白或脂質(zhì)體。

本發(fā)明的藥物組合物可以由可作為氣霧劑給藥的劑量單位組成。術(shù)語(yǔ)氣霧劑用來表示從膠體性質(zhì)的系統(tǒng)到由加壓包裝組成的系統(tǒng)的多種系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^液化或壓縮的氣體或通過能分散活性成分的合適的泵送系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)遞送。為了遞送活性成分，本發(fā)明化合物的氣霧劑可以以單相、雙相或三相系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)遞送。氣霧劑的遞送包括必需的容器、激活劑、泵、子容器等，它們?cè)谝黄鹂梢越M成試劑盒。無需大量的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就可以確定優(yōu)選的氣霧劑。

可以通過制藥領(lǐng)域內(nèi)公知的方法來制備本發(fā)明的藥物組合物。例如，可以通過將本發(fā)明的化合物與無菌蒸餾水組合以便形成溶液來制備意圖通過注射給藥的藥物組合物?？梢蕴砑颖砻婊钚詣┮源龠M(jìn)均勻溶液或懸浮液的形成。表面活性劑是與本發(fā)明化合物非共價(jià)相互作用的化合物，以便促進(jìn)化合物在水性遞送系統(tǒng)中的溶解或均勻懸浮。

本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽以治療有效量被給藥，該量隨多種因素變化，包括所用的具體化合物的活性、化合物的代謝穩(wěn)定性和作用長(zhǎng)度、患者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食、給藥的方式和時(shí)間、排泄速度、藥物組成、具體病癥或疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度以及個(gè)體經(jīng)歷的治療。通常，治療有效的日劑量(對(duì)于70kg的哺乳動(dòng)物而言)為約0.001mg/kg(即0.07mg)至約100mg/kg(即7.0g)；優(yōu)選地，治療有效劑量(對(duì)于70kg的哺乳動(dòng)物而言)為約0.01mg/kg(即0.7mg)至約50mg/kg(即3.5g)；更優(yōu)選地，治療有效劑量(對(duì)于70kg的哺乳動(dòng)物而言)為約1mg/kg(即70mg)至約25mg/kg(即1.75g)。

在某些實(shí)施方案中，口服給予colv的劑量為每天.001mg至500mg。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本文所述的colv的口服劑量為每天0.01mg至50mg。在另一實(shí)施方案中，本文所述的colv的口服劑量為每天0.1mg至0.5mg。在一個(gè)實(shí)施方案中，colv的口服劑量為每天0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、or0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0mg。在另一實(shí)施方案中，colv的口服劑量可以為每天5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0mg。在某些實(shí)施方案中，劑量可以單一劑量給予或可以在一天內(nèi)分多劑量給予，例如每天2、3或4次劑量，總共為每天具體的mg劑量。

如本文其它地方所描述，在某些實(shí)施方案中，本文所用的治療有效劑量的colv是利用本文所述的各種方法檢測(cè)到的足以誘導(dǎo)對(duì)colv的耐受性的劑量。在某些實(shí)施方案中，如通過本文所述的方法例如elisa所檢測(cè)的，對(duì)colv的耐受性的誘導(dǎo)導(dǎo)致血清抗colv抗體減少。在另一實(shí)施方案中，本文所用的治療有效劑量的colv是利用本文所述的各種方法檢測(cè)到的足以誘導(dǎo)t細(xì)胞對(duì)colv的耐受性的劑量，所述方法例如細(xì)胞因子釋放測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù)、elispot等。還可以利用功能性t細(xì)胞測(cè)定，例如細(xì)胞毒性增殖測(cè)定。

本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽可以與一種或多種其它治療劑同時(shí)給藥，在其之前給藥或在其之后給藥。這種組合療法包括單一藥物劑量制劑的給藥以及本發(fā)明化合物的給藥和每種活性劑在其自身單獨(dú)的藥物劑量制劑中，所述單一藥物劑量制劑含有本發(fā)明的化合物和一種或多種其它活性劑。例如，本發(fā)明的化合物和另一種活性劑可以在單一的口服劑量組合物(例如片劑或膠囊)中一起給予患者，或者每種試劑以單獨(dú)的口服劑量制劑給藥。如果使用單獨(dú)的劑量制劑，本發(fā)明的化合物和一種或多種其它活性劑可以基本上在同一時(shí)間即同時(shí)給藥，或者以單獨(dú)的錯(cuò)開的時(shí)間即相繼給藥；組合療法應(yīng)被理解為包括所有這些方案。

本發(fā)明的化合物可以給予遭受本文所述疾病或病癥折磨的個(gè)體，例如copd和重度且持續(xù)的哮喘。對(duì)于體內(nèi)治療人類疾病而言，通常在給藥之前，將本文所述的化合物并入藥物組合物中。藥物組合物包含一種或多種本文所述的化合物和本文其它地方所述的藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。為了制備藥物組合物，將有效量的一種或多種化合物與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適用于特定給藥方式的任何藥物載體或賦形劑混合。藥物載體可以是液體、半固體或固體。用于腸胃外、皮內(nèi)、皮下或局部應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括例如，無菌稀釋液(例如水)、鹽水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗微生物劑(例如苯甲醇和對(duì)羥基苯甲酸甲酯)；抗氧化劑(例如抗壞血酸和亞硫酸氫鈉)和螯合劑(例如乙二胺四乙酸(edta))；緩沖液(例如醋酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸鹽)。如果靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)和含有增稠劑和加溶劑(例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇和以上的混合物)的溶液。

本文所述的化合物可以與保護(hù)其免于從身體快速排除的載體一起制備，例如時(shí)間釋放制劑或包被。這類載體包括受控釋放制劑，例如但不限于，植入物和裝入微膠囊的遞送系統(tǒng)，以及生物可降解的、生物兼容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它聚合物。

在某些實(shí)施方案中，能促進(jìn)誘導(dǎo)耐受性的佐劑包括地塞米松(參見例如，y.kang,etal.,j.immunol.2008,180:5172-5176)、脂多糖(lps)和霍亂毒素亞基，并且可以被添加至制劑。還考慮將某些其它耐受原性載體與本發(fā)明的colv組合物一起使用。這類載體包括礦物油載體，例如弗氏不完全佐劑(ifa)或弗氏完全佐劑(cfa)。ifa是礦物油的乳劑。cfa是含有各種量的殺死的分支桿菌有機(jī)體的礦物油制劑。然而，ifa和cfa不允許用于人類，因?yàn)榈V物油是不可代謝的，并且不能被人體降解。

在某些實(shí)施方案中，脂肪乳劑，其已用于人患者的靜脈營(yíng)養(yǎng)很多年了，其還可以作為利用本發(fā)明多肽的耐受原性多肽療法的媒介。這類乳劑的兩個(gè)實(shí)例是可購(gòu)買到的稱為intralipid和lipofundin的脂肪乳劑。“intralipid”是kabipharmacia,sweden的注冊(cè)商標(biāo)，是用于靜脈營(yíng)養(yǎng)的脂肪乳劑，描述于美國(guó)專利第3,169,094號(hào)中?！發(fā)ipofundin”是b.braunmelsungen,germany的注冊(cè)商標(biāo)。兩種均含有諸如脂肪的大豆油(1,000ml蒸餾水中100或200g：分別為10％或20％)。蛋黃磷脂是intralipid中所用的乳化劑(12g/l蒸餾水)，且lipofundin中是蛋黃卵磷脂(12g/l蒸餾水)。intralipid和lipofundin兩者中的等滲性均由添加甘油(25g/l)導(dǎo)致。這些媒介被認(rèn)為是實(shí)際的生物活性載體，當(dāng)其與可疑自體抗原混合時(shí)，促進(jìn)自身免疫t細(xì)胞的th1至th2的轉(zhuǎn)移。在某些實(shí)施方案中，這類媒介是這樣的脂肪乳劑，其含有10-20％的植物和/或動(dòng)物來源的甘油三磷脂、1.2-2.4％的植物和/或動(dòng)物來源的磷脂、2.25-4.5％滲透壓調(diào)節(jié)劑、0-0.05％抗氧化劑并用無菌水加至100％。

在某些實(shí)施方案中，colv或其耐受原性片段可以連接至白喉毒素受體以增強(qiáng)gi攝入。

本發(fā)明的耐受原性組合物可用于治療哮喘和copd和colv自身免疫相關(guān)的其它肺病。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療慢性阻塞性肺病的方法，包括向所述copd患者給予治療有效量的v型膠原、或其耐受原性片段或免疫原性片段，所述免疫原性片段以有效誘導(dǎo)耐受性的劑量給予。在這方面中，copd患者可以患肺氣腫或慢性阻塞性支氣管炎。

本發(fā)明另一方面提供了用于治療哮喘的方法，包括向所述哮喘患者給予治療有效量的v型膠原或其耐受原性片段或免疫原性片段，所述免疫原性片段以有效誘導(dǎo)耐受性的劑量給予。在這方面中，哮喘患者可以患有重度、持續(xù)的哮喘。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于降低哮喘患者哮喘嚴(yán)重程度的方法。

本發(fā)明還提供了用于預(yù)防有發(fā)展成慢性阻塞性肺病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體中慢性阻塞性肺病的發(fā)展的方法，包括向所述個(gè)體給予治療有效量的v型膠原或其耐受原性片段。

如本文其它地方所指出的，可以給予完整的colv或其成分α鏈的任何一種或多種或上述任一分子的耐受原性片段。此外，同樣如本文其它地方所指出的，可以按本文所述的任何方法，使用有效誘導(dǎo)對(duì)colv的耐受性的劑量，給予完整的colv或其成分α鏈的任何一種或多種的免疫原性片段。這種劑量可以隨多種因素變化，包括所用的具體蛋白或片段的活性、這些化合物的代謝穩(wěn)定性和作用長(zhǎng)度、患者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食、給藥的方式和時(shí)間、排泄速度、藥物組成、具體病癥或疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度以及個(gè)體經(jīng)歷的治療。因此，這種耐受原性劑量可以使用已知的測(cè)驗(yàn)方案通過經(jīng)驗(yàn)來確定或者通過在領(lǐng)域內(nèi)已知的模型系統(tǒng)中測(cè)驗(yàn)組合物并外推來確定。還可以進(jìn)行可控的臨床試驗(yàn)。劑量還可以隨待緩解的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度而改變。

如同本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，多種因素可被評(píng)價(jià)從而確定用于治療、預(yù)防或降低copd或哮喘的嚴(yán)重程度的本發(fā)明的化合物和方法的有效性。這些因素包括可為臨床醫(yī)生進(jìn)行評(píng)價(jià)的哮喘或copd的典型臨床癥狀。這些癥狀可以包括但不限于：對(duì)于哮喘而言：哮鳴、胸部緊迫感或疼痛、心率加快、發(fā)汗、如通過最大流量計(jì)所測(cè)量的流速最高、咳嗽頻繁，尤其在夜間、容易喘不上氣或氣短、當(dāng)運(yùn)動(dòng)時(shí)感到非常疲憊或虛弱、運(yùn)動(dòng)后哮鳴或咳嗽、感到疲憊、易煩躁、壞脾氣、或情緒多變、如通過最大流量計(jì)所測(cè)量的肺功能減弱或改變、傷寒或過敏癥(打噴嚏、流鼻涕、咳嗽、鼻塞、咽喉痛和頭痛)的跡象、失眠。這些因素包括copd的典型臨床癥狀，例如但不限于，產(chǎn)生的痰的量、痰的密度和粘性、痰的顏色和痰中帶血、氣短的嚴(yán)重程度、咳嗽和/或哮鳴；腳踝腫脹；健忘、糊涂、言語(yǔ)含糊和瞌睡；失眠；使用更多的枕頭或睡在椅子上而不是床上，以避免氣短；體重莫名其妙的增加或降低；持續(xù)性疲勞和沒勁；喪失性沖動(dòng)；早晨頭痛、頭暈?zāi)垦?、心神不定?/p>

本發(fā)明的組合物和方法可以與用于copd和哮喘的其它已知治療聯(lián)合使用，例如但不限于皮質(zhì)類固醇(例如，強(qiáng)的松、氟替卡松、甲基強(qiáng)的松龍)、支氣管擴(kuò)張藥(例如，短效和長(zhǎng)效的β2-激動(dòng)劑、茶堿、吡布特羅、麻黃堿、舒喘靈、沙美特羅、左沙丁胺醇、雙氯醇胺異丙托溴胺)和白三烯調(diào)節(jié)劑(例如，孟魯司特、扎魯司特、棄白通)。

參考文獻(xiàn)

以下參考文獻(xiàn)通過引用具體并入本文，它們提供示例性方案或其它詳情的程度補(bǔ)充了本文所示的那些實(shí)施方案。chen,inobe,marks,gonnella,kuchroo,weiner,“peripheraldeletionofantigen-reactivetcellsinoraltolerance(口服耐受性中抗原反應(yīng)性t細(xì)胞的外部刪除)”nature,376:177-180,1995.chen,kuchroo,inobe,hafler,weiner,"regulatoryt-cellclonesinducedbyoraltolerance:suppressionofautoimmuneencephalomyelitis(由口服耐受性誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)型t細(xì)胞克隆：自身免疫性腦脊髓炎的抑制)"science,265:1237-1240,1994.chiang,mainardi,seyer,"typev(a-b)collageninducesplateletaggregation(v(a-b)型膠原誘導(dǎo)血小板聚集)"j.lab.clin.med.,95:99-107,1980.cremer,ye,terato,owens,seyer,kang,"typexicollagen-inducedarthritisinthelewisrat:characterizationofcellularandhumoralimmuneresponsestonativetypesxi,v,andiicollagenandconstituentα-chains(路易鼠中xi型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎：對(duì)天然的xi型、v型和ii型膠原和成分α鏈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的表征)"j.immunol.153:824-832,1994.danzer,kirchner,rink,"cytokineinteractionsinhumanmixedlymphocyteculture(人類混合淋巴細(xì)胞混合物中細(xì)胞因子的相互作用)"transplantation,57(11):1638-1642,1994.demeester,rolfe,kunkel,swiderski,lincoln,deeb,strieter,"thebimodalexpressionoftumornecrosisfactor-αinassociationwithratlungreimplantationandallograftrejection(腫瘤壞死因子α的雙峰表達(dá)與大鼠肺再植入和同種移植物排斥相關(guān))"j.immunol.,150(6):2494-2505,1993.fariaandweiner,"oraltolerance:mechanismsandtherapeuticapplications(口服耐受性：機(jī)制和治療應(yīng)用)"adv.immunol.,73:153-264,1999.fedoseyeva,zhang,orr,levin,buncke,benichou,"denovoautoimmunitytocardiacmyosinafterhearttransplantationanditscontributiontotherejectionprocess(心臟移植后對(duì)心肌肌球蛋白的原位自身免疫及其對(duì)排斥過程的貢獻(xiàn))"j.immunol.,162:6836-42,1999.garrovillo,ali,oluwole,"indirectallorecognitioninacquiredthymictolerance:inductionofdonor-specifictolerancetoratcardiacallograftsbyallopeptide-pulsedhostdendriticcells(獲取的胸腺耐受性中間接的同種識(shí)別：由同種肽脈沖的宿主樹突細(xì)胞誘導(dǎo)對(duì)大鼠心臟同種移植物的供體特異性耐受)"transplantation,68:1827-1834,1999.hancock,sayegh,kwok,weiner,carpenter,"oral,butnotintravenous,alloantigenpreventsacceleratedallograftrejectionbyselectiveintragraftth2cellactivation(口服而非靜脈內(nèi)的同種抗原通過選擇性內(nèi)移植物th2細(xì)胞激活防止加速的同種移植物排斥)"transplantation,55:1112-1118,1993.hanson,gorman,oui,cheah,solomon,trowsdale,"thehuman2(xi)collagengene(col11a2)mapstothecentromericofthemajorhistocompatibilitycomplexonchromosome6(人類α2(xi)膠原基因(col11a2)繪制在6號(hào)染色體的主要組織相容性復(fù)合體的著絲粒上)"genomics,5:925-931,1989.hirt,you,moller,boeke,starke,spranger,wottge,"developmentofobliterativebronchiolitisafterallogeneicratlungtransplantation:implicationofacuterejectionandthetimepointoftreatment(同種大鼠肺移植后閉塞性細(xì)支氣管炎的發(fā)展：涉及急性排斥和治療的時(shí)間點(diǎn))"j.heartlungtransplant.,18:542-548,1999.huang,fuchimoto,scheier-dolberg,murphy,neville,sachs,j.clin.invest.,105:173-181,2000.ishido,matsuoka,matsuno,nakagawa,tanaka,"inductionofdonor-specifichyporesponsivenessandprolongationofcardiacallograftsurvivalbyjejunaladministrationofdonorsplenocytes(由供體脾細(xì)胞的空腸給藥所誘導(dǎo)的供體特異的低反應(yīng)性和心臟同種移植物存活的延長(zhǎng))"transplantation,68:1377-1382,1999.iyer,woo,cornejo,gao,mccoubrey,maines,buelow,"characterizationandbiologicsignificanceofimmunosuppressivepeptided2702.75-84(eαv)bindingprotein(免疫抑制肽d2702.75-84(eαv)結(jié)合蛋白的表征和生物學(xué)意義)"j.bio.chem.,273(5):2692-2697,1998.joo,pepose,stuart,"t-cellmediatedresponsesinamurinemodeloforthotopiccornealtransplantation(常位角膜移植的鼠模型中t細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)"invest.ophthalmol.vis.sci.,36:1530-1540,1995.konomi,hayashi,nakayasu,arima,"localizationoftypevcollagenandtypeivcollageninhumancornea,lung,andskin(人類角膜、肺和皮膚中v型膠原和iv型膠原的定位)"am.j.pathol.,116:417-426,1984.krenskyandclayberger,"hla-derivedpeptidesasnovelimmunosuppressives(hla來源的肽作為新的免疫抑制劑)"nephrol.dial.transplant.,12:865-878,1997.lowry,marghesco,blackburn,"immunemechanismsinorganallograftrejection.vi.delayed-typehypersensitivityandlymphotoxininexperimentalrenalallograftrejection(器官同種移植排斥的免疫機(jī)制，vi.實(shí)驗(yàn)?zāi)I臟同種移植排斥中的延遲型超敏性和淋巴毒素)"transplantation.,40:183-188,1985.madriandfurthmayr,"collagenpolymorphisminthelung(肺中的膠原多態(tài)性)"humanpathology,11:353-366,1980.madriandfurthmayr,"isolationandtissuelocalizationoftypeab2collagenfromnormallungparenchyma(來自正常肺實(shí)質(zhì)的ab2型膠原的分離和組織定位)"am.j.pathol.,94:323-332,1979.marck,prop,widevuur,"lungtransplantationintherat.iii.functionalstudiesiniso-andallografts(大鼠中的肺移植，iii.同體移植和同種移植的功能研究)"j.surgicalres.,35:149-158,1983.matsumura,marchevsky,zuo,kass,matloff,jordan,"assessmentofpathologicalchangesassociatedwithchronicallograftrejectionandtoleranceintwoexperimentalmodelsofratlungtransplantation(在大鼠肺移植的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑?duì)與慢性同種移植排斥相關(guān)的病理學(xué)改變的評(píng)價(jià))"transplantation.,59:1509-1517,1995.morrisandbachinger,"typexicollagenisaheterotrimerwiththecomposition(1α,2α,3α)retainingnon-triplehelicaldomains(xi型膠原是保留非三螺旋結(jié)構(gòu)域的組分(1α、2α、3α)的異三聚體).j.biologicalchem.,262:11345-11350,1987.murphy,magee,alexander,waaga,snoeck,vella,carpenter,sayagh,"inhibitionofallorecognitionbyahumanclassiimhc-derivedpeptidethroughtheinductionofapoptosis(人ii類mhc來源的肽通過誘導(dǎo)凋亡抑制同種識(shí)別)"j.clin.invest.,103:859-867,1999.nosner,goldberg,naftzger,lyu,clayberger,krensky,"hla-derivedpeptideswhich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實(shí)施例

實(shí)施例1

copd患者中抗v型膠原抗體增加

血漿獲自正常的志愿者(不吸煙的成年人，年齡為18-55)和被證實(shí)患有肺氣腫的志愿者。按照wo2007/120947中所描述的流式細(xì)胞術(shù)珠子測(cè)定法檢測(cè)copd患者和對(duì)照健康個(gè)體中抗colv抗體的水平。

簡(jiǎn)單而言，1)用無菌pbs將鏈霉親和素包被的珠子(5μm，結(jié)合能力：10-20μg/1×10⁷珠子(polyscience,warrington,pa))洗滌兩次。將珠子(1×10⁷)懸浮于100μl具有40μg人v型膠原的pbs中，并于4℃孵育60分鐘。2)用20μm兔抗人v型膠原抗體的抗體(bioten)(abeam,cambridge,ma)，按照上述1中相同的方法產(chǎn)生陽(yáng)性對(duì)照。3)對(duì)于每次測(cè)定，將1×10⁶偶聯(lián)的珠子在pbs中洗滌兩次，并在加50μl血清的100μlpbs中進(jìn)行孵育。室溫下孵育30分鐘后，用含有10％fcs的pbs將珠子洗滌三次。4)將珠子懸浮于無菌pbs+10％fbs中，并在室溫下與二抗孵育大約30分鐘。通常，使用與r-pe偶聯(lián)的5μl抗人igg抗體(sigma,saintlouis)。將珠子在含有10％fcs的pbs中洗滌三次，懸浮于300μlpbs/fcs溶液中，并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

如圖1所示，與對(duì)照相比(n＝42)，copd患者(n＝16)中抗v型膠原抗體顯著升高。

實(shí)施例2

哮喘患者中抗v型膠原抗體增加

血漿獲自正常的志愿者(不吸煙的成年人，年齡為18-55)和被證實(shí)患有慢性哮喘的志愿者。用實(shí)施例1中概括的珠子測(cè)定法檢測(cè)哮喘患者和對(duì)照志愿者個(gè)體中抗colv抗體的水平。

如圖2所示，在20名哮喘患者中發(fā)現(xiàn)8名患者的抗v型膠原抗體的水平提高。

實(shí)施例3

小鼠靜脈內(nèi)的v型膠原防止卵白蛋白誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性

本實(shí)施例證實(shí)，在該建立良好的鼠哮喘模型中，v型膠原的靜脈內(nèi)給藥防止卵白蛋白誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性。

用100μg單獨(dú)的col(v)、或混在弗氏完全佐劑(cfa)中的col(v)、或pbs或單獨(dú)的cfa經(jīng)尾靜脈注射balb/c小鼠。7天之后，小鼠接受于明礬中的卵白蛋白的ip注射，7天之后重復(fù)一次。在最后一次卵白蛋白/明礬注射之后7天，用增加劑量的氣霧化卵白蛋白激發(fā)每組中的小鼠，隨后測(cè)量氣道阻力(penh)。

結(jié)果顯示，單獨(dú)的col(v)消除了卵白蛋白誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性(參見圖3)。進(jìn)行其它的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)這些結(jié)果。這些結(jié)果總結(jié)在以下的表2中。

實(shí)施例4

靜脈內(nèi)的col(v)在肺單核細(xì)胞中誘導(dǎo)ifn-γ轉(zhuǎn)錄本

本實(shí)施例顯示，單獨(dú)col(v)的靜脈注射在肺單核細(xì)胞中誘導(dǎo)th1應(yīng)答，特征為誘導(dǎo)出ifn-γ轉(zhuǎn)錄本。用100μg單獨(dú)的col(v)經(jīng)尾靜脈、單獨(dú)的cfa在尾基部、colv加cfa在尾基部或單獨(dú)的pbs經(jīng)靜脈對(duì)balb/c小鼠進(jìn)行注射。7天之后，小鼠接受于明礬中的卵白蛋白的ip注射，7天之后重復(fù)一次。在最后一次卵白蛋白/明礬注射之后7天，用增加劑量的氣霧化乙酰甲膽堿激發(fā)每組中的小鼠，隨后測(cè)量響應(yīng)于乙酰甲膽堿激發(fā)的氣道阻力(penh)。從每個(gè)處理組的小鼠的肺實(shí)質(zhì)分離的單核細(xì)胞中提取rna，并進(jìn)行定量pcr用于測(cè)定il-4、il-5、il-13、ifn-γ和il-10的表達(dá)水平(參見圖4；數(shù)據(jù)代表從每組5只小鼠的肺單核細(xì)胞合并的rna)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果指示，靜脈內(nèi)單獨(dú)給予col(v)在肺單核細(xì)胞中誘導(dǎo)出ifn-γ轉(zhuǎn)錄本。ifn-γ拮抗il-13和il4，il-13和il4兩種細(xì)胞因子被認(rèn)為在哮喘發(fā)病機(jī)理中起重要作用。因此，不希望受理論的束縛，對(duì)抗il4/il13效應(yīng)的該th1應(yīng)答的誘導(dǎo)在卵白蛋白誘導(dǎo)的哮喘中colv介導(dǎo)的保護(hù)性效應(yīng)中起作用。

本說明書中涉及的和/或申請(qǐng)數(shù)據(jù)表中列舉的所有上述美國(guó)專利、美國(guó)專利申請(qǐng)公開、美國(guó)專利申請(qǐng)、外國(guó)專利、外國(guó)專利申請(qǐng)和非專利出版物都通過引用全文并入本文。

從上述應(yīng)當(dāng)理解，盡管為了說明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的條件下可以進(jìn)行多種修改。因此，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求書的限制。

序列表

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gagccgcgcagctcagccagcagatctcctgaaggttctagattttcacaacttgcctga540

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ggccttcctggtctccatctacaacgagcagggtatccagcagattgggctggagctggg780

ccgctctcccgtcttcctctacgaggaccacacggggaagcctggcccggaagactaccc840

cctcttccggggcatcaacctgtcagatggcaagtggcacagaattgctctcagcgtcca900

caagaaaaatgtcaccttgatcctcgactgtaaaaagaagaccaccaaattcctcgaccg960

cagcgaccaccccatgatcgacatcaatggcatcatcgtgtttggcacccggatcctgga1020

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