一種具有抗內(nèi)皮炎癥的王不留行刺桐堿的應(yīng)用制作方法，屬于中藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種具有抗內(nèi)皮炎癥的王不留行刺桐堿，闡明其在醫(yī)藥，食品、化妝品方面的新用途。

背景技術(shù)：

血管內(nèi)皮細胞是介于血流和血管壁組織之間的一層單核細胞，可通過自分泌、內(nèi)分泌、旁分泌三種途徑分泌一系列一氧化氮(NO)、前列環(huán)素2(PGI2)、內(nèi)皮素-1(ET-1)等血管活性物質(zhì)發(fā)揮調(diào)節(jié)血管緊張性、抗血栓形成、抑制平滑肌細胞增殖及血管壁炎癥反應(yīng)等功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮炎癥是很多心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，研究證實內(nèi)皮炎癥是導(dǎo)致高血壓、糖尿病、冠心病等患者內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損的重要因素。炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，在高血壓、糖尿病內(nèi)皮功能障礙的病理過程中也具有重要的作用。炎癥內(nèi)皮細胞影響細胞外基質(zhì)和纖維蛋白原降解，增加血管基膜厚度，產(chǎn)生的粘附分子增加內(nèi)皮細胞對白細胞的粘附，也會引起內(nèi)皮細胞損傷，以內(nèi)皮炎癥為靶點成為治療高血壓、糖尿病、冠心病等血管病變的主要策略之一。我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腦心通、通心絡(luò)、血脂康膠囊、黃連素等傳統(tǒng)中藥均可通過抑制內(nèi)皮細胞炎癥來促進內(nèi)皮細胞修復(fù)，進而恢復(fù)血管平衡穩(wěn)態(tài)，減少心血管不良事件。我國中藥博大精深，篩選具有抗內(nèi)皮炎癥的中藥不僅拓展了治療內(nèi)皮炎癥相關(guān)疾病的選擇，也為我國治療內(nèi)皮炎性相關(guān)心血管疾病的藥物篩選提供的新的策略。

王不留行是石竹科植物麥藍菜Vaccaria Segetalis(Neck.)Garcke的干燥成熟種子，具有活血通經(jīng)、下乳消腫等功效。王不留行主要含有刺桐堿、三萜皂苷、黃酮苷、類脂、環(huán)肽、脂肪酸和單糖等成分，過去本實驗室研究發(fā)現(xiàn)通過單因素實驗、正交實驗及驗證實驗，對王不留行刺桐堿得率進行工藝優(yōu)化，將王不留行種子經(jīng)石油醚脫脂，75％乙醇85℃回流提取，減壓濃縮至干，去離子水復(fù)溶，水飽和正丁醇萃取得正丁醇相，再用硅膠GF254板，以展開劑為正丁醇:乙酸乙酯:水＝4:1:5的薄層層析制備；C18柱高效制備液相分離得刺桐堿，并經(jīng)理化性質(zhì)鑒定、紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)確定王不留行刺桐堿的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過查閱大量文獻，尚未見到我國學(xué)者對王不留行刺桐堿抗內(nèi)皮炎癥的相關(guān)文獻報道(自CNKI、萬方、維普中國期刊網(wǎng))，因此王不留行刺桐堿在具有抗內(nèi)皮炎癥的藥理、藥效等研究領(lǐng)域目前還處于空白階段。本研究發(fā)現(xiàn)王不留行刺桐堿具有抑制內(nèi)皮細胞炎癥的作用，為治療內(nèi)皮細胞炎癥相關(guān)疾病提供新的治療方法與應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

所述王不留行刺桐堿對內(nèi)皮細胞炎癥的影響，將人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)給予不同濃度的脂多糖(LPS)和王不留行刺桐堿孵育48h，經(jīng)實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測內(nèi)皮炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達。本發(fā)明要解決的是為現(xiàn)有的治療內(nèi)皮炎癥的藥物提供一種新的途徑，提供王不留行刺桐堿在抗內(nèi)皮細胞炎癥中的作用，因此本研究提供的技術(shù)方法是將王不留行刺桐堿應(yīng)用于制備抗內(nèi)皮細胞炎癥的藥物。

本發(fā)明的有益效果是：王不留行刺桐堿顯著抑制LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞炎癥，將王不留行刺桐堿應(yīng)用到抗內(nèi)皮細胞炎癥相關(guān)疾病藥物的開發(fā)中，以制備更好的抗內(nèi)皮炎癥相關(guān)心血管疾病藥物。

附圖說明

圖1：脂多糖誘導(dǎo)的炎癥內(nèi)皮細胞模型。

圖2：王不留行刺桐堿對內(nèi)皮細胞炎癥因子的影響。

圖3：王不留行刺桐堿對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥的影響。

圖4：王不留行刺桐堿對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞TLR4的影響。

具體實施方式

實施例1脂多糖誘導(dǎo)的炎癥內(nèi)皮細胞模型

將處于對數(shù)期的人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)消化后傳代至6孔板，待細胞長至70％-80％狀態(tài)下給予脂多糖(LPS)在不同濃度(0，100，200和500ng/ml)情況下孵育48h，棄去培養(yǎng)基，無菌磷酸鹽緩沖生理液體(PBS)清洗三次，Trizol提取RNA，經(jīng)RT-PCR檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達。結(jié)果顯示LPS劑量依賴性升高內(nèi)皮細胞TNF-α、IL-1β、VCAM-1和MCP-1的水平，提示LPS誘導(dǎo)炎癥內(nèi)皮細胞模型成功，見圖1。

數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，每組樣本為4，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，*與0ng/ml組相比，TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管細胞粘附分子-1；MCP-1，單核細胞趨化蛋白-1。

實施例2王不留行刺桐堿對內(nèi)皮細胞炎癥因子的影響

將處于對數(shù)期的人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)消化后傳代至6孔板，待細胞長至70％-80％狀態(tài)下給予王不留行刺桐堿在不同濃度(0，25，50，100μM)情況下孵育48h，棄去培養(yǎng)基，無菌磷酸鹽緩沖生理液體(PBS)清洗三次，Trizol提取RNA，經(jīng)RT-PCR檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達。結(jié)果顯示不同劑量的王不留行刺桐堿對內(nèi)皮細胞TNF-α、IL-1β、VCAM-1和MCP-1的水平無明顯影響，見圖2。

數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，每組樣本為4，TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管細胞粘附分子-1；MCP-1，單核細胞趨化蛋白-1。

實施例3王不留行刺桐堿對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥的影響

將處于對數(shù)期的人微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)消化后傳代至6孔板，待細胞長至70％-80％狀態(tài)下先給予不同濃度的王不留行刺桐堿(0，25，50，100μM)孵育6h，再給予高劑量的脂多糖(LPS，500ng/ml)處理48h，棄去培養(yǎng)基，無菌磷酸鹽緩沖生理液體(PBS)清洗三次，Trizol提取RNA，經(jīng)RT-PCR檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達。結(jié)果顯示高劑量的王不留行刺桐堿顯著抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥，見圖3。

數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，每組樣本為4，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，*與Control組相比，與LPS組相比，P<0.05。LPS，脂多糖；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管細胞粘附分子-1；MCP-1，單核細胞趨化蛋白-1。

實施例4王不留行刺桐堿對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞TLR4的影響

Toll樣受體4(TLR4)是參與內(nèi)皮細胞炎癥的重要分子，而脂多糖(LPS)是TLR4的激活劑，為研究王不留行刺桐堿對脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞TLR4的影響，我們采用Western Blot和RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，LPS劑量依賴性升高內(nèi)皮細胞TLR4的表達，單純的王不留行刺桐堿不影響內(nèi)皮細胞TLR4的表達，但卻可以降低LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞TLR4蛋白和mRNA的表達，見圖4，(A)，LPS對TLR4蛋白的影響；(B)，LPS對TLR4的mRNA的影響；(C)，王不留行刺桐堿對TLR蛋白的影響；(D)，王不留行刺桐堿對TLR4的mRNA的影響；(E)，王不留行刺桐堿對LPS誘導(dǎo)的TLR4蛋白的影響；(F)，王不留行刺桐堿對LPS誘導(dǎo)的TLR4的mRNA的影響。

數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，每組樣本為4，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異，*與Control組相比，與LPS組相比，P<0.05。LPS，脂多糖；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-1β，白介素-1β；VCAM-1，血管細胞粘附分子-1；MCP-1，單核細胞趨化蛋白-1。