本發(fā)明涉及葉綠素提取物的用途，具體來說涉及葉綠素提取物用于預防和/或治療鐵過載的用途，屬于醫(yī)藥領域。
背景技術：
：鐵過載，又稱鐵負荷過多，是指機體鐵供給超過鐵需求。鐵過載形成的原因有很多，例如，機體因為口服鐵劑、注射鐵劑、輸血等導致鐵攝入過多；又如，基因突變、飲酒、病毒感染等導致肝臟調(diào)節(jié)鐵平衡紊亂；再如，遺傳性或獲得性鐵代謝異常等；另外，某些疾病亦能影響鐵在微環(huán)境中的代謝從而導致鐵選擇性地沉積在特定細胞，如病毒性肝炎導致鐵沉積在肝細胞中從而導致鐵過載等等。鐵過載會導致鐵在某些組織器官貯存增加，例如心臟、肝臟、胰腺、腦等，從而影響心、肝、胰腺、腦等臟器的功能和結構，而且鐵過載與血液系統(tǒng)造血紊亂密切相關，對機體造成十分嚴重的危害。目前一般通過祛鐵治療，延緩鐵過載的發(fā)生，減輕鐵過載的危害，并改善預后。一種有效的祛鐵治療方法是放血治療，但其明顯不適合于貧血患者，尤其是輸血依賴性鐵過載患者。另一種祛鐵治療方法是鐵螯合劑，鐵螯合劑是目前治療鐵過載的唯一有效藥物，通過與體內(nèi)鐵離子定向結合有效地提高鐵的排泄，降低體內(nèi)鐵的含量及其在各器官的病理性沉積。目前臨床上應用的鐵螯合劑主要有三種：去鐵胺(DFO)、去鐵酮(DFP)和地拉羅司(DFX)。其中，去鐵胺是一種三價鐵離子螯合劑，能與三價鐵離子結合成鐵胺復合物，其藥物代謝半衰期為20-30min，代謝后主要通過尿液排出。去鐵酮是一種二齒狀突起的口服鐵螯合劑，口服給藥后于上消化道快速吸收，藥物代謝半衰期為2-3h，空腹服藥24h可達血藥峰濃度，經(jīng)葡萄糖醛酸化代謝失活，最終主要經(jīng)尿液排出。地拉羅司為一種新型的三價鐵螯合劑，口服吸收率高，藥物代謝半衰期為8-16h，代謝后主要經(jīng)糞便排出，僅用于治療年齡大于6歲的β-地中海貧血患者因頻繁輸血所致慢性鐵過載，對于6歲以下兒童及其他輸血依賴性疾病所致的鐵過載以及中國患者的安全有效性數(shù)據(jù)有限。鐵螯合劑治療雖然取得了一定的療效，但其不足之處在于：⑴不良反應明顯且較多，包括眼耳毒性、生長遲緩、骨骼改變、粒細胞和白細胞減少、胃腸功能紊亂、消化道出血、肝臟和腎臟功能衰竭等；⑵水溶性，從而不能進入細胞大量轉移與轉鐵蛋白結合的鐵；⑶去鐵胺半衰期短(20-30min)，需要長時間皮下或靜脈注射使用，依從性差；⑷治療費用昂貴，例如奧貝安可牌去鐵酮片的價格為680元/瓶(30片)，成人每天需服用3次，每次3片，日服用藥物價格為204元；⑸使用人群受限，老人、孕婦、哺乳期婦女和6歲以下兒童忌用或慎用。技術實現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)葉綠素提取物，特別是蠶砂提取物，能夠預防和/或治療鐵過載，在降低體內(nèi)鐵含量的同時，還能夠改善和修復鐵過載所致肝、腎損傷，并且沒有明顯的副作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，葉綠素提取物，特別是蠶砂提取物，對人體內(nèi)的鐵有雙向調(diào)節(jié)作用，既可改善缺鐵性貧血，也能降低體內(nèi)鐵含量，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了葉綠素提取物在制備用于預防和/或治療鐵過載的藥物中的用途。優(yōu)選，所述葉綠素提取物為蠶砂提取物。根據(jù)本發(fā)明，葉綠素提取物能夠預防和/或治療各種原因引起的鐵過載。在一個方面，所述鐵過載由鐵攝入過多、鐵平衡紊亂、和/或鐵代謝異常導致。所述鐵攝入過多由口服鐵劑、注射鐵劑、和/或輸血導致。所述鐵平衡紊亂由基因突變、飲酒、和/或病毒感染導致；優(yōu)選，所述病毒感染選自乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染和/或幽門螺桿菌感染。所述鐵代謝異常為遺傳性鐵代謝異常和/或獲得性鐵代謝異常；優(yōu)選，所述遺傳性鐵代謝異常選自遺傳性血色病、遺傳性血色素沉著病、遺傳性高鐵血紅蛋白血癥、和/或地中海貧血；優(yōu)選，所述獲得性鐵代謝異常由環(huán)境因素、膳食因素和/或疾病導致，進一步優(yōu)選，所述疾病為動脈粥樣硬化。在另一個方面，所述鐵過載為疾病導致鐵在細胞內(nèi)沉積。優(yōu)選，所述疾病選自病毒性肝炎、動脈粥樣硬化、遺傳性血色病、遺傳性血色素沉著病、遺傳性高鐵血紅蛋白血癥和/或地中海貧血；進一步優(yōu)選，所述病毒性肝炎為乙型肝炎和/或丙型肝炎。根據(jù)本發(fā)明，葉綠素提取物可以商購獲得或者提取自含有葉綠素和/或其衍生物的各種生物材料，包括但不限于蠶砂、竹葉、杜仲、雛菊、大麥苗、菠菜、空心菜、芹菜、萵筍、甘藍、油菜、豆芽菜苗、西蘭花葉、三葉草、雪松、綠藻、青草、仙人掌、蘆薈、甘蔗葉、獼猴桃葉、桃葉、大葉黃楊、絞股藍葉、牡丹葉、紫丁香葉、喬木葉片(女貞)、海桐葉片、石楠、冬青葉片、寧箭荷花葉片、桑葉等，優(yōu)選蠶砂。葉綠素提取物(優(yōu)選蠶砂提取物)的主要成分為鐵葉綠酸鈉和葉綠素衍生物。根據(jù)本發(fā)明，葉綠素提取物(優(yōu)選蠶砂提取物)中鐵葉綠酸鈉不少于5％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)(C34H30O6N4Fe)計不少于15％；優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于10％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于30％；進一步優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于15％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于50％；進一步優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于22.5％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于60％；進一步優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于25％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于63％；進一步優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于28％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于65％；進一步優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于30％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于68％；進一步優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于35％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于63％；最優(yōu)選，鐵葉綠酸鈉不少于40.5％，葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于58％。其中，在本發(fā)明中葉綠素衍生物不包含鐵葉綠酸鈉，其包括但不限于葉綠酸鈉、鐵葉綠酸b、脫鎂葉綠素酸a、焦脫鎂葉綠酸a、二氫卟吩e6、二氫卟吩e4、二氫卟吩p6、二氫卟吩f、紫紅素-18、葉綠卟啉等。本領域技術人員可以理解，可以通過本領域已知的各種方法提取得到本發(fā)明的葉綠素提取物，優(yōu)選蠶砂提取物。例如，葉綠素提取物(優(yōu)選蠶砂提取物)的提取方法包括如下步驟：(1)提取葉綠素；優(yōu)選，進一步對提取得到的提取物進行精制；(2)皂化；優(yōu)選，進一步用有機溶劑洗滌皂化液；(3)鐵化；(4)堿化。在上述步驟(1)中，優(yōu)選取含有葉綠素和/或其衍生物的各種生物材料(優(yōu)選蠶砂)，用有機溶劑或有機溶劑與水的混合物提取，回收有機溶劑后得葉綠素；其中，有機溶劑優(yōu)選為丙酮、乙醇、石油醚、正己烷、汽油、甲苯或其中兩種或多種的混合物，汽油優(yōu)選為120號汽油，進一步優(yōu)選，有機溶劑為丙酮、乙醇或其混合物。進一步優(yōu)選，提取方法為回流、萃取、滲濾、微波或使用超微震動磨等。在優(yōu)選的實施方案中，通過用去離子水洗滌或者通過用大孔吸附樹脂吸附進行精制。精制用于去除非葉綠素類物質(zhì)。在上述步驟(2)中，優(yōu)選將葉綠素用有機溶劑溶解，加入堿溶液使其皂化；其中，有機溶劑優(yōu)選為汽油、丙酮或其混合物，汽油優(yōu)選為120號汽油；堿溶液優(yōu)選為NaOH水溶液或KOH水溶液，進一步優(yōu)選，堿溶液的濃度為25-35％。皂化是為了去除類胡蘿卜素。在上述步驟(3)中，優(yōu)選調(diào)節(jié)皂化液的pH值至2-4，析出沉淀，加入有機溶劑或有機溶劑與水的混合物使其溶解，再加入亞鐵鹽，加熱至溶液呈深綠色為止，回收有機溶劑后得鐵代產(chǎn)物；其中，有機溶劑優(yōu)選為丙酮、乙醇或其混合物；亞鐵鹽優(yōu)選為硫酸亞鐵、氯化亞鐵或其混合物；優(yōu)選加熱使溶液保持微沸。鐵化是為了獲得鐵葉綠酸。在上述步驟(4)中，優(yōu)選取鐵代產(chǎn)物用去離子水洗至無游離鐵離子，加入有機溶劑使其溶解，再加入NaOH水溶液至或NaOH乙醇溶液不再有沉淀產(chǎn)生為止，得葉綠素提取物(優(yōu)選蠶砂提取物)；其中，有機溶劑優(yōu)選為丙酮、乙醇或其混合物；NaOH水溶液或NaOH乙醇溶液的濃度為25-35％。堿化是為了獲得鐵葉綠酸鈉。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：①對祛鐵治療有顯著的療效；②對人體內(nèi)的鐵有雙向調(diào)節(jié)作用，既可改善缺鐵性貧血，也能降低體內(nèi)鐵含量，是一種鐵穩(wěn)態(tài)劑，可避免祛鐵治療過度；③能同時改善和修復鐵過載所致肝、腎組織損傷，改善預后；④可制作成口服制劑，患者的順應性強；⑤為天然中藥提取物，無明顯毒副作用，可較長時間服用；⑥適用人群廣泛，老人、孕婦、哺乳期婦女，青少年均可以服用，解決了該類患者無藥可用的窘境；⑦價格低廉，日用藥價格僅為臨床治療一線用藥的十分之一，大幅減輕了患者的經(jīng)濟負擔。附圖說明圖1為鐵過載小鼠肝臟病理切片，其中：A為正常對照組，B為陽性對照組，C為蠶砂提取物高劑量組，D為蠶砂提取物低劑量組；圖2為鐵過載小鼠腎臟病理切片，其中：A為正常對照組，B為陽性對照組，C為蠶砂提取物高劑量組，D為蠶砂提取物低劑量組；圖3為鐵過載小鼠腎臟HO-1蛋白表達。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應理解，在閱讀了本發(fā)明所記載的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。在下述實施例中，如無特別說明，蠶砂提取物商購自武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責任公司，其中含鐵葉綠酸鈉不少于22.5％，含葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于60.0％。蠶砂提取物片劑即瑞克牌生血寧片劑，0.25g/片，其中含50mg蠶砂提取物，其他為醫(yī)用常規(guī)輔料，每片含鐵葉綠酸鈉不少于11.00mg，含葉綠素衍生物以鐵葉綠酸(b)計不少于30.0mg，商購自武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責任公司。實施例1.蠶砂提取物的祛鐵作用取昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機分為正常對照組、陽性對照組、蠶砂提取物高劑量組和蠶砂提取物低劑量組，每組20只，雌雄各半。除正常組外，其他各組小鼠均按100mg/kg每周腹腔注射1次右旋糖酐鐵造模，連續(xù)注射10周，建立鐵過載小鼠模型。自造模之日起，各組均每天給予1次灌胃，其中：正常對照組給予1ml生理鹽水，陽性對照組給予1ml生理鹽水，蠶砂提取物高劑量組按80mg/kg給予蠶砂提取物水溶液1ml，蠶砂提取物低劑量組按40mg/kg給予蠶砂提取物水溶液1ml，治療結束后尾靜脈取血用動物血常規(guī)檢測儀檢測小鼠血清鐵(SI)和血清鐵蛋白(SF)水平，結果見下表1。表1.蠶砂提取物對鐵過載小鼠SI和SF水平的影響注：與陽性對照組相比，*p<0.05，**p<0.01。表1顯示，與正常對照組小鼠比較，鐵過載陽性對照組小鼠SI和SF水平明顯升高。蠶砂提取物低劑量組和高劑量組與陽性對照組相比，SI和SF水平具有顯著性差異(P＜0.01)，說明蠶砂提取物低劑量組和高劑量組均能顯著降低鐵過載小鼠SI和SF水平，并具有劑量相關性。實施例2.蠶砂提取物的臨床祛鐵作用為證明蠶砂提取物的治療效果，給鐵過載患者服用蠶砂提取物進行觀察。⑴一般資料選取因各類貧血需要長期輸血而導致鐵過載的患者30例，其中男19例，女11例，年齡18～69歲，其中重型再生障礙性貧血(SAA)16例，重型地中海貧血9例，骨質(zhì)增生異常綜合征(MDS)5例，治療前肝及腎功能均正常。當患者SF水平超過1000μg/L時開始給予蠶砂提取物進行祛鐵治療。⑵治療方法每次口服蠶砂提取物片劑4片，餐后1h服藥，忌茶，3次/天，4周為一個療程，治療3個療程。⑶觀察指標整個研究期間，患者需要進行常規(guī)輸血治療以維持血紅蛋白(Hb)水平≥70g/L。每4周檢測1次SF、SI、血常規(guī)、血生化、尿蛋白等；定期觀察心電圖、超聲心電圖、橈骨X線等；密切觀察患者用藥情況，了解有無不良反應。⑷統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料結果以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。⑸治療結果所有患者在治療過程中均未發(fā)現(xiàn)過敏反應，均無惡心、嘔吐等胃腸道反應，無關節(jié)疼痛、腫脹，未出現(xiàn)視力及聽力異常，用藥期間肝腎功能、電解質(zhì)未見明顯改變，未發(fā)現(xiàn)與治療相關性血象異常，表明蠶砂提取物具有良好的安全性、耐用性和依從性?；颊咧委熐昂骃F和SI的平均水平見下表2。表2.患者治療前后SF和SI的平均水平時間例數(shù)SF(μg/L)SI(μmol/L)治療前302865.21±1121.43142.84±41.21治療后4周302561.33±985.45138.87±40.15治療后8周302169.23±851.46**118.52±38.44**治療后12周301979.41±326.73**89.32±34.38**注：與治療前相比，*P<0.05，**P<0.01。表2顯示，與治療前相比，患者在接受蠶砂提取物治療后4周SF和SI平均值均有下降趨勢，8周和12周的SF和SI平均值均明顯下降，與治療前相比具有顯著性差異(P＜0.01)，表明蠶砂提取物對鐵過載具有顯著的臨床治療效果，并具有劑量相關性。實施例3.蠶砂提取物保護鐵過載所致肝、腎損傷取昆明種小鼠80只，雌雄各半，隨機分為正常對照組、陽性對照組、蠶砂提取物高劑量組和蠶砂提取物低劑量組，每組20只，雌雄各半。除正常組外，其他各組小鼠均按100mg/kg每周腹腔注射1次右旋糖酐鐵造模，連續(xù)注射10周，建立鐵過載小鼠模型。自造模之日起，各組均每天給予1次灌胃，其中：正常對照組給予1ml生理鹽水，陽性對照組給予1ml生理鹽水，蠶砂提取物高劑量組按80mg/kg給予蠶砂提取物水溶液1ml，蠶砂提取物低劑量組按40mg/kg給予蠶砂提取物水溶液1ml，治療結束后尾靜脈取血檢測小鼠血液生化指標，包括：用動物生化分析儀檢測谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT)、用動物血常規(guī)檢測儀檢測SI、用試劑盒檢測總膽紅素、總抗氧化能力(T-AOC)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)、活性氧(ROS)、腫瘤壞死因子(TNFα)、白細胞介素6(IL-6)、超敏C反應蛋白；并進行尿常規(guī)檢測；取小鼠肝臟和腎臟組織進行病理切片；取小鼠腎臟組織，檢測其中8-OHdG含量并利用Western檢測其中HO-1蛋白表達水平。檢測結果：⑴血液生化指標檢測結果和腎組織8-OHdG含量檢測結果鐵過載肝損傷指標，包括GOT和GPT的檢測結果見下表3。表3.蠶砂提取物對鐵過載小鼠肝損傷指標注：與陽性對照組相比，*p<0.05，**p<0.01。表3顯示，與正常對照組小鼠比較，鐵過載陽性對照組小鼠GOT和GPT升高。蠶砂提取物低劑量組和高劑量組與陽性對照組相比，GOT和GPT均明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.01)，說明蠶砂提取物低劑量組和高劑量組均能明顯阻止鐵過載所致肝損傷，并具有劑量相關性。鐵過載腎損傷指標，包括SI、總膽紅素、T-AOC、MDA、ROS的檢測結果見下表4。表4.蠶砂提取物對鐵過載小鼠腎損傷指標注：與陽性對照組相比，*p<0.05，**p<0.01。鐵過載腎損傷指標，包括TNFα、IL-6、超敏C反應蛋白、8-OHdG含量的檢測結果見下表5。表5.蠶砂提取物對鐵過載小鼠腎損傷指標注：與陽性對照組相比，*p<0.05，**p<0.01。表4和表5顯示，與正常對照組小鼠比較，鐵過載陽性對照組小鼠SI、總膽紅素、MDA、ROS、TNFα、IL-6、超敏C反應蛋白、腎組織8-OHdG含量明顯升高，而T-AOC降低。蠶砂提取物低劑量組和高劑量組與陽性對照組相比，SI、總膽紅素、MDA、ROS、TNFα、IL-6、超敏C反應蛋白、腎組織8-OHdG含量明顯降低，T-AOC明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.01或p＜0.05)，說明蠶砂提取物低劑量組和高劑量組均能明顯阻止鐵過載所致腎損傷，并具有劑量相關性。⑵病理檢測結果圖1顯示，與正常小鼠比較，陽性對照組小鼠肝臟出現(xiàn)明顯炎癥滲出和壞死，而蠶砂提取物高劑量組和低劑量組均有明顯的阻止鐵過載所致肝損傷作用。圖2顯示，與正常小鼠比較，陽性對照組小鼠腎臟出現(xiàn)明顯炎癥滲出和壞死，而蠶砂提取物高劑量組和低劑量組均有明顯的阻止鐵過載所致腎損傷作用。⑶尿液指標檢測結果尿常規(guī)檢測的檢測結果見下表6。表6.小鼠尿常規(guī)檢測結果表6顯示，與正常對照組小鼠比較，鐵過載陽性對照組小鼠尿液中蛋白質(zhì)含量和潛血升高。蠶砂提取物低劑量組和高劑量組與陽性對照組相比，尿液中蛋白質(zhì)含量和潛血明顯降低，均為陰性，說明蠶砂提取物低劑量組和高劑量組均能明顯阻止鐵過載所致腎損傷。⑷Western檢測腎組織HO-1蛋白表達結果Western檢測腎組織HO-1蛋白表達結果見圖3，其中，β-Actin為對照。圖3顯示，與正常對照組小鼠比較，鐵過載陽性對照組小鼠應激性腎臟HO-1蛋白表達水平升高。蠶砂提取物低劑量組和高劑量組與陽性對照組相比，腎臟HO-1蛋白表達水平均進一步提高作用，并具有劑量相關性。試驗結論：蠶砂提取物能降低鐵過載小鼠GOT、GPT、SI、總膽紅素、MDA、ROS、TNFα、IL-6、超敏C反應蛋白和腎組織8-OHdG含量，提高總抗氧化能力，降低尿蛋白含量和潛血，能夠阻止鐵過載所致肝、腎損傷。肝臟和腎臟病理切片進一步證明蠶砂提取物有明顯阻止鐵過載所致肝、腎損傷作用。Western檢測HO-1蛋白表達表明，蠶砂提取物明顯上調(diào)腎組織HO-1蛋白表達水平，從而能夠保護腎臟，促進腎功能恢復。以上，對本發(fā)明的實施方式進行了說明。但是，本發(fā)明不限定于上述實施方式。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3