本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種纖連蛋白和功能細(xì)胞復(fù)合型微囊化移植體的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的變化，越來越多的疾病影響著人類健康，其中心血管疾病、糖尿病的人群基數(shù)大、高發(fā)病率、高死亡率已經(jīng)成為危害人類健康的全球性重大疾病。
心血管疾?。╟vd）一直是全球發(fā)病率、死亡率居先的疾病。近期，世界衛(wèi)生組織（who）最新數(shù)據(jù)顯示，心血管疾病已成為全球疾病死亡首因，2004年有1710萬人死于cvd，占全球死亡的29％，其中約720萬死于冠心病，570萬死于腦卒中。預(yù)計(jì)至2030年，全球約2360萬人將死于cvd，主要死因?yàn)樾呐K病和腦卒中。糖尿病同樣是危害人類健康的全球性疾病之一，發(fā)病率高達(dá)3-5%，由其引發(fā)的死亡率僅次于心血管疾病和腫瘤。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，至2030年，糖尿病將成為第七大致死病因。隨著糖尿病在各人口大國的患病率和死亡率逐漸上升，糖尿病的患病人數(shù)和死亡人數(shù)均呈全球增加趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織全球糖尿病報(bào)告顯示：全球18歲以上人群中，1980年糖尿病患者為1.08億人，2014年增加至4.22億人，占全球總?cè)丝诘?.5%。2012年糖尿病直接導(dǎo)致150萬人死亡。糖尿病嚴(yán)重影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)，全球用于應(yīng)對(duì)糖尿病的年成本超過8270億美元；至2030年，預(yù)計(jì)全球經(jīng)濟(jì)將因糖尿病損失高達(dá)1.7萬億美元。
我國是人口大國，每年因心血管疾病死亡人數(shù)達(dá)300萬。根據(jù)權(quán)威機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，到2030年，我國35-84歲的人群，心血管疾病的發(fā)病將增加50%，今后10年心血管病患病人數(shù)仍將快速增長。據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，中國目前糖尿病患者人數(shù)高達(dá)1.14億，全世界每3-4個(gè)糖尿病患者就有一位來自中國。2011年我國疾病控制中心統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：我國糖尿病發(fā)病率高達(dá)4%，其中ⅰ型糖尿病為5%-10%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2006-2015年，中國因心血管疾病和糖尿病導(dǎo)致的gdp損失達(dá)5580億美元。
隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以細(xì)胞移植為技術(shù)手段來治療心血管疾病和糖尿病等重大疾病已成為國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外眾多臨床應(yīng)用研究證實(shí)，用具有特定功能的心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于受損的心肌治療心血管疾?。挥靡葝u細(xì)胞和胰島干細(xì)胞移植治療糖尿病具有顯著的治療效果，細(xì)胞移植是治療心血管疾病和糖尿病的根本方法之一，隨著再生醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，細(xì)胞移植必將成為治療包括心血管疾病、糖尿病等眾多人類重大疾病的新型臨床治療手段之一。但是，當(dāng)前利用細(xì)胞移植進(jìn)行心血管疾病和糖尿病治療面臨著三大技術(shù)難題：一、高質(zhì)量的活性功能細(xì)胞的短缺；二、異體或異種免疫排斥反應(yīng)；三、移植功能細(xì)胞在受者體內(nèi)存活周期短，遠(yuǎn)期治療效果差。因此，攻克細(xì)胞移植領(lǐng)域的三大技術(shù)難題，研究開發(fā)出可以供臨床大量推廣的細(xì)胞移植技術(shù)和產(chǎn)品是未來利用細(xì)胞移植手段治療各種重大疾病研究的必然趨勢(shì)。
本發(fā)明將利用海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉（apa）微囊化免疫隔離技術(shù)將纖連蛋白（fn）和功能細(xì)胞共同包裹形成復(fù)合型微囊化移植體，既可以通過微囊化免疫隔離技術(shù)避免功能細(xì)胞移植過程中的異體或異種免疫排斥反應(yīng)，又可以充分發(fā)揮fn對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長、分化等細(xì)胞再生修復(fù)的生物學(xué)特性，利用fn無血清技術(shù)規(guī)?；苽涓哔|(zhì)量的活性功能細(xì)胞，并且可以利用復(fù)合型微囊化移植體中的fn保持移植后功能細(xì)胞在受者體內(nèi)高數(shù)量和高活性，提高細(xì)胞移植對(duì)心血管疾病或糖尿病等疾病的遠(yuǎn)期治療效果。目前在國內(nèi)外未見同類技術(shù)或產(chǎn)品的報(bào)道與上市。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況、通過建立一種纖連蛋白和功能細(xì)胞復(fù)合型微囊化移植體的制備方法，來解決當(dāng)前細(xì)胞移植治療心血管疾病和糖尿病等重大疾病臨床應(yīng)用中所面臨的高質(zhì)量的活性功能細(xì)胞的短缺，異體或異種免疫排斥反應(yīng)，移植后功能細(xì)胞在受者體內(nèi)存活周期短、遠(yuǎn)期治療效果差等三大技術(shù)難題，為細(xì)胞移植治療各種重大疾病提供一種新的技術(shù)手段和方法。
基于上述目的，本發(fā)明的制備方法包括以下工藝步驟：
（1）功能細(xì)胞供體的選擇：從人或spf哺乳動(dòng)物獲得功能細(xì)胞供體，即根據(jù)疾病的治療需求選擇成人或spf（無特定病原體級(jí)）哺乳動(dòng)物做為功能細(xì)胞供體；
（2）功能細(xì)胞的分離純化：在無菌條件下，獲得（通過解剖得出）供體內(nèi)功能細(xì)胞所在的目標(biāo)組織，針對(duì)不同功能細(xì)胞的特性利用機(jī)械分離法、膠原酶消化法、不連續(xù)密度梯度離心法等方法，從目標(biāo)組織中分離純化出具有特定功能的組織功能細(xì)胞；
（3）功能細(xì)胞的規(guī)?；瘮U(kuò)增：利用fn無血清培養(yǎng)基(每1000mlrpmi1640或dmem/f12培養(yǎng)液，加入纖連蛋白（fn）50-80mg,青霉素100ku和鏈霉素100ku），將純化后功能細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用fn對(duì)細(xì)胞增殖、生長、分化等細(xì)胞再生修復(fù)的生物學(xué)性，在5-7天內(nèi)擴(kuò)增出大量純度≧95%，存活率≧93%的活性功能細(xì)胞；
（4）纖連蛋白和功能細(xì)胞復(fù)合微囊化：利用微囊化免疫隔離技術(shù)將1∶40-50（重量比）的纖連蛋白和功能細(xì)胞共同包埋于apa微囊內(nèi)，形成纖連蛋白和功能細(xì)胞復(fù)合型微囊化移植體。
本發(fā)明中功能細(xì)胞包括人或哺乳動(dòng)物體骨髓、心臟、胰腺或其它組織來源的平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胰島細(xì)胞、胰島干細(xì)胞等，其中心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞主要用于心血管疾病的細(xì)胞移植，胰島細(xì)胞主要用于糖尿病的細(xì)胞移植。
本發(fā)明所述功能細(xì)胞的分離純化及鑒定方法具體步驟如下：
1、胰島細(xì)胞的分離純化及鑒定
（1）胰島分離：潔凈條件下，從spf哺乳動(dòng)物幼崽體內(nèi)解剖出胰腺，將胰腺置于超凈工作臺(tái)上，快速去除胰周脂肪、血管及胰腺被摸，保留固有被摸，用uw液沖洗后天平稱重。從胰頭、胰尾交接部橫斷胰腺，找到主胰管，插入塑料管，并灌注體積約為胰腺重量的2倍的由hanks液配置的膠原酶溶液（1.5g/l，含dna酶0.3g/l），37℃水浴消化30min，消化過程中ph7.5左右，從消化20min開始每間隔4min取樣一次，雙硫腙染色鏡檢，當(dāng)胰腺組織被消化裂解成細(xì)沙狀，鏡檢見大部分結(jié)構(gòu)完成的胰島從外分泌組織中脫落出來，立即用4℃冷hanks液終止消化，充分混勻后，用40目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集消化后的組織，4℃離心，hanks液洗滌2次，去除脂肪等雜質(zhì)細(xì)胞，取樣鏡檢計(jì)數(shù)盒觀察消化后胰島分離情況。
（2）胰島純化：用euro-ficoll液及ficoll分離液配成密度為1.37、1.054、1.070、1.096、1.11kg/l的不連續(xù)密度梯度液，依次將不連續(xù)密度梯度液各10ml加入50ml離心管中，最后將消化洗滌后的消化組織每0.5ml與1.037kg/l密度梯度液10ml混勻，小心移至離心管中液體上層，形成不連續(xù)密度梯度。將2-4個(gè)離心管置于低溫離心機(jī)，先700-800r/min離心5min，然后2300-2800r/min離心15min，離心后在1.096-1.054kg/l之間收集純化的胰島，4℃離心洗滌2次。分別取樣鏡檢，觀察胰島形態(tài)、數(shù)量、純度和活性。
（3）胰島計(jì)數(shù)：取純化后胰島細(xì)胞懸浮液用雙硫腙（dtz）染色后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑50μm以上的胰島，計(jì)數(shù)100-450μm各數(shù)量級(jí)的胰島細(xì)胞數(shù)，以直徑為150μm為基準(zhǔn)系數(shù)1，計(jì)數(shù)胰島當(dāng)量（ieq），重復(fù)取樣3次，并求出平均值。
（4）胰島純度測(cè)定：純化后的胰島計(jì)數(shù)時(shí)，用倒置顯微鏡下總面積中的胰島面積所占的比例測(cè)算純度。
（5）胰島細(xì)胞活性鑒定：取0.1ml胰島細(xì)胞懸液，采用吖啶橙（ao）與碘丙啶（pi）熒光染色，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)紅綠染色的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的活性。
2、心肌細(xì)胞的分離純化及鑒定方法：
（1）心肌細(xì)胞的分離純化：潔凈條件下，從spf動(dòng)物體內(nèi)，解剖出心肌組織置于無菌平皿中，加入適量預(yù)冷pbs，洗去血凝塊和血細(xì)胞，剔除血管、脂肪、結(jié)締組織，再用預(yù)冷pbs漂洗2-3次，轉(zhuǎn)移裝有預(yù)冷pbs的閃爍瓶中，將心肌組織剪成1mm2大小的均勻碎塊。加入0.12%的ⅰ型膠原酶，向閃爍瓶中加入磁子，37℃水浴，200-300r/min消化10min。將第一次消化完畢后的上清液棄掉，加入新的消化酶繼續(xù)消化10min，反復(fù)消化至組織變白后不再減小。收集各次消化后的上清液加入等體積的培養(yǎng)液以終止消化，以2200-2600r/min離心6-8min，棄上清液，收集所有細(xì)胞加入培養(yǎng)液中吹打成單細(xì)胞懸液。接種于培養(yǎng)瓶中37℃、5%co2培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5-2.5h分離非心肌細(xì)胞，所得未貼壁細(xì)胞即心肌細(xì)胞，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)心肌細(xì)胞的數(shù)量、成活率及純度。
（2）心肌細(xì)胞的形態(tài)觀察：用倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)。
（3）心肌細(xì)胞存活率檢測(cè)：將心肌細(xì)胞懸液于0.4%的臺(tái)酚藍(lán)9:1的比例稀釋，混勻后置于導(dǎo)致顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)（為染成藍(lán)色的細(xì)胞）/細(xì)胞總數(shù)×100%。
（4）心肌細(xì)胞純度鑒定：取出心肌細(xì)胞，4%的多聚甲醛固定20min，用pbs漂洗2次。0.1%tritonx-100處理20min，5%bsa室溫封閉30min，滴加a-sa多克隆抗體（1:100），4℃過夜，加入igg二抗37℃避光孵育90min。dapi染色，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)。陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%
3、平滑肌細(xì)胞的分離純化及鑒定
（1）平滑肌細(xì)胞的分離：潔凈條件下，從spf動(dòng)物體內(nèi)，解剖出平滑肌組織，洗去血凝塊和血細(xì)胞，剔除血管、脂肪、結(jié)締組織，如為主動(dòng)脈，則剝?nèi)パ軆?nèi)膜及外膜，取血管的內(nèi)、中層，切成1mm2大小的組織塊，置于盛有完全dmem/f12培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入0.1%的ⅰ型膠原酶反復(fù)消4-5次，至組織變白后不再減小。鏡檢，觀察平滑肌細(xì)胞的形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量、成活率及純度。
（2）平滑肌細(xì)胞形態(tài)觀察：用倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)。
（3）平滑肌細(xì)胞存活率檢測(cè)：將平滑肌細(xì)胞懸液于0.4%的臺(tái)酚藍(lán)9:1的比例稀釋，混勻后置于導(dǎo)致顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)（為染成藍(lán)色的細(xì)胞）/細(xì)胞總數(shù)×100%。
（4）平滑肌細(xì)胞純度鑒定：取出平滑肌細(xì)胞細(xì)胞懸液，接種于鋪有明膠的置于培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上，培養(yǎng)至細(xì)胞成致密單層，取出玻片4℃用pbs漂洗3次，中性福爾馬林定20m；滴加α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單抗體玻片上，37℃避光孵育30min；pbs洗滌3次，滴加hrp（辣根過氧化物酶），標(biāo)記的特定抗體igg工作液，37℃孵育30min；pbs溶液洗3次，他脫水，透明，封片，鏡檢，隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)。陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下創(chuàng)新優(yōu)勢(shì)：
1、本發(fā)明特選spf或dpf（無特定病原體級(jí)）哺乳動(dòng)物做為功能細(xì)胞供體，保證了沒有任何異種源性病原體進(jìn)入人體，杜絕了人與動(dòng)物異種感染的風(fēng)險(xiǎn)。
2、本發(fā)明采用獨(dú)特的fn無血清培養(yǎng)技術(shù)，利用fn對(duì)細(xì)胞增殖、生長、分化的細(xì)胞再生生物學(xué)特性，在rpmi1640或dmem等常規(guī)無血清培養(yǎng)基中加入fn對(duì)功能細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可以在較短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出大量的高質(zhì)量活性功能細(xì)胞，從根本上解決細(xì)胞移植臨床應(yīng)用中所面臨的高質(zhì)量活性細(xì)胞的短缺問題。fn是一種高分子糖蛋白，廣泛存在于動(dòng)物組織和組織液中。fn可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附、鋪展、增殖、遷移、分化，具有多種生物學(xué)活性，是一種促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞和組織再生的高活性生物蛋白。大量研究表明fn作為細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)可以提高包括胰島細(xì)胞、胰島干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的貼壁率、匯合率、縮短細(xì)胞匯合時(shí)間，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)良好，代謝率增強(qiáng)，dna、rna及蛋白合成速度顯著提高；細(xì)胞的集落率升高，原代培養(yǎng)成活率提高。本發(fā)明通過fn無血清培養(yǎng)技術(shù)對(duì)分離純化后的各類功能細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在常規(guī)rpmi1640或dmem/f12等培養(yǎng)基中加入fn，不僅可以促進(jìn)功能細(xì)胞的大量增殖和貼壁黏連生長，保持功能細(xì)胞的高活性，同時(shí)避免了體外培養(yǎng)過程中，傳統(tǒng)小牛血清或胎牛血清成分對(duì)各類功能細(xì)胞可能造成的不良培養(yǎng)影響，從而大量培養(yǎng)出高質(zhì)量高活性的功能細(xì)胞，從根本上解決細(xì)胞移植臨床應(yīng)用中面臨的高質(zhì)量的活性功能細(xì)胞短缺的問題。
3、本發(fā)明采用微囊化免疫隔離技術(shù)將功能細(xì)胞和纖連蛋白包裹在apa微囊內(nèi)進(jìn)行免疫隔離，可避免細(xì)胞移植過程異體或異種免疫排斥反應(yīng)，增加移植功能細(xì)胞的成活率。
4、本發(fā)明通過纖連蛋白和功能細(xì)胞聯(lián)合移植，充分發(fā)揮微囊內(nèi)fn對(duì)細(xì)胞增殖、生長、分化的細(xì)胞再生修復(fù)作用，可以長期保持受者體內(nèi)功能細(xì)胞活性，為移植后功能細(xì)胞在人體中長期存活提供保障，遠(yuǎn)期治療效果遠(yuǎn)大于單獨(dú)的微囊化細(xì)胞移植，徹底解決了當(dāng)前細(xì)胞移植臨床應(yīng)用中遠(yuǎn)期療效差的問題。
5、本發(fā)明技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，將為利用細(xì)胞移植根治心血管疾病和糖尿病提供新的臨床技術(shù)手段和治療方法，在心血管疾病和糖尿病的治療領(lǐng)域有著極大科研價(jià)值和廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值，具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合用于治療心血管疾病的“纖連蛋白和牛心肌細(xì)胞復(fù)合型微囊化移植體”和用于治療ⅰ型糖尿病的“纖連蛋白和豬胰島細(xì)胞復(fù)合型微囊化移植體”的具體制備步驟對(duì)工藝進(jìn)一步說明：
實(shí)施例1“纖連蛋白和牛心肌細(xì)胞復(fù)合型微囊化移植體”的制備方法：
1、牛心肌細(xì)胞供體的選擇：選擇spf新生牛作為心肌細(xì)胞供體。
2、牛心肌細(xì)胞的分離純化及鑒定：從spf新生牛內(nèi)解剖出心肌組織置于無菌平皿中，加入適量預(yù)冷pbs，洗去血凝塊和血細(xì)胞，剔除血管、脂肪、結(jié)締組織，再用預(yù)冷pbs漂洗2-3次，轉(zhuǎn)移裝有預(yù)冷pbs的閃爍瓶中，將心肌組織剪成1mm2大小的均勻碎塊。加入0.12%的ⅰ型膠原酶，向閃爍瓶中加入磁子，37℃水浴250r/min消化10min。將第一次消化完畢后的上清液棄掉，加入新的消化酶繼續(xù)消化10min，反復(fù)消化4-5次至組織變白后不再減小。收集各次消化后的上清液加入等體積的培養(yǎng)液以終止消化，以2400r/min離心6min，棄上清液，收集所有細(xì)胞加入培養(yǎng)液中吹打成單細(xì)胞懸液。接種于培養(yǎng)瓶中37℃、5%co2培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5小時(shí)分離非心肌細(xì)胞，所得未貼壁細(xì)胞即牛心肌細(xì)胞，鏡檢，觀察牛心肌細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)牛心肌細(xì)胞的數(shù)量、成活率及純度。
3、牛純化心肌細(xì)胞的規(guī)模化擴(kuò)增：在每1000mldmem/f12培養(yǎng)液，加入纖連蛋白（fn）80mg、青霉素100ku和鏈霉素100ku，37℃、5%co2培養(yǎng)箱進(jìn)行體外培養(yǎng)5天，擴(kuò)增出大量高質(zhì)量的牛心肌細(xì)胞，鏡檢觀擴(kuò)增察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、存活率及純度。
4、纖連蛋白和牛心肌細(xì)胞復(fù)合微囊化：將fn和分離純化的牛心肌細(xì)胞（純度≧95%，存活率≧93%）按1:49（重量比）比例混勻，共懸于2%海藻酸鈉制成混合液，然后將混合液加入微囊發(fā)生器，通過調(diào)節(jié)垂直方向和水平方向的氣流大小，使微囊直徑控制在350-800μm，吹出的微囊直接進(jìn)入氯化鈣溶液中凝膠，形成含有細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠。將膠珠懸于30μm多聚賴氨酸溶液中作用20min，形成的微膠囊再懸浮于2%海藻酸鈉中，中和其表面正電荷。用dmem/f12液洗滌2次，最后生理鹽水清洗制成纖連蛋白和牛心肌細(xì)胞復(fù)合型apa微膠囊，用于進(jìn)行異種移植治療心血管疾病。
實(shí)施例2“纖連蛋白和豬胰島細(xì)胞細(xì)胞復(fù)合型微囊化移植體”的制備方法：
1、豬胰島分離：潔凈條件下從spf豬體內(nèi)解剖出胰腺，將胰腺置于超凈工作臺(tái)上，快速去除胰周脂肪、血管及胰腺被膜，保留固有被膜，用uw液沖洗后天平稱重。從胰頭、胰尾交接部橫斷胰腺，找到主胰管，插入塑料管，并灌注體積約為胰腺重量2倍的由hanks液配置的膠原酶溶液（1.5g/l，含dna酶0.3g/l）。37℃水浴消化30min，消化過程中ph7.5左右，從消化20min開始每間隔4min取樣一次，雙硫腙染色鏡檢，當(dāng)胰腺組織被消化裂解成細(xì)沙狀，鏡檢見大部分結(jié)構(gòu)完成的胰島從外分泌組織中脫落出來，立即用4℃冷hanks液終止消化，充分混勻后，用40目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集消化后的組織，4℃離心洗滌2次，去除脂肪等雜質(zhì)細(xì)胞，取樣鏡檢計(jì)數(shù)盒觀察消化后的胰島分離情況。
2、豬胰島純化：用euro-ficoll液及ficoll分離液配成密度為1.37、1.054、1.070、1.096、1.11kg/l的不連續(xù)密度梯度液，依次將不連續(xù)密度梯度液各10ml加入50ml離心管中，最后將消化洗滌后的消化組織每0.5ml與1.037kg/l密度梯度液10ml混勻，小心移至離心管中液體上層，形成不連續(xù)密度梯度。將2-4個(gè)離心管置于低溫離心機(jī)，先800r/min離心5min，然后2500r/min離心15min，離心后在1/096-1.054kg/l之間收集純化的胰島，4℃離心洗滌2次。分別取樣鏡檢，觀察胰島形態(tài)、數(shù)量、成活率及純度。
3、豬胰島細(xì)胞的規(guī)?；瘮U(kuò)增：在每1000mlrpmi1640培養(yǎng)液，加入纖連蛋白（fn）50mg、青霉素100ku和鏈霉素100ku，37℃、5%co2培養(yǎng)箱進(jìn)行體外培養(yǎng)6天，擴(kuò)增出大量高質(zhì)量的活性豬胰島細(xì)胞，鏡檢觀擴(kuò)增察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、存活率及純度。
4、纖連蛋白和豬胰島細(xì)胞復(fù)合微囊化：將fn和分離純化的豬胰島細(xì)胞（純度≧95%，存活率≧93%）按1:49（重量比）比例混勻，共懸于2%海藻酸鈉制成混合液，然后將混合液加入微囊發(fā)生器，通過調(diào)節(jié)垂直方向和水平方向的氣流大小，使微囊直徑控制在400-800μm，吹出的微囊直接進(jìn)入氯化鈣溶液中凝膠，形成含有細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠。將膠珠懸于30μm多聚賴氨酸溶液中作用15min，形成的微膠囊再懸浮于2%海藻酸鈉中，中和其表面正電荷。用rpmi-1640液洗滌2次，最后生理鹽水清洗制成纖連蛋白和豬胰島細(xì)胞復(fù)合型apa微膠囊，用于異種移植治療ⅰ型糖尿病。