本發(fā)明涉及組織工程皮膚技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法。
背景技術(shù)：
近年來，各種組織工程皮膚如apligrafvr、dermagraftvr等已應(yīng)用于臨床進(jìn)行創(chuàng)面的修復(fù)?，F(xiàn)組織工程皮膚的種子細(xì)胞大多是同種異體的角質(zhì)形成細(xì)胞，但從諸多方面考慮，角質(zhì)形成細(xì)胞并不是一種理想的種子細(xì)胞。為使組織工程皮膚更好的應(yīng)用于臨床，用羊膜上皮細(xì)胞(haecs)作為種子細(xì)胞將是一個(gè)更好、更有新意的選擇。haecs較其他細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)在于它具有向三個(gè)胚層分化的可塑性，且它表達(dá)生長因子(egf、kgf、hgf)及抗炎和抗菌的細(xì)胞因子，這些有利于創(chuàng)面的愈合。因羊膜是產(chǎn)后廢棄物，取材容易，且無倫理學(xué)爭議。重要的是，haecs與人類的胚胎干細(xì)胞不一樣，它不表達(dá)端粒酶，故在移植時(shí)不會(huì)形成腫瘤。因haecs免疫源性低，因此在移植后發(fā)生免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)很低。故haecs在組織工程皮膚再生中是一個(gè)有前景的種子細(xì)胞。
除種子細(xì)胞外，選擇合適的真皮替代物是構(gòu)建組織工程皮膚的關(guān)鍵。雖然目前大多數(shù)的真皮替代物能夠模擬真皮的結(jié)構(gòu)和功能，但幾乎都缺乏有效的基底膜結(jié)構(gòu)和功能，表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞在這種缺乏基底膜的真皮替代物上會(huì)逐漸失去增殖能力。為解決這一問題，越來越多的研究者都在尋求一種具備基底膜結(jié)構(gòu)的真皮支架。大量研究表明通過在真皮替代物上添加天然或人工合成的基底膜成分，體外構(gòu)建的模型中表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖會(huì)明顯增強(qiáng)，且形成的人工表皮層的功能也有明顯的改善。去表皮的真皮組織(ded)是把皮膚組織從基底膜(bm)的透明層處去除表皮而獲得的，故在ded的表面保留了大多數(shù)的基底膜成分，如層粘蛋白、iv型膠原和vii型膠原等。故具有完整基底膜結(jié)構(gòu)的ded有利于haecs的分化、復(fù)層、角化，使得構(gòu)建的組織工程皮膚與正常人皮膚更加接近。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法，構(gòu)建的組織工程皮膚模型中表皮的角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖明顯增強(qiáng)，且形成的人工表皮層的功能也有明顯的改善，為組織工程皮膚的構(gòu)建提供一種新的更好的選擇。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法，是以人羊膜上皮細(xì)胞(haecs)作為種子細(xì)胞，以人去表皮的真皮組織(de-epidermizeddermis,ded)作為支架材料，將種子細(xì)胞種植于支架材料上構(gòu)建haecs-ded組織工程皮膚，包括以下步驟：1)haecs的分離培養(yǎng)；2)成纖維細(xì)胞(fb)的分離培養(yǎng)；3)ded的制備；4)haecs-ded組織工程皮膚的構(gòu)建。
進(jìn)一步地，在上述方案中，所述haecs的分離培養(yǎng)具體方法為：將羊膜組織用磷酸鹽緩沖液(pbs)反復(fù)加以沖洗后剪成細(xì)碎小塊，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(edta)溶液，37℃消化10min，棄消化液(主要去除雜細(xì)胞和細(xì)胞碎片)；后重復(fù)上述方法消化上皮細(xì)胞，37℃消化30-40min，200目不銹鋼網(wǎng)過濾；收集單細(xì)胞懸液，加含10％胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；過濾后組織碎片用同樣方法重復(fù)消化1次；離心收集的細(xì)胞用添加10ng/mlegf的dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；24h首次換液，后每3天全量換液一次，約10天后細(xì)胞可按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)；第二代haec細(xì)胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分別進(jìn)行oct-3/4、ssea-4免疫熒光檢測(cè)。
進(jìn)一步地，在上述方案中，所述成纖維細(xì)胞(fb)的分離培養(yǎng)具體方法為：將表皮組織標(biāo)本浸入d-hanks溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫?個(gè)小時(shí)內(nèi)使用；將包皮在無菌條件下用pbs(含100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)沖洗5遍，用眼科剪剪去皮下組織,將皮膚組織剪成大小約0.5cm×1cm的細(xì)長條，放入2.5mg/mldispase酶中4℃消化16～18h；次日取出，將表皮與真皮分離；將分離出的真皮組織放入10ml的無菌青霉素瓶中，加入0.2％ⅳ型膠原酶溶液3ml，37℃消化2～3h，消化后用眼科剪刀將真皮組織剪碎，向瓶中加入含10％fbs的dmem3ml終止消化，巴氏吸管吹打數(shù)十次，低速離心(1000r/min)5min，棄上清液，用含10％fbs的dmem培養(yǎng)基1ml重懸，計(jì)數(shù)板計(jì)算，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，接種于一次性培養(yǎng)瓶中；置5％co2、37℃孵箱中培養(yǎng)，24h后首次換液去除未貼壁的細(xì)胞，以后2～3天換液1次；7～10天后培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70％～80％融合狀態(tài)時(shí)，傳代純化培養(yǎng)，可獲得成纖維細(xì)胞(fb)。
進(jìn)一步地，在上述方案中，所述ded的制備方法具體為：取成人皮膚標(biāo)本常規(guī)消毒，加入適量pbs，置于4℃冰箱中備用；制備前用pbs清洗標(biāo)本數(shù)次，常規(guī)消毒；用眼科剪小心去除皮下脂肪組織層，制成lcm×1cm大小皮片；浸于56℃pbs中30min；用眼科鑷去除表皮，將人去表皮的真皮組織(de-epidermizeddermis,ded)置于epp管中，迅速置入液氮中約5min，取出后室溫放置30min，然后再置入液氮中，連續(xù)10個(gè)循環(huán)；后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
進(jìn)一步地，在上述方案中，所述haecs-ded組織工程皮膚的構(gòu)建具體方法為：
s1：haecs細(xì)胞懸液的制備：倒置顯微鏡觀察haecs生長狀態(tài)，取第1-2代對(duì)數(shù)生長期haecs；吸去培養(yǎng)基，以pbs液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼壁細(xì)胞；鏡下觀察細(xì)胞由卵圓形變圓、細(xì)胞間隙增大，少量細(xì)胞開始脫落時(shí)，加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化；吹打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)；棄上清液，重懸于haecs完全培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x106/ml，待用；
s2：fb細(xì)胞懸液的制備：倒置顯微鏡觀察fb生長狀態(tài)，取第3代對(duì)數(shù)生長期fb；吸去培養(yǎng)基，以pbs液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼壁細(xì)胞，加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化；吹打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)；棄上清液，重懸于含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x105/ml，待用；
s3：ded預(yù)處理：將ded置于4℃冰箱中12h，然后浸于haecs完全培養(yǎng)基中；5％co2、37℃環(huán)境中浸泡48h，備用；為促使haecs能夠更好地貼附生長，接種前須將ded預(yù)處理；
s4：組織工程皮膚的構(gòu)建：將經(jīng)預(yù)處理的ded，置于六孔板中，ded基底膜面向下，加入haec完全培養(yǎng)基，1ml/孔，用移液器將備好的fb細(xì)胞懸液150μl接種于1-5孔的ded上，第6孔中ded上加150μlpbs作為空白對(duì)照；置于5％co2、37℃環(huán)境中孵育過夜，以促使fb能夠貼附于ded的網(wǎng)狀真皮面；孵育過夜后，把ded翻轉(zhuǎn)，使ded的基底膜面朝上，將備好的haec細(xì)胞懸液150μl接種于1-5孔的ded基底膜面上，第6孔中加入150μlpbs作為空白對(duì)照，后每孔加入haec完全培養(yǎng)基，使之浸沒ded，置于5％co2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)；液下培養(yǎng)3天，使得haec達(dá)到融合，后將ded置于支撐架上，調(diào)整培養(yǎng)基的量，使haec在氣液界面上培養(yǎng)生長；5％co2、37℃環(huán)境中繼續(xù)氣-液面培養(yǎng)2周。
進(jìn)一步地，所述haecs完全培養(yǎng)基的配方為：基礎(chǔ)dmem培養(yǎng)基，10％胎牛血清，10ng/mlegf，青、鏈霉素各100u/ml，表皮生長因子0.5～1.5ng/ml、dkk1蛋白10～18ng/ml、丙酸睪酮1×10-9～1.2×10-7mol/l。
更進(jìn)一步地，在所述dmem培養(yǎng)基中還含有腺苷酸環(huán)化酶激活劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3，腺苷酸環(huán)化酶激活劑在dmem培養(yǎng)基中的體積百分比濃度為0.01-0.03％，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3在dmem培養(yǎng)基中的體積百分比濃度為0.02-0.05％，加入腺苷酸環(huán)化酶激活劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3使培養(yǎng)基營養(yǎng)素更加豐富，尤其可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，利于haecs、fb及ded的培養(yǎng)。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明選擇羊膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞，選擇人去表皮的真皮組織作為支架，羊膜上皮細(xì)胞易于分離培養(yǎng)，并可在體外大量擴(kuò)增，且具有干細(xì)胞的特性，人去表皮的真皮組織是富含膠原的三維結(jié)構(gòu)，其表面保留基底膜部分結(jié)構(gòu)及成分，是一種天然真皮替代物，在體外重建皮膚的研究中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，羊膜上皮細(xì)胞在人去表皮的真皮組織上進(jìn)行器官培養(yǎng)可以構(gòu)建出與正常皮膚結(jié)構(gòu)類似的組織工程皮膚，種子細(xì)胞和支架均是來自于人體，具有同源性，在人去表皮的真皮組織上發(fā)育的新生表皮具有與自體皮膚相近的增殖及分化標(biāo)記分子。使用本發(fā)明的方法構(gòu)建的組織工程皮膚具有與正常皮膚相似的組織結(jié)構(gòu)和功能，還具備正常表皮增殖和分化的某些特征。
附圖說明
圖1是原代培養(yǎng)的haecs的形態(tài)特征，其中圖1-a為×100，圖1-b為×200；
圖2是原代培養(yǎng)的kcs的形態(tài)特征，其中圖2-a為×100，圖2-b為×200；
圖3是廣譜細(xì)胞角蛋白免疫組化染色結(jié)果，圖3-a為haecs胞漿染成棕褐色，蘇木精襯染的胞核呈藍(lán)紫色，圖3-b為kcs為陽性對(duì)照；
圖4是ck18免疫組化染色結(jié)果，其中，圖4-a為haecs胞漿染成棕褐色，蘇木精襯染的胞核呈藍(lán)紫色，圖4-b為kcs染色為陰性；
圖5是波形蛋白免疫組化染色(vimentin染色)結(jié)果，其中圖5-a為×100，圖5-b為×400；
圖6是oct-4免疫熒光檢測(cè)和ssea-4免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，其中圖6-a為oct-4免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，圖6-b為ssea-4免疫熒光檢測(cè)結(jié)果；
圖7是流式細(xì)胞儀檢測(cè)haecs的細(xì)胞周期圖；
圖8是he染色ded的染色結(jié)果；
圖9是波形蛋白免疫組化染色ded的染色結(jié)果；
圖10是苦味酸-酸性品紅染色ded的染色結(jié)果；
圖11是醛品紅染色ded的染色結(jié)果；
圖12是過碘酸雪夫氏染色ded的染色結(jié)果；
圖13是ⅳ型膠原染色ded的染色結(jié)果；
圖14是層粘蛋白染色ded的染色結(jié)果；
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法，是以人羊膜上皮細(xì)胞(haecs)作為種子細(xì)胞，以人去表皮的真皮組織(de-epidermizeddermis,ded)作為支架材料，將種子細(xì)胞種植于支架材料上構(gòu)建haecs-ded組織工程皮膚，包括以下步驟：1)haecs的分離培養(yǎng)；2)成纖維細(xì)胞(fb)的分離培養(yǎng)；3)ded的制備；4)haecs-ded組織工程皮膚的構(gòu)建。
其中，所述haecs的分離培養(yǎng)具體方法為：將羊膜組織用磷酸鹽緩沖液(pbs)反復(fù)加以沖洗后剪成細(xì)碎小塊，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(edta)溶液，37℃消化10min，棄消化液(主要去除雜細(xì)胞和細(xì)胞碎片)；后重復(fù)上述方法消化上皮細(xì)胞，37℃消化30-40min，200目不銹鋼網(wǎng)過濾；收集單細(xì)胞懸液，加含10％胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；過濾后組織碎片用同樣方法重復(fù)消化1次；離心收集的細(xì)胞用添加10ng/mlegf的dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；24h首次換液，后每3天全量換液一次，10天后細(xì)胞可按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)；第二代haec細(xì)胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分別進(jìn)行oct-3/4、ssea-4免疫熒光檢測(cè)。
其中，所述成纖維細(xì)胞(fb)的分離培養(yǎng)具體方法為：將表皮組織標(biāo)本浸入d-hanks溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫?個(gè)小時(shí)內(nèi)使用；將包皮在無菌條件下用pbs(含100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)沖洗5遍，用眼科剪剪去皮下組織,將皮膚組織剪成大小約0.5cm×1cm的細(xì)長條，放入2.5mg/mldispase酶中4℃消化16h；次日取出，將表皮與真皮分離；將分離出的真皮組織放入10ml的無菌青霉素瓶中，加入0.2％ⅳ型膠原酶溶液3ml，37℃消化2h，消化后用眼科剪刀將真皮組織剪碎，向瓶中加入含10％fbs的dmem3ml終止消化，巴氏吸管吹打數(shù)十次，低速離心(1000r/min)5min，棄上清液，用含10％fbs的dmem培養(yǎng)基1ml重懸，計(jì)數(shù)板計(jì)算，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，接種于一次性培養(yǎng)瓶中；置5％co2、37℃孵箱中培養(yǎng)，24h后首次換液去除未貼壁的細(xì)胞，以后2天換液1次；7天后培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70％融合狀態(tài)時(shí)，傳代純化培養(yǎng)，可獲得成纖維細(xì)胞(fb)。
其中，所述ded的制備方法具體為：取成人皮膚標(biāo)本常規(guī)消毒，加入適量pbs，置于4℃冰箱中備用；制備前用pbs清洗標(biāo)本數(shù)次，常規(guī)消毒；用眼科剪小心去除皮下脂肪組織層，制成lcm×1cm大小皮片；浸于56℃pbs中30min；用眼科鑷去除表皮，將人去表皮的真皮組織(de-epidermizeddermis,ded)置于epp管中，迅速置入液氮中約5min，取出后室溫放置30min，然后再置入液氮中，連續(xù)10個(gè)循環(huán)；后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
其中，所述haecs-ded組織工程皮膚的構(gòu)建具體方法為：
s1：haecs細(xì)胞懸液的制備：倒置顯微鏡觀察haecs生長狀態(tài)，取第1代對(duì)數(shù)生長期haecs；吸去培養(yǎng)基，以pbs液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼壁細(xì)胞；鏡下觀察細(xì)胞由卵圓形變圓、細(xì)胞間隙增大，少量細(xì)胞開始脫落時(shí)，加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化；吹打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)；棄上清液，重懸于haecs完全培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x106/ml，待用；
s2：fb細(xì)胞懸液的制備：倒置顯微鏡觀察fb生長狀態(tài)，取第3代對(duì)數(shù)生長期fb；吸去培養(yǎng)基，以pbs液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼壁細(xì)胞，加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化；吹打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)；棄上清液，重懸于含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x105/ml，待用；
s3：ded預(yù)處理：將ded置于4℃冰箱中12h，然后浸于haecs完全培養(yǎng)基中；5％co2、37℃環(huán)境中浸泡48h，備用；為促使haecs能夠更好地貼附生長，接種前須將ded預(yù)處理；
s4：組織工程皮膚的構(gòu)建：將經(jīng)預(yù)處理的ded，置于六孔板中，ded基底膜面向下，加入haec完全培養(yǎng)基，1ml/孔，用移液器將備好的fb細(xì)胞懸液150μl接種于1-5孔的ded上，第6孔中ded上加150μlpbs作為空白對(duì)照；置于5％co2、37℃環(huán)境中孵育過夜，以促使fb能夠貼附于ded的網(wǎng)狀真皮面；孵育過夜后，把ded翻轉(zhuǎn)，使ded的基底膜面朝上，將備好的haec細(xì)胞懸液150μl接種于1-5孔的ded基底膜面上，第6孔中加入150μlpbs作為空白對(duì)照，后每孔加入haec完全培養(yǎng)基，使之浸沒ded，置于5％co2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)；液下培養(yǎng)3天，使得haec達(dá)到融合，后將ded置于支撐架上，調(diào)整培養(yǎng)基的量，使haec在氣液界面上培養(yǎng)生長；5％co2、37℃環(huán)境中繼續(xù)氣-液面培養(yǎng)2周。
在以上所用到的dmem培養(yǎng)基中都加入的有腺苷酸環(huán)化酶激活劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3，腺苷酸環(huán)化酶激活劑在dmem培養(yǎng)基中的體積百分比濃度為0.01％，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3在dmem培養(yǎng)基中的體積百分比濃度為0.02％，加入腺苷酸環(huán)化酶激活劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3使培養(yǎng)基營養(yǎng)素更加豐富，尤其可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，利于haecs、fb及ded的培養(yǎng)。
實(shí)施例2：
一種羊膜上皮細(xì)胞復(fù)合去表皮真皮構(gòu)建組織工程皮膚的方法，是以人羊膜上皮細(xì)胞(haecs)作為種子細(xì)胞，以人去表皮的真皮組織(de-epidermizeddermis,ded)作為支架材料，將種子細(xì)胞種植于支架材料上構(gòu)建haecs-ded組織工程皮膚，包括以下步驟：1)haecs的分離培養(yǎng)；2)成纖維細(xì)胞(fb)的分離培養(yǎng)；3)ded的制備；4)haecs-ded組織工程皮膚的構(gòu)建。
其中，所述haecs的分離培養(yǎng)具體方法為：將羊膜組織用磷酸鹽緩沖液(pbs)反復(fù)加以沖洗后剪成細(xì)碎小塊，加入含有0.05％胰蛋白酶-0.02％乙二胺四乙酸(edta)溶液，37℃消化10min，棄消化液(主要去除雜細(xì)胞和細(xì)胞碎片)；后重復(fù)上述方法消化上皮細(xì)胞，37℃消化40min，200目不銹鋼網(wǎng)過濾；收集單細(xì)胞懸液，加含10％胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化；過濾后組織碎片用同樣方法重復(fù)消化1次；離心收集的細(xì)胞用添加10ng/mlegf的dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％co2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)；24h首次換液，后每3天全量換液一次，約10天后細(xì)胞可按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)；第二代haec細(xì)胞爬片后用4％多聚甲醛固定，分別進(jìn)行oct-3/4、ssea-4免疫熒光檢測(cè)。
其中，所述成纖維細(xì)胞(fb)的分離培養(yǎng)具體方法為：將表皮組織標(biāo)本浸入d-hanks溶液中，4℃保存?zhèn)溆茫?個(gè)小時(shí)內(nèi)使用；將包皮在無菌條件下用pbs(含100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)沖洗5遍，用眼科剪剪去皮下組織,將皮膚組織剪成大小約0.5cm×1cm的細(xì)長條，放入2.5mg/mldispase酶中4℃消化18h；次日取出，將表皮與真皮分離；將分離出的真皮組織放入10ml的無菌青霉素瓶中，加入0.2％ⅳ型膠原酶溶液3ml，37℃消化3h，消化后用眼科剪刀將真皮組織剪碎，向瓶中加入含10％fbs的dmem3ml終止消化，巴氏吸管吹打數(shù)十次，低速離心(1000r/min)5min，棄上清液，用含10％fbs的dmem培養(yǎng)基1ml重懸，計(jì)數(shù)板計(jì)算，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，接種于一次性培養(yǎng)瓶中；置5％co2、37℃孵箱中培養(yǎng)，24h后首次換液去除未貼壁的細(xì)胞，以后3天換液1次；10天后培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到80％融合狀態(tài)時(shí)，傳代純化培養(yǎng)，可獲得成纖維細(xì)胞(fb)。
其中，所述ded的制備方法具體為：取成人皮膚標(biāo)本常規(guī)消毒，加入適量pbs，置于4℃冰箱中備用；制備前用pbs清洗標(biāo)本數(shù)次，常規(guī)消毒；用眼科剪小心去除皮下脂肪組織層，制成lcm×1cm大小皮片；浸于56℃pbs中30min；用眼科鑷去除表皮，將人去表皮的真皮組織(de-epidermizeddermis,ded)置于epp管中，迅速置入液氮中約5min，取出后室溫放置30min，然后再置入液氮中，連續(xù)10個(gè)循環(huán)；后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
其中，所述haecs-ded組織工程皮膚的構(gòu)建具體方法為：
s1：haecs細(xì)胞懸液的制備：倒置顯微鏡觀察haecs生長狀態(tài)，取第2代對(duì)數(shù)生長期haecs；吸去培養(yǎng)基，以pbs液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼壁細(xì)胞；鏡下觀察細(xì)胞由卵圓形變圓、細(xì)胞間隙增大，少量細(xì)胞開始脫落時(shí)，加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化；吹打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)；棄上清液，重懸于haecs完全培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x106/ml，待用；
s2：fb細(xì)胞懸液的制備：倒置顯微鏡觀察fb生長狀態(tài)，取第3代對(duì)數(shù)生長期fb；吸去培養(yǎng)基，以pbs液清洗兩遍；加入0.25％胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼壁細(xì)胞，加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化；吹打培養(yǎng)瓶壁上細(xì)胞，離心收集細(xì)胞(1000r/min，5min)；棄上清液，重懸于含10％fbs的dmem培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x105/ml，待用；
s3：ded預(yù)處理：將ded置于4℃冰箱中12h，然后浸于haecs完全培養(yǎng)基中；5％co2、37℃環(huán)境中浸泡48h，備用；為促使haecs能夠更好地貼附生長，接種前須將ded預(yù)處理；
s4：組織工程皮膚的構(gòu)建：將經(jīng)預(yù)處理的ded，置于六孔板中，ded基底膜面向下，加入haec完全培養(yǎng)基，1ml/孔，用移液器將備好的fb細(xì)胞懸液150μl接種于1-5孔的ded上，第6孔中ded上加150μlpbs作為空白對(duì)照；置于5％co2、37℃環(huán)境中孵育過夜，以促使fb能夠貼附于ded的網(wǎng)狀真皮面；孵育過夜后，把ded翻轉(zhuǎn)，使ded的基底膜面朝上，將備好的haec細(xì)胞懸液150μl接種于1-5孔的ded基底膜面上，第6孔中加入150μlpbs作為空白對(duì)照，后每孔加入haec完全培養(yǎng)基，使之浸沒ded，置于5％co2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)；液下培養(yǎng)3天，使得haec達(dá)到融合，后將ded置于支撐架上，調(diào)整培養(yǎng)基的量，使haec在氣液界面上培養(yǎng)生長；5％co2、37℃環(huán)境中繼續(xù)氣-液面培養(yǎng)2周。
在以上所用到的dmem培養(yǎng)基中都加入的有腺苷酸環(huán)化酶激活劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3，腺苷酸環(huán)化酶激活劑在dmem培養(yǎng)基中的體積百分比濃度為0.03％，神經(jīng)營養(yǎng)因子-3在dmem培養(yǎng)基中的體積百分比濃度為0.05％，加入腺苷酸環(huán)化酶激活劑和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3使培養(yǎng)基營養(yǎng)素更加豐富，尤其可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，利于haecs、fb及ded的培養(yǎng)。
對(duì)上述實(shí)施例2所制備的haecs、kcs、fb進(jìn)行免疫組化檢測(cè)：
制備kcs，作為對(duì)照組：在上述制備fb的過程中，表皮與真皮分離后,將表皮剪碎，加入0.25％胰酶-0.01％edta室溫下消化2min后，加入完全k-sfm培養(yǎng)基終止消化，離心(1000r/min)，棄上清液，pbs重懸細(xì)胞，再離心，棄上清液，用完全k-sfm混懸，計(jì)數(shù)板計(jì)算，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，接種于一次性培養(yǎng)瓶中，置5％co2、37℃孵箱中培養(yǎng)，24h后首次換液去除未貼壁的細(xì)胞，以后2天換液1次。15天后培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到70～80％融合狀態(tài)時(shí)，傳代純化培養(yǎng)，可獲得表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(kcs)。
完全k-sfm(egf2ng/ml、bpe30μg/ml)的配方為：一套k-sfm基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml，egf2.5μg，bpe25mg，k-sfm基礎(chǔ)培養(yǎng)基500ml分裝成100ml×5瓶，egf室溫下完全溶解，加pbs至1.8ml，存于epp管中，－20℃保存?zhèn)溆?；bpe室溫下完全溶解，約3ml，分裝至epp管中，每管320μl，－20℃保存?zhèn)溆?；使用時(shí)，將144μlegf、320μlbpe、1ml谷氨酰胺、1ml雙抗(青霉素、鏈霉素)加入100ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.原代培養(yǎng)的haecs的形態(tài)特征：原代haecs接種24h后，大部分細(xì)胞貼壁，剛貼壁的細(xì)胞呈圓形，折光性強(qiáng)，隨后細(xì)胞胞質(zhì)逐漸展開，折光性減弱。細(xì)胞貼壁約3-5天后進(jìn)入指數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞呈扁平多角形，核/漿比率小胞核呈圓形、卵圓形，約6-8天形成單層，細(xì)胞融合成片成鋪路石樣，如圖1所示，其中圖1-a為×100，圖1-b為×200。
倒置顯微鏡下觀察最初接種的表皮細(xì)胞中有大量的kcs、少許黑素細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，使用差別胰酶處理后，留下為較為純凈的kcs。差別胰酶處理后的第2代kcs，細(xì)胞已經(jīng)融合，呈典型上皮細(xì)胞鋪路石樣、克隆狀生長，單個(gè)細(xì)胞為圓形、多角形，輪廓清楚、折光性好。如圖2所示，其中圖2-a為×100，圖2-b為×200。
2.廣譜細(xì)胞角蛋白免疫組化染色(ckpan染色):分別取第二代haecs、kcs進(jìn)行細(xì)胞爬片，pbs清洗標(biāo)本3次各1min，4％多聚甲醛固定15min，用1％bsa在37℃封閉30min，0.5％tritonx-100孵育15min，pbs清洗標(biāo)本3次各1min。3％h2o2孵育15min，小鼠抗人pan-cytokeratin抗體(1:100)4℃過夜。pbs清洗標(biāo)本3次各5min，二抗工作液孵育37℃30min，pbs清洗標(biāo)本約3-10min，蒸餾水洗2次1min，蘇木素復(fù)染1min，自來水洗返藍(lán)。梯度酒精脫水75，85，95，100％各3min，二甲苯透明2次3min，中性樹膠封片。以pbs代替一抗做空白對(duì)照。原代培養(yǎng)獲得的haecs的上皮細(xì)胞標(biāo)記物ckpan染色陽性，胞漿染成棕褐色，蘇木精襯染的胞核呈藍(lán)紫色，說明培養(yǎng)的細(xì)胞是具有上皮特征的細(xì)胞，如圖3所示，其中，圖3-a為haecs胞漿染成棕褐色，蘇木精襯染的胞核呈藍(lán)紫色，圖3-b為kcs為陽性對(duì)照。(×200)。
3.ck18免疫組化染色：分別取第二代haecs、kcs進(jìn)行細(xì)胞爬片，pbs清洗標(biāo)本3次各1min，4％多聚甲醛固定15min，用1％bsa在37℃封閉30min，0.5％tritonx-100孵育15min，pbs清洗標(biāo)本3次各1min。3％h2o2孵育15min，小鼠抗人cytokeratin18抗體(1:100)4℃過夜。pbs清洗標(biāo)本3次各5min，二抗工作液孵育37℃30min，pbs清洗標(biāo)本約3-10min，蒸餾水洗2次1min，蘇木素復(fù)染1min，自來水洗返藍(lán)。梯度酒精脫水75，85，95，100％各3min，二甲苯透明2次3min，中性樹膠封片。以pbs代替一抗做空白對(duì)照。haecs的簡單原始上皮的標(biāo)志物ck18染色陽性，胞漿染成棕褐色，蘇木精襯染的胞核呈藍(lán)紫色，如圖4所示，其中，圖4-a為haecs胞漿染成棕褐色，蘇木精襯染的胞核呈藍(lán)紫色，圖4-b為kcs染色為陰性。(×200)。
4.波形蛋白免疫組化染色(vimentin染色):檢測(cè)成纖維細(xì)胞。取第五代fb進(jìn)行細(xì)胞爬片，pbs清洗標(biāo)本次各1min，4％多聚甲醛固定15min，用1％bsa在37℃封閉30min，0.5％tritonx-100孵育15min，pbs清洗標(biāo)本3次各1min。3％h2o2孵育15min，小鼠抗人vimentin抗體(1:100)4℃過夜。pbs清洗標(biāo)本3次各5min，二抗工作液孵育37℃30min，pbs清洗標(biāo)本約3-10min，蒸餾水洗2次1min，蘇木素復(fù)染1min，自來水洗返藍(lán)。梯度酒精脫水75，85，95，100％各3min，二甲苯透明2次3min，中性樹膠封片。以pbs代替一抗做空白對(duì)照。fb剛接種尚未貼壁時(shí)呈圓形,貼壁后細(xì)胞逐漸伸展呈長梭形，多角形或不規(guī)則形，2-3d即呈匯合狀態(tài)，細(xì)胞密度低時(shí)細(xì)胞之間排列疏松，有較大細(xì)胞間隙，細(xì)胞密度高時(shí)，細(xì)胞相互平行排列或呈放射狀和漩渦狀排列，如圖5-a所示。fb的特異性標(biāo)志蛋白波形蛋白(vimentin)染色陽性，胞漿內(nèi)見大量棕褐色顆粒，核為藍(lán)色，如圖5-b所示。
5.用免疫熒光的方法檢測(cè)haecs的干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記物(oct-4、ssea-4)的表達(dá)情況：
4、oct-3/4免疫熒光檢測(cè)：分別取第二代haecs、kcs進(jìn)行細(xì)胞爬片，pbs清洗標(biāo)本3次各1min，4％多聚甲醛固定10min，pbs漂洗5min，0.2％triton穿孔15min，pbs漂洗2次，每次5min，1％bsa封閉30min，加入1％bsa稀釋的鼠抗人oct-3/4(1:100),于4℃過夜。pbs漂洗2次，每次5min，fitc熒光素標(biāo)記的二抗，于37℃雜交1h，pbs漂洗2次，每次5min，5ug/mldapi染色2min，熒光顯微鏡觀察。以pbs代替一抗做空白對(duì)照。
ssea-4免疫熒光檢測(cè)：分別取第二代haecs、kcs進(jìn)行細(xì)胞爬片，pbs清洗標(biāo)本3次各1min，4％多聚甲醛固定10min，pbs漂洗5min，0.2％triton穿孔15min，pbs漂洗2次，每次5min，1％bsa封閉30min，加入1％bsa稀釋的鼠抗人ssea-4(1:100),于4℃過夜。pbs漂洗2次，每次5min，fitc熒光素標(biāo)記的二抗，于37℃雜交1h，pbs漂洗2次，每次5min，5ug/mldapi染色2min，熒光顯微鏡觀察。以pbs代替一抗做對(duì)照。
結(jié)果顯示，haecs中oct-4、ssea-4表達(dá)均為陽性，且表達(dá)主要在細(xì)胞高密度區(qū)或細(xì)胞小克隆區(qū)或球體結(jié)構(gòu)區(qū)，在haecs比較稀疏的區(qū)域幾乎無表達(dá)。對(duì)照組kcs中oct-4、ssea-4表達(dá)均為陰性，如圖6所示。其中，第二代haecs免疫熒光示oct-4蛋白為細(xì)胞核表達(dá)(綠色熒光)，且主要在細(xì)胞高密度區(qū)表達(dá)。對(duì)照組kcs中無oct-4蛋白表達(dá)(見圖6-a)。第二代haecs免疫熒光示ssea-4蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)(綠色熒光)，且主要在細(xì)胞克隆區(qū)或球體結(jié)構(gòu)區(qū)表達(dá)。對(duì)照組kcs中無ssea-4蛋白表達(dá)(見圖6-b)scalebar:50μm.
6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)haecs的細(xì)胞周期：取第二代haecs(n＝20)，胰酶消化收集細(xì)胞，細(xì)胞密度均調(diào)整為5x106，pbs洗兩遍，棄上清，加入1ml70％預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12小時(shí)以上。pbs洗滌去乙醇，1000rpm,5min，洗兩遍。0.5mlpbs重懸細(xì)胞，加入pi和rnasea至終濃度50μg/ml，37℃溫浴30min。用流式細(xì)胞儀測(cè)定周期。以kcs做對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)haecs的細(xì)胞周期特征顯示：haecs是一種具有高分化潛能的細(xì)胞，大部分細(xì)胞處于g0/g1期(82.14％±3.69％),少數(shù)處于s+g2/m期(17.86％±3.69％)；對(duì)照組kcs中處于g0/g1期為58.22％±4.82％,處于s+g2/m期為41.79％±4.81％。處于g0/g1期的haecs和kcs兩種細(xì)胞的百分率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)，且在haecs中，處于g0/g1與s+g2/m的細(xì)胞百分率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.001)，如圖7所示。
7.ded組織結(jié)構(gòu)特征：
1)蘇木精-伊紅染色(he染色)：用于觀察ded的組織結(jié)構(gòu)。常規(guī)石蠟切片(約4um)。染色步驟:二甲苯4min，二甲苯4min，二甲苯4min,100％乙醇4min,100％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,70％乙醇4min,蒸溜水,蘇木素染色4min,水洗5min,伊紅染色3osec,70％乙醇15sec,70％乙醇15sec,95％乙醇15sec,95％乙醇15sec,100％乙醇3osec,100％乙醇3osec,二甲苯5min,二甲苯5min,固定，封片。
2)波形蛋白免疫組化染色(vimentin染色)：檢測(cè)成纖維細(xì)胞。取石蠟包埋的標(biāo)本，連續(xù)切片，常規(guī)免疫組化染色，一抗為鼠抗人vimentin單抗，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，abc法，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染。以pbs代替一抗做陰性對(duì)照。
3)苦味酸-酸性品紅染色(vangiesonstain，vg染色):石蠟切片，脫蠟，水洗，weigert鐵蘇木素染色5min，水洗5min，van.gieson氏液染色5min，蒸溜水漂洗，95％乙醇分化，二甲苯透明，標(biāo)本固定。染色結(jié)果判斷:膠原纖維染成粉紅色。
4)醛品紅染色:石蠟切片，脫蠟，水洗，lugol碘液5min，水洗，5％硫代硫酸鈉水溶液5min，流水沖洗。70％酒精溶液中漂洗，醛品紅染液內(nèi)10min，70％酒精溶液洗滌2次，水洗，桔黃g染液染色作對(duì)比染色。常規(guī)脫水，透明，封固。染色結(jié)果判斷:彈力纖維呈深紫色，底色為不同程度的黃色。
5)過碘酸雪夫氏染色(pas)：檢測(cè)ded組織基底膜情況。染色步驟:脫蠟，水洗，0.5％過碘酸(periodicacid)溶液1omin,蒸溜水漂洗,雪夫(schiff)氏液1omin,蒸溜水漂洗,1％亞硫酸氫鈉(sodiumbisulfite)溶液兩次，每次3min,水洗5min,脫水固定，封存。
6)ⅳ型膠原染色：觀察ded基底膜成分。取石蠟包埋的標(biāo)本，連續(xù)切片，常規(guī)免疫組化染色，一抗為鼠抗人typeivcollagen單抗(1:150)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，abc法，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染。以pbs代替一抗做陰性對(duì)照。
7)層粘蛋白染色(laminin染色)：觀察ded基底膜成分。取石蠟包埋的標(biāo)本，連續(xù)切片，常規(guī)免疫組化染色，一抗為鼠抗人laminin單抗(1:150)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體，abc法，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染。以pbs代替一抗做陰性對(duì)照。
結(jié)果：he染色顯示ded中無細(xì)胞核(見圖8)、波形蛋白免疫組化顯示去表皮真皮中無波形蛋白表達(dá)(見圖9)。vg染色顯示去表皮真皮膠原纖維染成紅色(見圖10)，醛品紅染色顯示去表皮真皮彈力纖維染成深紫色(見圖11)，故可確定ded組織中富含膠元纖維和彈力纖維。pas染色顯示在ded表皮側(cè)的表面存在一條紫紅色帶，顯示pas反應(yīng)陽性。說明ded的表面含有較多量的中性粘多糖。(見圖12)。進(jìn)一步免疫組化檢測(cè)示在ded相同部位即基底膜帶處及附屬器殘留部位1v型膠原(typeivcollagen)及層粘蛋白(laminin)表達(dá)(見圖13,14)。說明ded的表面存在基底膜蛋白成分。