本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及小分子果膠用于治療非小細(xì)胞肺癌的醫(yī)學(xué)用途。

背景技術(shù)：

柑橘果膠是來源于植物細(xì)胞壁的多糖，一般可作為食品添加劑使用，有很好的膠凝、穩(wěn)定、乳化、增稠、懸浮功能，同樣的，天然柑橘果膠分子量大(5-30萬da)，食用后無法被腸道吸收而不能使其在體內(nèi)充分發(fā)揮作用。鑒于此，對(duì)其分子進(jìn)行大小及結(jié)構(gòu)的改性，具有增強(qiáng)生物學(xué)功能的前景。

果膠改性的幾類主要方法，包括化學(xué)(ph)改性、酶改性、熱改性、輻照改性、接枝改性、交聯(lián)改性和取代改性；

目前，國內(nèi)外的小分子果膠提取技術(shù)，主要是利用天然柑橘果膠經(jīng)過改性方法制備，包括化學(xué)(ph)改性、酶改性、熱改性、輻照改性、接枝改性、交聯(lián)改性和取代改性；這些方法進(jìn)行天然果膠分子鏈斷鏈的處理，可得到分子量為2000-35000da的小分子果膠，酯化度2-30％，水解的作用一是將果膠直鏈切斷以降低分子量，二是降低酯化度，直鏈切斷的過程中采用的工藝，會(huì)導(dǎo)致果膠的活性降低，服用后得到的效果僅有10％左右。

過去，因?yàn)樾》肿庸z只有歐美、日本等國家的極少數(shù)企業(yè)掌握核心生產(chǎn)技術(shù)，我國小分子果膠產(chǎn)業(yè)長期受限于國外技術(shù)壟斷，產(chǎn)品絕大多數(shù)以進(jìn)口為主，所以迫切需要自主研發(fā)、技術(shù)領(lǐng)先的國產(chǎn)小分子果膠充實(shí)國內(nèi)市場(chǎng)，我們完全可以充分利用我國豐富的柑橘資源，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的小分子柑橘果膠，滿足國內(nèi)日益增長的市場(chǎng)需求，可苦于技術(shù)的限制，使得這一市場(chǎng)基本被國外企業(yè)占領(lǐng)。

申請(qǐng)人范曉青申請(qǐng)了中國發(fā)明專利(cn200610050803.3、cn200610051667.x、cn201010226113.5、cn201110028976.6)公開了低分子柑桔果膠的新用途，該低分子柑桔果膠由干柑桔皮提取果膠后采用氫氧化鈉和氫氧化鉀催化獲得低分子柑桔果膠。其采用將果膠直鏈切斷以降低分子量的方式，會(huì)導(dǎo)致果膠的活性降低。

本發(fā)明的發(fā)明人申請(qǐng)的中國發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朿n201610531658.4，公開日：2016.12.07)公開了一種柑橘罐頭加工工藝中同步提取果膠及多酚的方法，分別通過不同級(jí)別的分離裝置分離出柑橘罐頭加工工藝水中的高分子果膠、低分子果膠以及多酚、單糖等物質(zhì)，避免了傳統(tǒng)罐頭加工中工藝水難處理造成環(huán)境污染及物質(zhì)浪費(fèi)，且各個(gè)不同分子量物質(zhì)的分離采用的分離提取方式也都不同，比如超濾、納濾等，不會(huì)使回收工藝太過復(fù)雜。本發(fā)明還提供了一種柑橘罐頭工藝水中提取果膠及多酚的系統(tǒng)，根據(jù)高分子果膠、低分子果膠以及多酚、單糖分子量大小不同，采用不同的膜裝置用于過濾的分離裝置，促使分離出的上述物質(zhì)純度較高，系統(tǒng)中包含除鹽裝置能有效的去除工藝水中的重金屬以及鹽類，避免了這些物質(zhì)對(duì)提取后的高分子果膠、低分子果膠以及酚、單糖的污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種柑橘橘絡(luò)提取的新型小分子果膠用于制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用，所述的新型小分子果膠為柑橘橘絡(luò)提取物中物理分離制備的小分子果膠。作為優(yōu)選，所述的小分子果膠的摩爾質(zhì)量為50000da以下，最優(yōu)選為1000-50000da之間。

本發(fā)明的二個(gè)目的是提供一種柑橘橘絡(luò)提取的新型小分子果膠用于制備抑制非小細(xì)胞肺癌的食品或保健品中的應(yīng)用，所述的新型小分子果膠為柑橘橘絡(luò)提取物中物理分離制備的小分子果膠。作為優(yōu)選，所述的小分子果膠的摩爾質(zhì)量為50000da以下，最優(yōu)選為1000-50000da之間。

本發(fā)明所述的高活性小分子果膠可以采用以下的方法制備得到：

1)原料的處理

將柑橘橘絡(luò)原料，進(jìn)入酸提罐，并加熱至40-50℃，調(diào)節(jié)ph至3.5-4.5，保溫3～5小時(shí)；

2)過濾

浸提后的液體，經(jīng)過濾濾出殘?jiān)?，取濾液進(jìn)入萃取罐，濾渣進(jìn)行二次浸提；

3)萃取

浸提后的液體進(jìn)入萃取罐，加入萃取液，進(jìn)行高分子果膠萃取，萃取后的萃取液進(jìn)入壓榨裝置，將得高分子果膠；

4)回收萃取液

萃取液經(jīng)過萃取回收裝置回收，萃取液殘留部分為小分子果膠的原料液；

5)超濾ⅰ

含有小分子果膠的原料經(jīng)過超濾濾出大于5萬分子量的果膠和雜質(zhì)；

6)超濾ⅱ

選用1000分子量的超濾分離和濃縮超濾ⅰ濾后的濾液，得到小分子果膠液。

當(dāng)然，本發(fā)明的小分子果膠也可以采用本發(fā)明的發(fā)明人高海峰申請(qǐng)的中國發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朿n201610531658.4，公開日：2016.12.07)公開方法獲得。

本發(fā)明的小分子果膠是一種從柑橘橘絡(luò)中直接提取出的水溶性多糖，能與非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞親和黏附，特異性殺傷并清除突變細(xì)胞。

附圖說明

圖1.本發(fā)明小分子果膠對(duì)pc-9細(xì)胞的增殖抑制率。

圖2.改性柑橘果膠粉對(duì)pc-9細(xì)胞的增殖抑制率。

圖3.模型對(duì)照及各給藥組荷瘤裸小鼠皮下實(shí)體瘤。

圖4.小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠腫瘤體積(tv)的影響。

圖5.小分子果膠荷瘤裸小鼠相對(duì)腫瘤體積(rtv)的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種柑橘橘絡(luò)提取的新型小分子果膠的制備方法，該方法包括以下的步驟：

1)原料的處理

柑橘橘絡(luò)經(jīng)過粉碎、清洗、甩干后進(jìn)入酸提罐，并加熱至40-50℃，用酸(hcl)調(diào)節(jié)ph至3.5-4.5，保溫4小時(shí)。

2)過濾

浸提后的液體，經(jīng)過濾濾出殘?jiān)?，取濾液進(jìn)入萃取罐，濾渣進(jìn)行二次浸提。

3)萃取

浸提后的液體進(jìn)入萃取罐，加入萃取液，進(jìn)行高分子果膠萃取，萃取后的萃取液進(jìn)入壓榨裝置，將得高分子果膠。

4)回收萃取液

萃取液經(jīng)過萃取回收裝置回收，萃取液殘留部分為小分子果膠和黃酮的原料液。

5)超濾ⅰ

含有小分子果膠和黃酮的原料經(jīng)過超濾濾出大于5萬分子量的果膠和雜志。

6)超濾ⅱ

選用1000分子量的起濾分離和濃縮超濾ⅰ濾后的濾液，得到1000-5萬的小分子果膠液。

實(shí)施例2

高活性小分子果膠(橘絡(luò)白金)及改性柑橘果膠粉(市售)對(duì)pc-9細(xì)胞的體外抑制作用實(shí)驗(yàn)。

1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

高活性小分子果膠(橘絡(luò)白金)及改性柑橘果膠粉(市售)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌pc-9的體外抑制作用。

2.材料與方法

2.1受試物：高活性小分子果膠(橘絡(luò)白金)，分子量在5000-50000da之間，中國發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朿n201610531658.4，公開日：2016.12.07)公開方法獲得，是一種從柑橘橘絡(luò)中直接提取出的水溶性多糖；改性柑橘果膠粉(市售)用ddh2o配制成100mg/ml，滅菌后備用。

2.2細(xì)胞株及培養(yǎng)條件：人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供，用含10％胎牛血清、100u/l青霉素和100mg/l鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)液，于37℃、5％co2并飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.3試劑：rpmi1640培養(yǎng)液為corningcellgro公司產(chǎn)品，胰蛋白酶(trypsin)為sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清為biowest公司產(chǎn)品，celltiteraqueousonesolutionreagent為promega公司產(chǎn)品。

2.4儀器：model3111型co2培養(yǎng)箱為thermofisher公司產(chǎn)品，model680型酶標(biāo)儀為biorad公司產(chǎn)品。

2.5體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制測(cè)定：取對(duì)數(shù)生長期的pc-9細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×10⁴/ml，每孔100μl細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種后第二天給藥(100μl/孔)，分別設(shè)空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組以及5個(gè)濃度受試藥物組。繼續(xù)培養(yǎng)72h后，pbs洗滌兩遍，每孔加入1:10稀釋的celltiteraqueousonesolutionreagent試劑110μl，37℃避光培養(yǎng)2h，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處吸光度，計(jì)算受試藥物對(duì)pc-9細(xì)胞的增殖抑制率，并以graphpadprismsoftware(graphpad^tmsoftwareinc.)計(jì)算機(jī)程序擬合抑制曲線計(jì)算受試物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(ic50)。

3.結(jié)果

受試藥物高活性小分子果膠及改性柑橘果膠粉(市售)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞的增殖抑制作用(表1，表2，圖1，圖2)及72小時(shí)半數(shù)抑制濃度ic50(tab.3)。

表1試驗(yàn)材料對(duì)體外pc-9細(xì)胞的增殖抑制作用(％)

datarepresentmean±sd,n＝8.

表2試驗(yàn)材料對(duì)體外pc-9細(xì)胞的增殖抑制作用(％)

datarepresentmean±sd,n＝6.

表3試驗(yàn)材料在pc-9細(xì)胞中的72小時(shí)ic50值.

4.結(jié)論

高活性小分子果膠(橘絡(luò)白金)及改性柑橘果膠粉(市售)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞具有體外增殖抑制作用，同等劑量條件下高活性小分子果膠(橘絡(luò)白金)對(duì)人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞的抑制作用略強(qiáng)于改性柑橘果膠粉(市售)。

實(shí)施例3

確定皮下移植人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞的裸小鼠連續(xù)35日經(jīng)口灌胃分別給予小分子果膠口服液高劑量、中劑量、低劑量對(duì)腫瘤生長的影響，同時(shí)初步觀察藥物的毒副作用。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與管理

1.動(dòng)物

balb/c(nu/nu)裸小鼠，雄性，spf級(jí)，4～6周，體重20±2g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：scxk(滬)2013-0016。

2.飼養(yǎng)管理與環(huán)境條件

每籠6只。屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)室溫度20～25℃，相對(duì)濕度40-70％，中央空調(diào)集中通風(fēng)10-20次/小時(shí)，光照12小時(shí)暗，12小時(shí)明。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：syxk(浙)2014-0008。

3.飼料和飲水

喂飼鈷60輻照的全價(jià)營養(yǎng)顆粒飼料，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)基地生產(chǎn)供應(yīng)。飲水為城市飲用水經(jīng)laws-2000實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反滲透純水機(jī)處理后，裝入消毒過的飲水瓶內(nèi)自由飲用。供試品和對(duì)照品

供試品

1.1.小分子果膠口服液：本品為黃褐色液體，常溫避光保存，由杭州絡(luò)通生物科技有

限公司提供。

1.2.供試品的配制：使用前領(lǐng)取供試品，以超純水配置中低濃度。

陽性對(duì)照品：順鉑，規(guī)格：20mg/瓶凍干粉，齊魯制藥有限公司。

檢測(cè)儀器和設(shè)備

1.電子天平，型號(hào)bs124s，sartorius公司，用于受試藥品的稱量。

2.電子天平，型號(hào)sf-400a，用于動(dòng)物體重的稱量。

3.超純水儀，型號(hào)zmqs50001，millipore公司，超純水用于配制供試品。

給藥方案

1.給藥途徑

經(jīng)口灌胃(p.o.)，與臨床給藥途徑一致。

2.劑量組別

3.劑量確定依據(jù)

高劑量組為受試物小分子果膠口服液(濃度1.25mg/ml，以半乳糖醛酸計(jì))0.45ml/20g，一日給藥2次，每日給藥劑量為56.25mg/kg，相當(dāng)于臨床推薦腫瘤患者放化療期間每日服用劑量，相當(dāng)于臨床推薦腫瘤患者日常調(diào)理劑量的1.5倍。中劑量組給藥劑量為28.13mg/kg，低劑量組給藥劑量為14.06mg/kg。

檢疫

裸小鼠檢疫期為48小時(shí)，期間觀察裸小鼠的行為活動(dòng)、精神、攝食、體重、體溫等情況。

試驗(yàn)分組

檢疫結(jié)束日為造模日期。待造模后五天對(duì)裸小鼠進(jìn)行分組，分為模型對(duì)照組(6個(gè)動(dòng)物)、陽性藥物順鉑對(duì)照組(6個(gè)動(dòng)物)和3個(gè)供試品給藥組(每組6個(gè)動(dòng)物)。

試驗(yàn)方法

收集對(duì)數(shù)生長期人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度1×10⁷/ml，無菌條件下皮下注射接種于裸小鼠背部，0.2ml/只，spf級(jí)常規(guī)飼養(yǎng)5天，隨機(jī)分組。分別設(shè)腫瘤模型對(duì)照組、順鉑對(duì)照組、3個(gè)供試品給藥組。給藥組經(jīng)口灌胃給藥，模型對(duì)照組給予超純水，連續(xù)給藥5周，每周給藥5天。順鉑對(duì)照組于分組后第9天腫瘤平均體積達(dá)到50mm³以上后開始給藥，腹腔注射，每周兩次。

檢測(cè)指標(biāo)

1.瘤徑：以瘤徑為主要檢測(cè)指標(biāo)，每3～4d測(cè)量1次，根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算腫瘤體積和相對(duì)腫瘤體積。腫瘤體積(tumorvolume,tv)，tv＝π/6×a×b²(其中a、b分別為最長徑和最短徑)；相對(duì)腫瘤體積(relativetumorvolume,rtv)，rtv＝vt/v0(其中v0為分組給藥時(shí)d0測(cè)量所得腫瘤體積，vt為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積)。

2.瘤重：試驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，解剖剝離瘤塊，稱瘤重。模型對(duì)照組腫瘤平均瘤重小于1g，或20％腫瘤重量小于400mg，表示腫瘤生長不良，試驗(yàn)作廢。根據(jù)稱重結(jié)果計(jì)算腫瘤生長抑制率，腫瘤生長抑制率＝[(模型對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型對(duì)照組平均瘤重]×100％。腫瘤生長抑制率<40％，判斷受試藥物無效；腫瘤生長抑制率≥40％，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p<0.05，判斷受試藥物有效。

3.臟器指數(shù)：試驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，稱體重，解剖后取心臟、肝臟、肺和腎臟肉眼觀察可見病變，脾臟稱濕重，計(jì)算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)＝臟器濕重(g)/體重(g)*1000。

4.體重：每3～4d記錄動(dòng)物體重，觀察受試藥物對(duì)動(dòng)物體重的影響。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所有計(jì)量數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±se)，采用spssstatistics17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，以p<0.05認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

試驗(yàn)結(jié)果

皮下移植人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞的裸小鼠連續(xù)35日經(jīng)口給予小分子果膠高劑量(56.25mg/kg)，對(duì)腫瘤生長具有顯著抑制作用(p<0.05)，抑制率達(dá)53.9％；給予小分子果膠中劑量(28.13mg/kg)，對(duì)腫瘤生長無顯著抑制作用(p>0.05)，抑制率為23.3％；給予小分子果膠口服液低劑量(14.06mg/kg)，對(duì)腫瘤生長無顯著抑制作用(p>0.05)，抑制率為5.0％。詳見圖3、圖4、圖5和表4、表5、表6。

表4.小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠腫瘤體積(tv,mm³)的影響

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

表4(續(xù)).小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠腫瘤體積(tv,mm³)的影響

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

表5.小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠相對(duì)腫瘤體積(rtv)的影響

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

表5(續(xù)).小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠相對(duì)腫瘤體積(rtv)的影響

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

表6.小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠皮下實(shí)體瘤的抑制作用

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

在本試驗(yàn)劑量條件下，各給藥組裸小鼠體重與模型對(duì)照組相比均無顯著性差異(p>0.05)。

試驗(yàn)結(jié)束，剖檢所有試驗(yàn)小鼠，各臟器未發(fā)現(xiàn)任何肉眼可見的異常病變，所有給藥組裸小鼠

脾臟濕重指數(shù)與模型對(duì)照組相比無顯著性差異(p>0.05)。詳見表7、表8。

表7.小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠脾臟指數(shù)的影響

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

表8.小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠體重的影響

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

表8(續(xù)).小分子果膠對(duì)荷瘤裸小鼠體重的影響

mean±se，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs.模型對(duì)照，t-test。

試驗(yàn)結(jié)論

皮下移植人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞的裸小鼠連續(xù)35日經(jīng)口給予小分子果膠口服液高劑量(56.25mg/kg)，對(duì)腫瘤生長具有顯著抑制作用(p<0.05)，抑制率達(dá)53.9％；給予小分子果膠中劑量(28.13mg/kg)，對(duì)腫瘤生長無顯著抑制作用(p>0.05)，抑制率為23.3％；給予小分子果膠口服液低劑量(14.06mg/kg)，對(duì)腫瘤生長無顯著抑制作用(p>0.05)，抑制率為5.0％。小分子果膠口服液對(duì)人非小細(xì)胞肺癌pc-9細(xì)胞裸小鼠皮下移植瘤生長的抑制作用具有劑量依賴性，無明顯毒副作用。