本發(fā)明公開(kāi)一種D-氨基酸在抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的醫(yī)用用途，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：隨著口腔醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展和種植技術(shù)的日臻成熟,種植義齒已成為牙列缺損及牙列缺失患者的治療首選。臨床資料顯示，雖然近十余年的種植義齒存留率已達(dá)97.1%，但其生物學(xué)并發(fā)癥并無(wú)明顯降低。種植體周?chē)つぱ准捌淅^發(fā)的種植體周?chē)卓梢鹁植磕[脹不適、骨吸收甚至種植體松動(dòng)脫落，其導(dǎo)致種植失敗的病例約占失敗總數(shù)的30％以上。大量資料顯示，種植體周?chē)つぱ装l(fā)生的始動(dòng)因素為種植體頸部菌斑生物膜的形成，生物膜中細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性近乎于浮游狀態(tài)細(xì)菌的500倍。與天然牙相似，當(dāng)種植體周發(fā)生炎癥時(shí)，其主要菌群從G+菌轉(zhuǎn)變?yōu)镚-菌，其中牙齦卟啉單胞菌是被公認(rèn)為與種植體周?chē)装Y發(fā)生發(fā)展甚至種植體最終脫落關(guān)系最為密切的細(xì)菌。目前，研究已證實(shí)了牙齦卟啉單胞菌（Porhyromonasgingivalis,P.g）在牙周炎、種植體周?chē)椎瓤谇患膊〉陌l(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。臨床上去除菌斑生物膜、控制種植體周?chē)椎姆椒ㄖ饕校簷C(jī)械處理、激光治療、藥物治療和光動(dòng)力治療等。器械處理包括拋光杯、塑料、碳纖維或鈦刮治器的使用以及超聲潔治刮治和氣壓噴砂等。由于種植體表面粗糙多孔，機(jī)械治療方法均不能徹底清除其表面的生物膜和細(xì)菌。另外，在使用器械操作時(shí)可能會(huì)引起鈦表面的損傷或器械材料的殘留，干擾機(jī)體細(xì)胞的再附著。激光治療對(duì)種植體的長(zhǎng)期影響尚不明確，實(shí)驗(yàn)顯示不適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)可引起SLA或TPS鈦表面的廣泛熔化，這種熱損傷可能會(huì)對(duì)種植體產(chǎn)生長(zhǎng)期的潛在損害。葡萄糖酸氯己定被認(rèn)為是抗微生物藥物中的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它雖能有效地降低細(xì)菌的活性，卻不能破壞生物膜；長(zhǎng)期抗生素的使用還會(huì)導(dǎo)致部分菌株耐藥性的產(chǎn)生。光動(dòng)力抗菌療法是治療種植體周?chē)椎囊环N前沿方法，其抗菌機(jī)理是光化學(xué)反應(yīng)引起細(xì)菌胞漿膜的破壞，但實(shí)驗(yàn)顯示該療法并不能破壞生物膜的完整性，因此不能徹底清除細(xì)菌。經(jīng)檢索相關(guān)文獻(xiàn)，臨床上仍沒(méi)有一種能夠有效清除生物膜的技術(shù)或制劑，如何有效地清除種植體表面的生物膜成為預(yù)防和治療種植體周?chē)椎募夹g(shù)關(guān)鍵。抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的藥物及制劑的開(kāi)發(fā)將有助于預(yù)防及治療由牙齦卟啉單胞菌參與引起的口腔疾病。研究結(jié)果可能為臨床上預(yù)防和治療種植體周?chē)仔滤幍难兄铺峁├碚撘罁?jù)。組成地球生命體的氨基酸絕大部分是L-氨基酸，而近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)D-氨基酸也存在于人體、動(dòng)植物以及微生物的體內(nèi)，但是關(guān)于D-氨基酸對(duì)于細(xì)菌生物膜形成的作用是未知的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開(kāi)一種D-氨基酸在抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的醫(yī)用用途，利用D-氨基酸對(duì)于細(xì)菌生物膜的破壞作用，使D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成具有抑制作用，可以應(yīng)用于防治牙齦卟啉單胞菌引起的牙周炎、種植體周?chē)椎燃膊?。本發(fā)明通過(guò)外源性D-氨基酸作用于細(xì)菌生物膜形成期，進(jìn)行細(xì)菌生物膜形成狀態(tài)的觀察，證明了D-氨基酸具有明顯的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及生物膜形成的作用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)路線：利用有效D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采取結(jié)晶紫及胞外多糖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)及掃描電子顯微鏡進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。牙齦卟啉單胞菌的鑒定：通過(guò)革蘭染色觀察細(xì)菌形態(tài)并通過(guò)16SrRNAPCR進(jìn)行牙齦卟啉單胞菌特定引物序列的鑒定，上游引物：5‘-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’，下游引物：5‘-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組為梯度濃度的D-氨基酸與對(duì)數(shù)期的牙齦卟啉單胞菌菌液共培養(yǎng)，對(duì)照度為空白培養(yǎng)基與對(duì)數(shù)期的牙齦卟啉單胞菌菌液共培養(yǎng)。牙齦卟啉單胞菌的培養(yǎng)：將牙齦卟啉單胞菌接種到液體BHI培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的第24小時(shí)、28小時(shí)……72小時(shí)，每4小時(shí)利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值（OD值），繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示48小時(shí)時(shí)，牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，72小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰。D-氨基酸的配制：用電子分析天平秤取一定量的粉狀D-氨基酸，溶于無(wú)菌去離子水后，用0.22um濾菌器過(guò)濾除菌，備用。通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定牙齦卟啉單胞菌生物膜聚集量，結(jié)果顯示高濃度D-氨基酸能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜的聚集。通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定牙齦卟啉單胞菌生物膜分泌的胞外多糖，結(jié)果顯示高濃度D-氨基酸能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成。通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響：各組掃描電子顯微鏡圖片，如圖1-5，結(jié)果顯示，高濃度D-氨基酸具有很好的抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的作用，隨著D-氨基酸濃度的降低這種作用效果也在下降。各種D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的作用，見(jiàn)表1，也說(shuō)明不是所有D-氨基酸都能抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成。表1.各種D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的作用列表有效D-氨基酸無(wú)效D-氨基酸D-纈氨酸D-半胱氨酸D-苯丙氨酸D-色氨酸D-丙氨酸D-亮氨酸D-蛋氨酸D-甘氨酸D-谷氨酸D-精氨酸D-組氨酸D-賴(lài)氨酸D-天冬氨酸D-蘇氨酸D-脯氨酸D-異亮氨酸D-絲氨酸D-酪氨酸本發(fā)明的積極效果在于：公開(kāi)了D-氨基酸在抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的醫(yī)用用途，利用D-氨基酸對(duì)于細(xì)菌生物膜的破壞作用，使D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成具有抑制作用，可以應(yīng)用于防治牙齦卟啉單胞菌引起的牙周炎、種植體周?chē)椎燃膊　８綀D說(shuō)明圖1為本發(fā)明對(duì)照組電鏡圖片，可見(jiàn)生物膜厚且致密；圖2為本發(fā)明高濃度組電鏡圖片，可見(jiàn)無(wú)生物膜形成，細(xì)菌散在單個(gè)分布；圖3為本發(fā)明次高濃度組電鏡圖片，可見(jiàn)無(wú)生物膜形成，細(xì)菌間連接為鏈；圖4為本發(fā)明低濃度組電鏡圖片，可見(jiàn)有較為松散的生物膜形成；圖5為本發(fā)明最低濃度組電鏡圖片，可見(jiàn)生物膜明顯，較致密。具體實(shí)施方式實(shí)施例1以D-氨基酸為主要活性成分可以制成藥物學(xué)上抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的任何藥物制劑。通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)表明D-氨基酸在抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的醫(yī)學(xué)效果：1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模罕緦?shí)驗(yàn)研究D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響。2.實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)所用菌株為P.gATCC33277，牛腦心浸液（OXOID公司，英國(guó)）、恒溫培養(yǎng)箱（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司，蘇州）、厭養(yǎng)袋（日本三菱）、D-氨基酸（鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司,北京）、紫外分光光度計(jì)（Bio-Rad，美國(guó)）。3.實(shí)驗(yàn)方法3.1細(xì)菌的培養(yǎng)和鑒定P.gATCC33277培養(yǎng)于含有維生素K(1μl/mL)、氯化學(xué)紅素（5μg/mL）和5%羊血的牛腦心浸液培養(yǎng)基（固體BHI培養(yǎng)基）中，厭養(yǎng)培養(yǎng)5～7天后，于液體牛腦心浸液培養(yǎng)基（液體BHI培養(yǎng)基）增菌1～2天。革蘭染色后鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，16SrRNAPCR方法鑒定P.gATCC33277，引物序列為：上游引物：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’，下游引物：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’。3.2生長(zhǎng)曲線的繪制將P.gATCC33277于固體BHI培養(yǎng)中厭養(yǎng)培養(yǎng)7天后，接種于液體BHI培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的第24小時(shí)、28小時(shí)……72小時(shí)，每4小時(shí)利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值（OD值），繪制生長(zhǎng)曲線。3.3生物膜聚集量的檢測(cè)取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P.gATCC33277，以108CFU的菌液濃度分別加入D-氨基酸（濃度梯度），加入等量的液體BHI培養(yǎng)基作為對(duì)照組，取150μl培養(yǎng)夜加入96孔板中，厭養(yǎng)培養(yǎng)72小時(shí)。去除培養(yǎng)基及游離的P.gATCC33277，在96孔板中加入50μl結(jié)晶紫溶液20分鐘，用PBS沖洗3次，干燥后加入無(wú)水乙醇，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度值（A490）。通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響。3.4細(xì)菌分泌胞外多糖的檢測(cè)取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P.gATCC33277，以108CFU的菌液濃度分別加入D-氨基酸（濃度梯度），加入等量的液體BHI培養(yǎng)基作為對(duì)照組，取150μl培養(yǎng)夜加入96孔板中，厭養(yǎng)培養(yǎng)72小時(shí)。去除培養(yǎng)基及游離的P.gATCC33277，PBS沖洗3次，在96孔板中加入40μl苯酚溶液，200μl硫酸溶液30分鐘，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其吸光度值（A490）。3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS23.0軟件，用t檢驗(yàn)的方法比較試驗(yàn)組與對(duì)照組P.gATCC33277生物膜形成的吸光光度值。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1P.gATCC33277鑒定結(jié)果P.gATCC33277經(jīng)過(guò)革蘭染色后在鏡下觀察為淡紅色短棒狀。4.2生長(zhǎng)曲線的繪制P.gATCC33277生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示48小時(shí)時(shí)，牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，72小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰。4.3通過(guò)結(jié)晶紫染色法測(cè)定牙齦卟啉單胞菌生物膜聚集量，通過(guò)SPSS23.0軟件進(jìn)行結(jié)果分析，得出了有效D-氨基酸（D-纈氨酸、D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-蛋氨酸、D-谷氨酸、D-組氨酸、D-天冬氨酸、D-脯氨酸、D-絲氨酸）和無(wú)效D-氨基酸（D-半胱氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸、D-甘氨酸、D-精氨酸、D-賴(lài)氨酸、D-蘇氨酸、D-異亮氨酸、D-酪氨酸）。見(jiàn)表2，表3。表2無(wú)效D-氨基酸組注：與對(duì)照組（P.g組）相比較，顯著性一欄結(jié)果<0.05為有顯著性差異，即該組有效；否則為無(wú)顯著性差異，即該組無(wú)效。表3有效D-氨基酸注：與對(duì)照組（P.g組）相比較，顯著性一欄結(jié)果<0.05為有顯著性差異，即該組有效；否則為無(wú)顯著性差異，即該組無(wú)效。4.4通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定牙齦卟啉單胞菌生物膜分泌的胞外多糖，結(jié)果顯示高濃度D-氨基酸能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜的形成，隨著D-氨基酸濃度的降低作用效果減弱。4.5通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察D-氨基酸對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的影響：各組掃描電子顯微鏡圖片見(jiàn)附圖1~圖5。結(jié)果顯示，高濃度D-氨基酸具有很好的抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成的作用，隨著D-氨基酸濃度的降低這種作用效果明顯減弱。結(jié)論：有效D-氨基酸為：D-纈氨酸、D-苯丙氨酸、D-丙氨酸、D-蛋氨酸、D-谷氨酸、D-組氨酸、D-天冬氨酸、D-脯氨酸、D-絲氨酸可以抑制牙齦卟啉單胞菌生物膜形成。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3