本發(fā)明涉及生物治療領(lǐng)域，特別涉及一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃斑區(qū)是視網(wǎng)膜的一個(gè)重要區(qū)域，位于眼后極部，主要與精細(xì)視覺(jué)及色覺(jué)等視功能有關(guān)。一旦黃斑區(qū)出現(xiàn)病變，常常出現(xiàn)視力下降、眼前黑影或視物變形。黃斑病變通常有兩種類(lèi)型。一種是干性黃斑病變，一種是濕性黃斑病變。濕性黃斑變性占總發(fā)病率的10％，是由于視網(wǎng)膜下有異常的血管生長(zhǎng)，新生血管破裂出血，并引起疤痕組織生長(zhǎng)，使視力突然下降，會(huì)迅速?lài)?yán)重地影響患者的中心視力，甚至導(dǎo)致中心視力喪失。濕性黃斑病變的主要癥狀表現(xiàn)為：中央視力快速減弱，視物變形，紙上字句彎曲，視覺(jué)中央出現(xiàn)黑影或模糊區(qū)域。目前對(duì)于黃斑病變的治療常常采用中醫(yī)或臨床手術(shù)等方法，但是該類(lèi)方法僅能起到延緩病情，而不能起到根治的作用。此外，現(xiàn)有治療方法復(fù)發(fā)率高，長(zhǎng)期致盲率高。

目前，越來(lái)越多的研究者將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)應(yīng)用于視網(wǎng)膜病變(ROP)的治療。BMSCs治療ROP的機(jī)制表現(xiàn)如下：1.細(xì)胞遷移聚集到損傷區(qū)域，當(dāng)視網(wǎng)膜血管損傷后，BMSCS會(huì)產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生因子和細(xì)胞間黏附因子等，在改善血管形成微環(huán)境方面起到重要作用；2.細(xì)胞移植參與修復(fù)：①被移植的干細(xì)胞向病變組織遷移、增殖、融合而補(bǔ)充已經(jīng)受損的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并與宿主的神經(jīng)細(xì)胞形成緊密的的突觸聯(lián)系，重建神經(jīng)通路，完善相應(yīng)功能；②通過(guò)自分泌及旁分泌的功能，發(fā)揮其移植后神經(jīng)保護(hù)及營(yíng)養(yǎng)作用；③免疫調(diào)節(jié)作用及下調(diào)炎癥反應(yīng)，在一定程度上抑制相關(guān)炎性因子對(duì)視網(wǎng)膜血管細(xì)胞及神經(jīng)組織的損傷，且減低了臨床移植后相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生概率。因此，研發(fā)一種對(duì)黃斑性病變具有良好療效的干細(xì)胞制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，所述干細(xì)胞制劑對(duì)黃斑性病變有良好的療效。

本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑，包括如下組分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1～5×10⁶個(gè)/ml、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子5～30ng/mL、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β5～30ng/mL和質(zhì)量濃度為5％的白蛋白。

優(yōu)選地，所述干細(xì)胞制劑還包括溶劑，所述溶劑為生理鹽水。

優(yōu)選地，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照以下步驟獲得：

(1)將骨髓采用Ficoll密度梯度離心方法分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用DMEM+10％FBS完全培養(yǎng)基對(duì)分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，獲得可傳代的原代細(xì)胞；

(2)將步驟(1)獲得的可傳代的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第二代(P2)至第五代(P5)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用作所述干細(xì)胞制劑的組分。

本發(fā)明還公開(kāi)了所述干細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟：

a1)、將白蛋白和生理鹽水混合，配制白蛋白懸液；

b1)、往步驟a1)制備得到的白蛋白懸液中添加表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；

c1)、用步驟b1)制得的懸液重懸骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，制得所述干細(xì)胞制劑。

優(yōu)選的，本發(fā)明還公開(kāi)了所述的干細(xì)胞制劑或根據(jù)所述的制備方法制得的干細(xì)胞制劑在治療黃斑性病變中的應(yīng)用。

本發(fā)明干細(xì)胞制劑組分中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子直接參與損傷組織的修復(fù)，增強(qiáng)未損傷組織的抵抗能力，起到連續(xù)性的修復(fù)作用，大大縮短組織修復(fù)的時(shí)間。

所述干細(xì)胞制劑中的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β可直接參與損傷組織的替代修復(fù)，大大減少治愈期限。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，簡(jiǎn)稱(chēng)HSA)是人血漿中的蛋白質(zhì)，其非糖基化的單鏈多肽包含585個(gè)氨基酸，分子量為66kD。細(xì)胞提供了穩(wěn)定的、直接的營(yíng)養(yǎng)供給，保證了細(xì)胞存活率。

所述人血清白蛋白為細(xì)胞提供了穩(wěn)定的、直接的營(yíng)養(yǎng)供給，保證了細(xì)胞存活率。

綜上所述，本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，該干細(xì)胞制劑包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和白蛋白。本發(fā)明公開(kāi)的干細(xì)胞制劑具有如下有益效果：

1、制劑中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子直接參與損傷組織的修復(fù)，增強(qiáng)未損傷組織的抵抗能力，起到連續(xù)性的修復(fù)作用，縮短組織修復(fù)時(shí)間；

2、制劑中的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β可直接參與損傷組織的替代修復(fù)，大大減少治愈期限。

3、所述干細(xì)胞制劑對(duì)黃斑性視網(wǎng)膜病變具有良好的療效。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡圖；

圖2A為本發(fā)明實(shí)施例中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的對(duì)照管流式檢測(cè)結(jié)果圖；

圖2B為本發(fā)明實(shí)施例中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的樣品管流式檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了一種干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用，該干細(xì)胞制劑能夠避免血液流動(dòng)而造成外泌體的損失，增強(qiáng)未損傷組織的抵抗能力，縮短修復(fù)時(shí)間，對(duì)黃斑性病變具有良好的療效。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)

取收集好的骨髓，在超凈臺(tái)中采用ficoll密度梯度離心方法，分離出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；用DMEM+10％FBS完全培養(yǎng)基重懸后接種至15cm規(guī)格的平皿中，轉(zhuǎn)移至5％CO₂、37℃的環(huán)境中培養(yǎng)。

培養(yǎng)48h后換液，補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，獲得可傳代的原代細(xì)胞；2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

1)取可傳代的原代(P0)細(xì)胞，棄掉皿內(nèi)原培養(yǎng)液，加入10mL PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞生長(zhǎng)面，棄去洗液；

2)加入2mL0.25％胰蛋白酶，左右搖晃平皿使胰酶均勻覆蓋于皿底，在顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞間隙增大，胞質(zhì)回縮，當(dāng)長(zhǎng)梭形細(xì)胞變圓變亮?xí)r，立即加入10倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化；

3)用移液槍反復(fù)吹打，直至細(xì)胞全部脫落成單細(xì)胞懸液，將懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm室溫離心5min；

4)棄上清，加入DMEM+10％FBS完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度調(diào)至1×10⁵cells，置于37℃、5％二氧化碳和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5)待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)，重復(fù)操作2)獲得本實(shí)施例所用的第二代(P2)至第五代(P5)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。圖1A為第二代(P2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞放大40倍的顯微鏡圖，圖1B為第二代(P2)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞放大100倍的顯微鏡圖。

3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

收集傳代培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞P₃代細(xì)胞3×10⁶cell，均分至三個(gè)EP管中，加入10％FBS+PBS吹打均勻后，1500rpm離心5min，棄上清。清洗2次后，每管細(xì)胞加入10％FBS+PBS各200uL，分別標(biāo)記為對(duì)照管(C)、樣品管1(S1)、樣品管2(S2)。其中C管不添加任何東西，S1管添加CD45、CD73、CD90、HLA-DR；S2管添加CD105、CD11b、CD19、CD90；吹打均勻后，避光4℃孵育20min，孵育完加入10％FBS+PBS吹打均勻后，1500rpm離心5min后，棄上清。清洗2次后，用70um的濾網(wǎng)過(guò)濾，上流式儀檢測(cè)表面抗原。流式結(jié)果如圖2所示，圖2A為對(duì)照管(C)的流式檢測(cè)結(jié)果，圖2B為樣品管1(S1)和樣品管2(S2)的流式檢測(cè)結(jié)果。

根據(jù)2006年ISCT頒布的《間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定的最低標(biāo)準(zhǔn)》，CD73、CD90、CD105三種表面抗原的表達(dá)不低于95.0％；CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表達(dá)不高于2.0％。圖2A是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞8種抗原相應(yīng)的同型對(duì)照。圖2B是8種抗原的表達(dá)情況：CD73、CD90、CD105表達(dá)高于95.0％；HLA-DR、CD45、CD19、CD34、CD11b表達(dá)低于2.0％，符合干細(xì)胞的表面抗原特征，說(shuō)明了骨髓干細(xì)胞并沒(méi)有出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，仍維持著干細(xì)胞的特點(diǎn)。

實(shí)施例2干細(xì)胞制劑的制備

將白蛋白與生理鹽水混合，配制得到質(zhì)量濃度為5％的白蛋白懸液；

往所配制的白蛋白懸液中添加EGF和TGF-β，調(diào)整濃度均為10ng/mL；

收集實(shí)施例1制備的第二代至第五代任意一代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用生理鹽水清洗2遍，用上述配制的懸液重懸收集到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的含量調(diào)整至3×10⁶cells，獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，置于4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3干細(xì)胞制劑的制備

將白蛋白與生理鹽水混合，配制得到質(zhì)量濃度為5％的白蛋白懸液；

往所配制的白蛋白懸液中添加EGF和TGF-β，調(diào)整濃度均為5ng/mL；

收集實(shí)施例1制備的第二代至第五代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用生理鹽水清洗2遍，用上述配制的白蛋白懸液重懸收集到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的含量調(diào)整至1×10⁶cells，獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，置于4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4干細(xì)胞制劑的制備

將白蛋白與生理鹽水混合，配制得到濃度為5％的白蛋白懸液；

往所配制的白蛋白懸液中添加EGF和TGF-β，調(diào)整濃度均為30ng/mL；

收集實(shí)施例1制備的第二代至第五代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用生理鹽水清洗2遍，用上述配制的白蛋白懸液重懸收集到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的密度調(diào)整至5×10⁶cells獲得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，置于4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例5動(dòng)物試驗(yàn)

黃斑性病變的大鼠模型的建模方法為：將成年SD大鼠(2-3月齡)使用劑量為40mg/Kg鹽酸氯胺酮和6mg/Kg甲苯噻嗪肌肉注射全身麻醉后，將微量注射器插入到視網(wǎng)膜下腔，注入1.2μL基底膜基質(zhì)凝膠(基底膜基質(zhì)凝膠經(jīng)PBS3:1稀釋)，構(gòu)建大鼠黃斑性病變模型。

1.動(dòng)物：選取濕性黃斑病變的大鼠模型，體重相近，部分雌雄，共40只。

2.實(shí)驗(yàn)分組：濕性黃斑病變的大鼠均分為4組，每組各10只；分組如表1所示，每組制劑移植的體積為50uL，2周后進(jìn)行檢測(cè)。

3.采用3D Topcon OCT-1000進(jìn)行檢查，檢查參數(shù)為：掃描深度6.0mm×6.0mm，掃描長(zhǎng)度隨病變范圍而調(diào)整。掃描方式為垂直或水平線(xiàn)形掃描。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1試驗(yàn)分組及試驗(yàn)結(jié)果

從結(jié)果可知，使用實(shí)施例2～5制備的干細(xì)胞制劑進(jìn)行回注，其對(duì)濕性黃斑病變的取得較為明顯的改善作用，治愈率為80.0％～95.0％。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。