本發(fā)明涉及骨肽的制備和應(yīng)用，具體涉及一種用于預(yù)防和治療腫瘤化療所引起的骨髓損傷的多肽的制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，癌癥治療方法主要包括手術(shù)、放療和化療，以化學(xué)藥物治療成為了許多晚期腫瘤患者的選擇。但是大多數(shù)化療藥物是通過(guò)損傷細(xì)胞核dna或干擾dna的合成而起到殺傷細(xì)胞作用，因而對(duì)于分裂繁殖旺盛的正常組織細(xì)胞(如胃腸道上皮細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞及生發(fā)細(xì)胞等)均有殺傷作用，產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、脫發(fā)、疲勞、免疫抑制或心、腎、神經(jīng)系統(tǒng)的損害。骨髓抑制是其中最主要的不良反應(yīng)。臨床上出現(xiàn)全血細(xì)胞減少，從而繼發(fā)嚴(yán)重感染、出血、衰竭、死亡。骨髓抑制是多數(shù)化療藥的常見(jiàn)毒性反應(yīng)，大多數(shù)化療藥均可引起有不同程度的骨髓抑制，使周?chē)?xì)胞數(shù)量減少，血細(xì)胞由多種成分組成，每一種成分都對(duì)人體起著不可缺少的作用。外周血紅細(xì)胞和白細(xì)胞都源于骨髓中的干細(xì)胞，外周血里的血細(xì)胞壽命短，常常需要不斷補(bǔ)充。為了達(dá)到及時(shí)補(bǔ)充的目的，作為血細(xì)胞前體的干細(xì)胞必須快速分裂。因此骨髓細(xì)胞數(shù)和外周血中各種血細(xì)胞數(shù)量直接反應(yīng)骨髓的造血功能情況。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明骨肽提取液能預(yù)防和治療環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓損傷模型外周血和骨髓造血功能，對(duì)化療藥物引起的骨髓損傷具有明顯的保護(hù)作用。目前對(duì)豬骨進(jìn)行酶解提取，所得骨肽提取液具有抗高血壓、預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病、抗衰老和抗氧化等功能，但其在預(yù)防和治療放化療引起的骨髓損傷方面的新用途尚未挖掘。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出了一種骨肽提取液及其制備方法和在治療骨髓損傷的應(yīng)用，可有效治療和預(yù)防因化療藥物引起的骨髓損傷。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種骨肽提取液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將豬骨清洗后，在105℃-120℃的溫度下蒸煮至骨頭變酥；

(2)將變酥的骨頭粉碎后，加入水混合后，用膠磨機(jī)研磨至骨泥；

(3)在骨泥中加入酸液調(diào)節(jié)ph值至1-4，加入胃蛋白酶，在35-40℃溫度下攪拌12-72h酸化和酶解的骨泥混合物，備用；

(4)將骨泥混合物與水混合煎煮兩次，合并兩次煎煮液，離心去渣得到粗濾液；

(5)將粗濾液采用堿調(diào)節(jié)至ph值為6.5-7.5，保持溫度為37.5-45℃，加入胰酶酶解，酶解后的物質(zhì)通過(guò)孔徑為1.4微米鈦型陶瓷膜過(guò)濾得粗提取物；

(6)將粗提取物煮沸18-25min滅火，再濃縮得到骨肽提取液。

優(yōu)選的，所述豬骨、胃蛋白酶和胰酶的質(zhì)量比為500:1:1。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中加入的水與骨頭的質(zhì)量比為1:1。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中加入的酸液為鹽酸、檸檬酸和乳酸中的任意一種或幾種。

優(yōu)選的，所述步驟(5)中胰酶酶解的時(shí)間為6h。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種通過(guò)上述制備方法得到的骨肽提取液。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種上述制備方法得到的骨肽提取液在預(yù)防和治療因化療藥物引起的骨髓損傷方面的應(yīng)用。

本發(fā)明骨肽提取液及其制備方法和在治療骨髓損傷的應(yīng)用，其有益效果在于：

(1)通過(guò)胃蛋白酶和胰酶分別在酸性和弱堿性環(huán)境下的對(duì)豬骨的混合提取，得到高含量的骨肽提取物，且制備方法簡(jiǎn)單。

(2)本發(fā)明得到的骨肽提取液不僅能夠防止胃粘膜潰瘍、抑制血壓上升、提高骨骼強(qiáng)度、促進(jìn)皮膚膠原代謝延緩衰老、促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收作用，還可抗高血壓、預(yù)防與治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病、抗衰老和抗氧化。最重要的還能在目前癌癥化療易出現(xiàn)的不良反應(yīng)骨髓抑制具有有效的預(yù)防和治療作用，可效預(yù)防和治療骨髓損傷外周血和骨髓造血功能，改善骨髓增生。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種骨肽提取液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將100g豬骨清洗后，在105℃的溫度下蒸煮2-6h至骨頭變酥；

(2)將變酥的骨頭粉碎至粒度小于1厘米后，加入按照固液比1：1加入水混合后，用膠磨機(jī)研磨至骨泥，要求手搓骨泥沒(méi)有砂粒感即可；

(3)在骨泥中加入鹽酸調(diào)節(jié)ph值至2，加入0.2g胃蛋白酶，在37℃溫度下攪拌48h酸化和酶解的骨泥混合物，備用；

(4)將骨泥混合物與水混合煎煮兩次，第煎煮1次1.5小時(shí)，加200g水；第二次煎煮1小時(shí)，加100g水；合并兩次煎煮液，離心去渣得到粗濾液；

(5)將粗濾液采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至ph值為7.5，保持溫度為37.5-45℃，加入0.2g胰酶酶解，酶解后的物質(zhì)通過(guò)孔徑為1.4微米鈦型陶瓷膜過(guò)濾得粗提取物；

(6)將粗提取物煮沸20min滅火，再濃縮得到骨肽提取液。

實(shí)施例2

一種骨肽提取液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將100g豬骨清洗后，在105℃的溫度下蒸煮2-6h至骨頭變酥；

(2)將變酥的骨頭粉碎至粒度小于1厘米后，加入按照固液比1：1加入水混合后，用膠磨機(jī)研磨至骨泥，要求手搓骨泥沒(méi)有砂粒感即可；

(3)在骨泥中加入鹽酸調(diào)節(jié)ph值至4，加入0.2g胃蛋白酶，在35℃溫度下攪拌72h酸化和酶解的骨泥混合物，備用；

(4)將骨泥混合物與水混合煎煮兩次，第煎煮1次1.5小時(shí)，加200g水；第二次煎煮1小時(shí)，加100g水；合并兩次煎煮液，離心去渣得到粗濾液；

(5)將粗濾液采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至ph值為6.5，保持溫度為37.5-45℃，加入0.2g胰酶酶解，酶解后的物質(zhì)通過(guò)孔徑為1.4微米鈦型陶瓷膜過(guò)濾得粗提取物；

(6)將粗提取物煮沸20min滅火，再濃縮得到骨肽提取液。

實(shí)施例3

一種骨肽提取液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將100g豬骨清洗后，在105℃的溫度下蒸煮2-6h至骨頭變酥；

(2)將變酥的骨頭粉碎至粒度小于1厘米后，加入按照固液比1：1加入水混合后，用膠磨機(jī)研磨至骨泥，要求手搓骨泥沒(méi)有砂粒感即可；

(3)在骨泥中加入鹽酸調(diào)節(jié)ph值至1，加入0.2g胃蛋白酶，在37℃溫度下攪拌12h酸化和酶解的骨泥混合物，備用；

(4)將骨泥混合物與水混合煎煮兩次，第煎煮1次1.5小時(shí)，加200g水；第二次煎煮1小時(shí)，加100g水；合并兩次煎煮液，離心去渣得到粗濾液；

(5)將粗濾液采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至ph值為7.5，保持溫度為37.5-45℃，加入0.2g胰酶酶解，酶解后的物質(zhì)通過(guò)孔徑為1.4微米鈦型陶瓷膜過(guò)濾得粗提取物；

(6)將粗提取物煮沸20min滅火，再濃縮得到骨肽提取液。

實(shí)施例4

骨肽提取液對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓損傷模型的影響(預(yù)防給藥)

1.1.1造模與分組

balb/c小鼠60只，雌雄各半，體重18～22g，按性別體重隨機(jī)分為6組，每組10只動(dòng)物，即：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿膠補(bǔ)血顆粒組(1.04g/kg)、骨肽提取液低(2.73ml/kg)、中(5.46ml/kg)、高劑量組(10.92ml/kg)。各給藥組小鼠按20ml/kg灌胃給予相應(yīng)劑量藥液，1次/日，連續(xù)30天，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等體積蒸餾水。于第26天給藥后1h，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠腹腔注射80mg/kg環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射5天。末次給予環(huán)磷酰胺24h后稱(chēng)重并眼眶取血檢測(cè)血常規(guī)，取股骨骨髓，制備骨髓涂片。

1.1.2檢測(cè)指標(biāo)

1.1.2.1外周血檢測(cè)：采用血球分析儀測(cè)定血常規(guī)，包括白細(xì)胞(wbc)計(jì)數(shù)、血小板(plt)計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞(rbc)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(hgb)。

1.1.2.2骨髓檢查：取左側(cè)股骨用鑷子將骨髓擠出，與少量小牛血清混勻，制備骨髓涂片，瑞氏染液染色。骨髓象檢測(cè)是用細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的方法來(lái)觀察骨髓中細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量的變化，借以了解造血功能?？梢栽陲@微鏡下觀察有核細(xì)胞均數(shù)來(lái)判斷骨髓增生程度，骨髓增生程度分為5級(jí)，分級(jí)與記分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1骨髓增生程度分級(jí)與記分標(biāo)準(zhǔn)

1.2骨肽提取液對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓損傷模型的影響(治療給藥)

1.2.1造模與分組

balb/c小鼠72只，雌雄各半，體重18～22g，動(dòng)物按性別體重隨機(jī)分為6組，每組12只動(dòng)物，即：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿膠補(bǔ)血顆粒組(1.04g/kg)、骨肽提取液低(2.73ml/kg)、中(5.46ml/kg)、高劑量組(10.92ml/kg)。除正常對(duì)照組12只外，其余小鼠腹腔注射80mg/kg環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射5天，注射環(huán)磷酰胺結(jié)束后，各組小鼠按20ml/kg灌胃給予相應(yīng)劑量藥液，1次/日，連續(xù)14天，每7d稱(chēng)重一次，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等體積蒸餾水。給藥后第14天每組動(dòng)物眼眶取血檢測(cè)血常規(guī)，取股骨骨髓，制備骨髓涂片。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1外周血檢測(cè)：在給藥第14天采用血球分析儀測(cè)定血常規(guī)，包括白細(xì)胞(wbc)、計(jì)數(shù)、血小板(plt)計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞(rbc)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(hgb)。

1.2.2.2骨髓檢查：在給藥第14天取左側(cè)股骨用鑷子將骨髓擠出，與少量小牛血清混勻，制備骨髓涂片，瑞氏染液染色，在高倍顯微鏡鏡下觀察有核細(xì)胞數(shù)來(lái)判斷骨髓損傷情況。

1.3劑量設(shè)計(jì)

骨肽提取液的臨床擬用量為21ml/日，根據(jù)體表面積法換算成小鼠等效劑量為21ml*0.0026/0.02kg＝2.73ml/kg。本實(shí)驗(yàn)以小鼠等效劑量作為低劑量，中、高劑量分別為等效劑量的2、4倍，即小鼠中、高劑量分別為5.46ml/kg、10.92ml/kg。阿膠補(bǔ)血顆粒臨床用量為8g/日，根據(jù)體表面積法換算成小鼠等效劑量為8*0.0026/0.02＝1.04g/kg，詳見(jiàn)表2。

表2試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)

以上采用spss16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平設(shè)定為p<0.05。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。用leven’stest方法檢驗(yàn)正態(tài)性和方差齊性。如果符合正態(tài)性和方差齊性，用單因素方差分析(one-wayanova)和posthoclsd進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；如果不符合正態(tài)性和方差不齊，則用kruskal-wallis檢驗(yàn)。如果kruskal-wallis檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，則用dunnett’stest(非參數(shù)方法)進(jìn)行比較分析。評(píng)價(jià)時(shí)考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和生物學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷模型體重的影響

如下表3所示，給藥30天，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠體重明顯降低(p<0.05)；與模型對(duì)照組比較，骨肽提取液低、中、高劑量組小鼠體重變化無(wú)顯著性差異。

表3骨肽提取液對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓損傷模型體重的影響(預(yù)防給藥)(n＝6)

骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷血液學(xué)指標(biāo)的影響

如下表4所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠外周血wbc、rbc、hgb、plt明顯降低(p<0.05)。與模型對(duì)照組比較，骨肽提取液低劑量能明顯升高h(yuǎn)gb數(shù)量(p<0.05)，骨肽提取液中劑量能明顯升高rbc、hgb數(shù)量(p<0.05)；骨肽提取液高劑量能明顯升高wbc、rbc、hgb數(shù)量(p<0.05)；阿膠補(bǔ)血顆粒能明顯能明顯升高h(yuǎn)gb數(shù)量(p<0.05)。

表4骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷模型血液學(xué)指標(biāo)的影響(n＝6)

骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷模型骨髓增生評(píng)分的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯減少，骨肽提取液高劑量能夠明顯對(duì)抗環(huán)磷酰胺腹腔注射導(dǎo)致小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)的減少。如下表5所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠骨髓增生評(píng)分明顯降低(p<0.05)，骨肽提取液高劑量能夠明顯的對(duì)抗環(huán)磷酰胺腹腔注射導(dǎo)致小鼠骨髓抑制效果，

表5骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷骨髓增生評(píng)分的影響(n＝6)

骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷的影響(治療給藥)

a、強(qiáng)骨生血顆粒對(duì)小鼠骨髓損傷模型體重的影響

如下表6所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠體重明顯降低(p<0.01)；給藥后14天，與模型對(duì)照組比較，骨肽提取液高劑量組小鼠體重明顯升高(p<0.05)。

表6骨肽提取液對(duì)環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓損傷模型體重的影響(治療給藥)(n＝9)

b、骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷血液學(xué)指標(biāo)的影響

如下表7所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠外周血白細(xì)胞wbc、rbc、plt明顯降低(p<0.05)。與模型對(duì)照組比較，骨肽提取液高劑量外周血wbc、rbc、plt數(shù)量明顯升高(p<0.05)。阿膠補(bǔ)血顆粒外周血rbc、plt數(shù)量明顯升高(p<0.05)。

表7骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷血液學(xué)指標(biāo)的影響(n＝9)

c、骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷骨髓增生評(píng)分的影響

模型對(duì)照組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯減少，骨肽提取液高劑量能夠明顯的對(duì)抗環(huán)磷酰胺腹腔注射導(dǎo)致小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)的減少。如下表8所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠骨髓增生評(píng)分明顯降低(p<0.05)。與模型對(duì)照組比較，骨肽提取液高劑量能夠明顯的對(duì)抗環(huán)磷酰胺腹腔注射導(dǎo)致小鼠骨髓損傷，骨髓增生程度與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

表8骨肽提取液對(duì)小鼠骨髓損傷骨髓增生評(píng)分的影響(n＝9)

從以上實(shí)施例可以可按出，骨肽提取液低劑量能明顯升高骨髓損傷模型小鼠外周血hgb數(shù)量，骨液中、高劑量能明顯升高rbc、hgb數(shù)量；骨肽提取液高劑量能明顯升高wbc數(shù)量。骨肽提取液高劑量能明顯改善模型小鼠骨髓增生評(píng)分；

骨肽提取液高劑量能明顯升高給藥后14天小鼠體重。骨肽提取液高劑量能明顯升高外周血wbc、rbc、plt數(shù)量。骨肽提取液高劑量能明顯增加模型小鼠骨髓增生評(píng)分。

骨肽提取液能預(yù)防和治療環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓損傷模型外周血和骨髓造血功能，對(duì)化療藥物引起的骨髓損傷具有明顯的保護(hù)作用。

以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例所提供的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的原理以及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只適用于幫助理解本發(fā)明實(shí)施例的原理；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，在具體實(shí)施方式以及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書(shū)內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。