本申請是申請日為2011年03月10日，申請?zhí)枮?01180013592.5，發(fā)明名稱為“流感樣疾病的療法”的申請的分案申請。

發(fā)明領域

本發(fā)明涉及患有在確立的流感樣疾病(ili)期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體的治療。我們用確立的流感樣疾病來表示其中癥狀例如對于個體或護理人員而言已經明顯持續(xù)至少24小時、更具體至少48小時的疾病。更具體地，本發(fā)明涉及通過氣霧劑遞送干擾素-β(ifn-β)或增加ifn-β表達的藥劑至下呼吸道來治療患有在ili期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體、特別是住院患者。流感樣疾病是特征為以下癥狀中的兩個的疾?。侯^痛、咳嗽、喉嚨痛和肌肉痛和/或確診流感。更具體地，ili可以被定義為發(fā)燒>37.8℃加上以下癥狀中的兩個：(頭痛、咳嗽、喉嚨痛和肌肉痛)和/或確診流感病毒感染。

發(fā)明背景

季節(jié)性流感是常見感染，特別是在冬季。每年流感病毒株(a型或b型)傳播，導致初級護理的臨床接診、住院治療的發(fā)生(主要在老年人和幼童中，但偶爾也在中年人中)和死亡(主要在老年人中)。由于流感病毒感染的直接效應或其可能的并發(fā)癥，最常見的是繼發(fā)性細菌感染，可能需要初級護理和住院的治療。針對ili的初級護理接診和冬季病床壓力的增加常常與已知社區(qū)流感活動期相關。

當出現新的流感病毒亞型時發(fā)生大流行流感，所述新的流感病毒亞型明顯不同于近期傳播的亞型和毒株，并且能夠：

·感染人類；

·在人與人之間高效傳播；

·在高比例的受感染者中引起顯著的臨床疾病。

因為病毒在人類中是新穎的，高比例的人群具有很少或沒有免疫性，產生大量的易感者；因此，疾病廣泛且迅速傳播。

之前已經提出干擾素在流感治療中的預防性或早期介入，但是取得的成功有限。

高致病性流感病毒是流感病毒的強毒力形式，例如h5n1，導致迅速且高水平的發(fā)病。

ili包括季節(jié)性流感、大流行流感和高致病性流感。

現在，我們已經發(fā)現了治療患有在ili期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體、特別是住院患者的新方法。

發(fā)明概述

相應地，本發(fā)明提供了選自以下的藥劑：

(a)干擾素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表達的藥劑；或

(c)能夠表達(a)或(b)的多核苷酸；

用于治療患有在確立的ili期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體，其中所述治療是通過氣霧劑遞送所述藥劑至下呼吸道。

本發(fā)明還提供了治療經診斷患有在確立的ili期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體的方法，該方法包括向所述個體的下呼吸道氣霧劑遞送選自由以下組成的組的藥劑：

(a)干擾素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表達的藥劑；

(c)能夠表達(a)或(b)的多核苷酸。

還提供了選自以下的藥劑：

(a)干擾素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表達的藥劑；或

(c)能夠表達(a)或(b)的多核苷酸；

在制備用于治療在確立的ili期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的藥物中的用途，其中所述治療是通過氣霧劑遞送所述藥劑至下呼吸道。

本申請?zhí)峁┝艘韵马椖浚?/p>

項目1.一種選自以下的藥劑：

(a)干擾素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表達的藥劑；或

(c)能夠表達(a)或(b)的多核苷酸；

用于治療患有在確立的ili期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體，其中所述治療是通過氣道遞送所述藥物。

項目2.根據項目1所述的藥劑，其中所述藥劑是ifn-β。

項目3.根據項目2所述的藥劑，其中所述ifn-β包括以下的序列：(a)人類ifn-β1a(seqidno:2)；或(b)人類ifn-β1b(seqidno:4)。

項目4.根據前述項目中任一項所述的藥劑，該藥劑與神經氨酸酶抑制劑組合。

項目5.根據項目4所述的藥劑，其中所述神經氨酸酶抑制劑是局部活性的。

項目6.根據項目4或項目5所述的藥劑，其中所述神經氨酸酶抑制劑是扎那米韋。

項目7.根據項目1至6中任一項所述的藥劑，其中所述下呼吸道疾病是哮喘或copd。

項目8.根據項目1至7中任一項所述的藥劑，其中所述個體是老年人，例如年齡超過60歲的老年人。

項目9.一種治療經診斷患有在確立的ili期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體的方法，該方法包括給所述個體氣道施用選自由以下組成的組的藥劑：

(a)干擾素-β(ifn-β)；

(b)增加ifn-β表達的藥劑；

(c)能夠表達(a)或(b)的多核苷酸。

項目10.根據項目9所述的方法，其中所述藥劑是ifn-β。

項目11.根據項目10所述的方法，其中所述ifn-β包括以下的序列：

(a)人類ifn-β(seqidno:2)；或(b)人類ifn-β1b(seqidno:4)。

項目12.根據項目9至11中任一項所述的方法，其中所述藥劑與神經氨酸酶抑制劑組合以同時、分別或順序施用。

項目13.根據項目9至12中任一項所述的方法，其中所述下呼吸道疾病是哮喘或copd。

項目14.根據項目9至13中任一項所述的方法，其中所述個體是老年人，例如年齡超過60歲的老年人。

項目15.一種用于治療流感樣疾病的產品，包括用于同時、分別或順序氣道施用的(i)選自如項目1所定義的(a)至(c)的第一藥劑和(ii)吸入型神經氨酸酶抑制劑。

項目16.如項目15所述的產品，該產品是用于氣霧劑遞送至氣道、特別是下氣道的藥物組合物。

項目17.如項目15或項目16所述的產品，其中所述第一藥劑是ifn-β。

項目18.根據項目1至8所述的藥劑或者根據項目9至14中任一項所述的方法，其中所述藥劑在ili癥狀變得明顯之后至少48小時通過氣霧劑遞送至下呼吸道。

附圖簡述

圖1a顯示在a型流感病毒感染后96小時時期內感染的人肺支氣管上皮細胞的百分比增加和從感染后48小時開始的ifn-β治療的效應(n＝1次實驗)。

圖1b顯示在a型流感病毒感染后96小時時期內感染的人肺支氣管上皮細胞的百分比增加和從感染后48小時開始的ifn-β治療的效應(n＝3次實驗，包括原始數據)。

圖2a顯示在a型流感病毒感染人肺支氣管上皮細胞之后96小時時期內的病毒脫落和從感染后48小時開始的ifn-β治療的效應。病毒脫落在48至96小時達到穩(wěn)態(tài)(n＝1次實驗)。

圖2b顯示在a型流感病毒感染人肺支氣管上皮細胞之后96小時時期內的病毒脫落和從感染后48小時開始的ifn-β治療的效應。病毒脫落在48至96小時達到穩(wěn)態(tài)(n＝3次實驗，包括原始數據)。

圖3顯示人類ifn-β治療對ifn-β依賴性抗病毒基因粘液病毒抗性蛋白1(mxa)在來自健康人類自愿者或食蟹獼猴的血細胞中表達的效應(n＝3)。全血用ifn-β(0-1000iu/ml)處理4小時，提取rna并測量對mxa基因表達的效應。

圖4顯示人類ifn-β治療對ifn-β依賴性抗病毒基因2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5’oas)在來自健康人類自愿者或食蟹獼猴的血細胞中表達的效應(n＝3)。全血用ifn-β(0-1000iu/ml)處理4小時，提取rna并測量對2’-5’oas基因表達的效應。

圖5顯示人類ifn-β在感染了季節(jié)性流感的食蟹獼猴細胞中的保護性效應(n＝4)。在用流感病毒株a/victoria/3/75(h3n2)以0.01的moi感染之前，用ifn-β(0、100或1000iu/ml)預處理食蟹獼猴細胞24小時。在病毒感染之后48小時收集上清液，通過空斑測定法測量病毒脫落。*指示p<0.05。

序列表簡述

seqidno:1顯示了人類ifn-β1a的核苷酸序列。seqidno:2顯示了人類ifn-β1a的氨基酸序列。seqidno:3顯示了人類ifn-β1b的核苷酸序列。seqidno:4顯示了人類ifn-β1b的氨基酸序列。ifn-β1b與人類ifn-β1a相同，除了在殘基17的半胱氨酸被絲氨酸替代。

發(fā)明詳述

如前文所述，本發(fā)明涉及ifn-β的新治療用途。具體地，例如，本發(fā)明涉及通過氣霧劑遞送至下呼吸道來治療被診斷為患有在流感樣疾病期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病的個體、特別是已經接納住院的那些患者的ifn-β的治療用途。

如上所述，之前已經提出干擾素用于預防或早期治療ili。相應地，已經提出干擾素在ili癥狀顯現之前或者在此類癥狀開始出現時使用。一般而言，已經將這些干擾素施用給上呼吸道，例如鼻咽。通常，用干擾素治療的起始在癥狀出現24小時內開始。

相比之下，我們已經發(fā)現，可以通過將干擾素-β藥劑氣霧劑化遞送至下呼吸道來治療患有ili所產生的并發(fā)癥、特別是患有下呼吸道疾病的已經住院的患者。通常，住院在癥狀首次出現之后48小時發(fā)生。

ifn-β的定義

如本文使用的，術語ifn-β將被理解為指保留天然ifn-β的生物活性并且優(yōu)選保留在肺中和具體是支氣管和/或肺泡上皮中存在的ifn-β的活性的ifn-β的任何形式或類似物。ifn-β可以與人類ifn-β1a(seqidno:2)或人類ifn-β1b(seqidno:4)的序列相同或者包括人類ifn-β1a(seqidno:2)或人類ifn-β1b(seqidno:4)的序列。ifn-β還指具有與seqidno:2或4的序列不同的氨基酸序列的變體多肽?？蛇x地，ifn-β可以是化學修飾的。ifn-β的變體可以是天然存在的變體，例如，由非人類物種表達的變體。而且，ifn-β的變體包括與seqidno:2或4不同但不一定是天然存在的序列。就seqidno:2或4的氨基酸序列的全長而言，基于氨基酸同一性，變體優(yōu)選與該序列至少80％同源。更優(yōu)選地，基于氨基酸同一性，多肽在整體序列上與seqidno:2或4的氨基酸序列至少85％或90％且更優(yōu)選至少95％、97％或99％同源。在40或更多、例如60、80、100、120、140或160或更多的連續(xù)氨基酸段上存在至少80％、例如至少85％、90％或95％的氨基酸同一性(“嚴格同源性(hardhomology)”)?？梢允褂帽绢I域已知的任何方法確定同源性。例如，uwgcg軟件包提供了bestfit程序，其可用于計算同源性，例如以其默認設置使用(devereux等人(1984)nucleicacidsresearch12,p387-395)?？墒褂胮ileup和blast算法來計算同源性或對齊序列(例如，鑒定相同殘基或相應序列(通?；谄淠J設置))，例如在altschuls.f.(1993)jmolevol36:290-300；altschul,s.f等人(1990)jmolbiol215:403-10中所描述的。用于進行blast分析的軟件可通過美國國家生物技術信息中心(http://www.ncbi.nhn.nih.gov/)公開獲得。該算法包括首先通過鑒定查詢序列中與數據庫序列中相同長度的字比對時匹配或滿足某一正值閾值得分t的長度w的短字來鑒定高得分序列對：(hsp)。t被稱為相鄰字得分閾(altschul等人，同上)。這些初始相鄰字匹配用作開始檢索以找到含有它們的hsp的種子。沿著每個序列的兩個方向延伸字匹配，只要累加比對得分可以增加。當如下時停止每個方向上的字匹配延伸：累加比對得分從其達到的最大值減少了量x；由于一個或多個負得分殘基比對的累積，累加得分達到0或以下；或者到達任一序列的末端。blast算法參數w、t和x決定比對的靈敏度和速度。blast程序使用11的字長(w)、50的blosum62得分矩陣(參見henikoff和henikoff(1992)proc.natl.acad.sclusa89:10915-10919)比對(b)、10的預期(e)、m＝5、n＝4和雙鏈對比作為默認值。blast算法進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析；參見例如karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787。由blast算法提供的相似性的一個量度是最小總和概率(p(n))，其提供了兩個核苷酸或氨基酸序列之間碰巧發(fā)生匹配的概率的指示。例如，如果在一個序列與另一個序列對比中最小總和概率小于約1、優(yōu)選小于約0.1、更優(yōu)選小于約0.01和最優(yōu)選小于約0.001，則認為第一序列與第二序列相似?？梢詫eqidno:1或2的氨基酸序列進行氨基酸取代，例如從1、2、3、4或5個至10、20或30個取代。例如，可以根據表1進行保守取代。第二列中同一單元格中的氨基酸和優(yōu)選第三列中同一行中的氨基酸可以相互取代：表1–保守氨基酸取代，非芳族的：非極性的：gapilv，極性、不帶電荷的：cstmnq，極性、帶電荷的：dehkr，芳族的：hfwy

表1-保守氨基酸取代

seqidno:1或2的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基可以可選地或額外地缺失?？梢匀笔?、2、3、4或5個至10、20或30個殘基或更多。ifn-β還包括上述序列的片段。此類片段保留ifn-β活性。片段長度可以是至少120或140個氨基酸。如下文更詳細描述的，此類片段可用于產生嵌合劑(chimericagent)。ifn-β包括含有seqidno:2或4的片段或部分的嵌合蛋白?？梢钥蛇x地或額外地向上述多肽添加一個或多個氨基酸?？梢栽趕eqidno:2或4的氨基酸序列或其多肽變體或片段的n端或c端設置延伸段。延伸段可以非常短，例如1至10個氨基酸長度?？蛇x地，延伸段可以更長。載體蛋白可以與上述氨基酸序列融合。因此，本發(fā)明可以使用含有上述多肽之一的融合蛋白。ifn-β還包括經過化學修飾的seqidno:2或4或其變體。許多側鏈修飾是本領域已知的，并且可對上述蛋白或多肽的側鏈進行側鏈修飾。例如，此類修飾包括糖基化，磷酸化，通過與乙醛反應、隨后用nabh4還原的還原性烷基化對氨基酸的修飾，用乙酰亞胺酸甲酯的脒化，或者用乙酸酐的酰化。修飾優(yōu)選是糖基化。ifn-β可以合成制備或者使用本領域已知的方法通過重組方式制備?？梢孕揎椀鞍缀投嚯牡陌被嵝蛄幸园翘烊淮嬖诘陌被峄蛘咴黾踊衔锏姆€(wěn)定性。當通過合成方式生成蛋白或肽時，可以在生成期間引入此類氨基酸。還可以在合成或重組生成之后修飾蛋白或肽。還可以使用d-氨基酸來生成ifn-β。在此類情況下，氨基酸將以c至n的方向以逆序列連接。這在本領域常規(guī)用于生成此類蛋白或肽?？梢酝ㄟ^從重組表達載體原位表達多肽而在細胞中生成ifn-β。表達載體任選載有誘導型啟動子以控制多肽表達。可以在重組表達之后通過任何蛋白液相色譜系統(tǒng)的純化之后，大規(guī)模生成ifn-β或其類似物。優(yōu)選的蛋白液相色譜系統(tǒng)包括fplc、akta系統(tǒng)、bio-cad系統(tǒng)、bio-radbiologic系統(tǒng)和gilsonhplc系統(tǒng)。本發(fā)明可使用ifn-β或其類似物的商業(yè)途徑可獲得的形式。實例包括和

增加ifn-β表達的藥劑

本發(fā)明還可以涉及使用增加ifn-β在肺或優(yōu)選在支氣管和/或肺泡上皮中內源性表達的藥劑。該藥劑可以直接作用于ifn-β基因的啟動子或其他調控序列。此類藥劑可作用以減少ifn-β啟動子的組成型沉默?？蛇x地，該藥劑可以通過在細胞表面的受體作用來刺激細胞產生內源性ifn-β。本發(fā)明關注的增加ifn-β內源性表達的藥劑包括但不限于聚(肌苷酸)-聚(胞苷酸)(聚(ic))、ana773、培哚普利、bl-20803、替洛隆、abmp、drb、阿的平、10-羧基-9吖啶酮、cp-28888、溴匹立明和咪喹莫特。

本發(fā)明還涉及使用能夠表達ifn-β的多核苷酸或者增加ifn-β在肺氣道中內源性表達的藥劑。這種多核苷酸可以優(yōu)選是能夠指導ifn-β表達的載體或誘導支氣管和/或肺泡上皮中的ifn-β的藥劑形式。生成的ifn-β或藥劑則可以具有治療效應(“基因療法”)。多核苷酸可以編碼上述ifn-β的形式的任何一種，包括其變體、片段和嵌合蛋白。編碼ifn-β的多核苷酸可以包括人類序列(seqidno:1或3)或天然存在的序列變體，例如，由非人類物種表達的變體。而且，編碼ifn-β的多核苷酸包括與seqidno:1或3不同但是不一定是天然存在的序列。就seqidno:1或3的氨基酸序列的全長而言，基于核苷酸同一性，變體優(yōu)選與該序列至少80％同源。更優(yōu)選地，基于核苷酸同一性，多核苷酸在整體序列上與seqidno:1或3的核苷酸至少85％或90％且更優(yōu)選至少95％、97％或99％同源。在40或更多、例如60、80、100、120、140或160或更多的連續(xù)核苷酸段上存在至少80％、例如至少85％、90％或95％的核苷酸同一性(“嚴格同源性”)。可以如上文討論的確定同源性。多核苷酸可以包括dna或rna，但優(yōu)選包括dna。它們還可以是在其中包含合成或修飾核苷酸的多核苷酸。許多不同類型的多核苷酸修飾是本領域已知的。這些包括磷酸甲酯和硫代磷酸甲酯骨架，在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或聚賴氨酸鏈。對于本發(fā)明目的，要理解，本文描述的多核苷酸可以通過本領域可用的任何方法來修飾?？梢灾亟M地、合成地或通過本領域技術人員可用的任何方式生成多核苷酸，例如dna多核苷酸。它們還可以通過標準技術來克隆。通常以分離和/或純化的形式提供多核苷酸。一般使用重組方式，例如使用pcr(聚合酶鏈式反應)克隆技術，來生成多核苷酸。這包括為需要被克隆的所需基因的區(qū)域制備一對引物(例如，約15-30個核苷酸的引物)，使所述引物與從適合細胞獲得的dna形成接觸，在導致所需區(qū)域擴增的條件下進行聚合酶鏈式反應，分離擴增的片段(例如，通過在瓊脂糖凝膠上純化反應混合物)并回收擴增的dna。可以將引物設計為含有適當的限制酶識別位點，使得可以將擴增的dna克隆進適合的克隆載體。盡管一般而言本文提到的技術是本領域公知的，可以具體參考sambrook等人,1989。如前文所述，優(yōu)選地，多核苷酸在表達載體中使用，多核苷酸在表達載體中與控制序列可操作連接，所述表達載體能夠提供編碼序列在人肺氣道中的表達。根據本發(fā)明使用的表達載體可以是常規(guī)用于基因療法的任何類型的載體。它可以是作為裸dna或與一個或多個陽離子兩親化合物(例如，一個或多個陽離子脂質)復合(例如，以dna/脂質體形式)施用的質粒表達載體?？蛇x地，可以采用病毒載體。之前已經描述了用于在人肺氣道中表達治療性蛋白的載體。例如，公布的國際申請wo01/91800(isisinnovationlimited)描述了為了這種目的的表達載體，包括人類泛素c啟動子或其功能類似物。已經顯示，人類泛素c啟動子能夠在小鼠氣道中產生數周的高水平蛋白表達，因此被建議作為偏好啟動子，用于許多呼吸道疾病的氣道基因療法。chow等人.proc.natl.acad.sci.usa1997；94:14695-14700中還描述了用于指導氣道上皮中轉基因表達的表達載體的實例。例如，此類表達載體可以經氣道施用至鼻腔或氣管。

可以適合氣道遞送的藥物或藥物組合物施用ifn-β、藥劑或多核苷酸，所述藥物或藥物組合物通常還包含藥學可接受的賦形劑。此類“賦形劑”一般指基本上惰性的材料，其是無毒的，并且不以有害的方式與組合物的其他組分相互作用。藥學可接受的賦形劑包括但不限于液體，例如水、鹽水、聚乙二醇、透明質酸、甘油和乙醇。其中可以包括藥學可接受的鹽，例如無機酸鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機酸鹽，例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。盡管不要求，但是還優(yōu)選的是，包含治療劑的組合物或藥物將含有用作穩(wěn)定劑的藥學可接受的載體，特別是用于肽、蛋白、多核苷酸或其他類似物質的穩(wěn)定劑。還用作肽的穩(wěn)定劑的適合載體的實例包括但不限于藥物級的右旋糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等。其他適合的載體包括但也不限于淀粉、纖維素、磷酸鈉或磷酸鈣、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(peg)及其組合。還可能有用的是采用帶電脂質和/或去污劑。適合的帶電脂質包括但不限于磷脂酰膽堿(卵磷脂)等。去污劑通常是非離子的、陰離子的、陽離子的或兩性的表面活性劑。適合的表面活性劑的實例包括例如和表面活性劑(unioncarbidechemicalsanaplastics,danbury,ct)，聚氧乙烯失水山梨糖醇，例如表面活性劑(atlaschemicalindustries,wilmington,de)，聚氧乙烯醚，例如brij，藥學可接受的脂肪酸酯，例如硫酸月桂酯及其鹽(sds)和類似材料。藥學可接受賦形劑、載體、穩(wěn)定劑和其他輔助物質的深入討論可參見remingtonspharmaceuticalsciences(mackpub.co.,n.j.1991)。

例如，如美國專利號6,030,609所描述的，可以通過將凍干的ifn-β溶解于藥學可接受的媒介物例如無菌蒸餾水或無菌生理鹽水來配制適合氣道遞送ifn-β的組合物，任選添加一種或多種載體、穩(wěn)定劑、表面活性劑或用于增強ifn-β活性劑效力的其他物質。

適合的組合物具有5至8、更優(yōu)選5.5至7.5的ph。優(yōu)選地，例如使用檸檬酸鹽緩沖劑來緩沖組合物。

基于us6,030,609中公開的配方的rentschler組合物具有6.5的ph和290mosm/kg的滲透壓。優(yōu)選作為在一次性玻璃注射器中提供的無菌、澄清且無色的即用型噴霧水溶液來提供該組合物。

除了活性成分以外，組合物優(yōu)選包含緩沖系統(tǒng)以使ph維持在5和8之間，更優(yōu)選5.5和7.5之間，特別是6.5。組合物還優(yōu)選包含抗氧化劑，例如dl-甲硫氨酸。

優(yōu)選的組合物包含：

可以借助能夠將活性成分的細顆粒遞送至下呼吸道或氣道的吸入裝置方便地將包含治療有效量的本文描述的ifn-β、藥劑或多核苷酸的組合物遞送至肺氣道。通常，活性成分顆粒將具有1-10微米的質量中值直徑。適合的吸入裝置包括干粉吸入(dpi)裝置、加壓計量劑量吸入器(pmdi)和氣霧劑噴霧器。

通常，吸入裝置將產生具有如使用malvernmasterizers確定的粒度的氣霧劑，具有1-10微米、優(yōu)選3-8微米的質量中值直徑，其中直徑低于5微米的質量百分比是25-80％、優(yōu)選30-65％。適合的噴霧器是i-neb裝置，一種由philipsrespironics生產的ce標志的噴霧器。

適合的有效量可以通過適合的臨床測試來確定，并且會隨著例如所施用或誘導的ifn-β的活性而改變。例如，可以微克量施用ifn-β、藥劑或多核苷酸。

以與劑型相容的方式和以有效實現預期效應的量將它們施用給待治療的受治療者。根據待治療的受治療者，每劑待施用的量可以是0.1μg至500μg，例如1至50μg。

治療通常持續(xù)5-7天，如果癥狀持續(xù)則可以繼續(xù)至14天。治療可以每隔一天一次至一天數次提供。優(yōu)選地，治療以每天一次提供。

ifn-β、藥劑或多核苷酸可以單獨施用或者與另一治療性化合物同時、順序或分別地聯(lián)合施用。具體地，ifn-β、藥劑或多核苷酸可以與用于治療呼吸道疾病的治療性化合物或抗病毒劑聯(lián)合施用給個體。ifn-β、藥劑或多核苷酸和其他治療性化合物可以配制為相同或不同的組合物。

在一個實施方案中，ifn-β、藥劑或多核苷酸與吸入型皮質類固醇聯(lián)合施用給患有哮喘的個體。

在另一實施方案中，ifn-β、藥劑或多核苷酸可以與吸入型神經氨酸酶抑制劑同時、順序或分別施用。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了用于治療經診斷患有在流感樣疾病期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病(或癥狀)的個體的產品，包括用于同時、分別或順序的下呼吸道施用的(i)選自(a)ifn-β、(b)增加ifn-β表達的藥劑和(c)能夠表達(a)或(b)的多核苷酸的第一藥劑和(ii)吸入型神經氨酸酶抑制劑。優(yōu)選地，這種產品將提供ifn-β與吸入型神經氨酸酶抑制劑例如扎那米韋的同時、分別或順序施用。例如，上述第一藥劑和吸入型神經氨酸酶抑制劑可以適合氣霧劑遞送至氣道的單一藥物組合物的形式提供，例如，所述氣霧劑遞送借助干粉吸入器、加壓計量劑量吸入器或氣霧劑噴霧器。

可選地，ifn-β、藥劑或多核苷酸可以與口服神經氨酸酶抑制劑例如奧塞米韋同時、順序或分別地施用。

可選地，ifn-β、藥劑或多核苷酸可以與全身施用的神經氨酸酶抑制劑例如帕拉米韋同時、順序或分別地施用。

在另一實施方案中，ifn-β、藥劑或多核苷酸可以與吸入型流感病毒附著抑制劑同時、順序或分別地施用。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了用于治療經診斷患有在流感樣疾病期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病(或癥狀)的個體的產品，包括用于同時、分別或順序的下呼吸道施用的(i)選自(a)ifn-β、(b)增加ifn-β表達的藥劑和(c)能夠表達(a)或(b)的多核苷酸的第一藥劑和(ii)吸入型流感病毒附著抑制劑。優(yōu)選地，這種產品將提供ifn-β和流感病毒附著抑制劑例如唾液酸酶融合蛋白das181的同時、分別或順序施用。例如，上述第一藥劑和吸入型流感病毒附著抑制劑可以適合氣霧劑遞送至氣道的單一藥物組合物的形式提供。

在另一個實施方案中，ifn-β、藥劑或多核苷酸可以與抗細菌抗生素同時、順序或分別地施用。優(yōu)選地，所述抗細菌抗生素通過吸入施用。

在另一個實施方案中，ifn-β、藥劑或多核苷酸可以與抗真菌抗生素同時、順序或分別地施用。優(yōu)選地，所述抗真菌抗生素通過吸入施用。

小于5歲的兒童但特別是小于2歲的兒童、65歲年齡和更老的成人、懷孕婦女和患有并存病(例如，慢性肺病、神經系統(tǒng)和神經發(fā)育病癥、心臟病、血液疾患、內分泌紊亂、腎臟疾患、肝臟疾患、代謝紊亂、惡性疾病和歸因于疾病或藥物治療的免疫系統(tǒng)削弱)的那些人處于發(fā)展并發(fā)癥的最大風險，導致住院并且具有最差的結果，并且代表了本發(fā)明的特定目標群體。例如年齡超過60歲的老年人個體是特定的目標群體，罹患哮喘和/或copd的患者也是。

之前從未暴露于ili的患者也是風險群體。

實施例1

以下實施例中示例說明了外源性ifn-β在確立的下呼吸道感染的體外模型中抑制a型流感病毒感染的能力。

概要

在流感樣疾病(ili)期間或之后發(fā)展的下呼吸道疾病(或癥狀)常常由于病毒感染從上呼吸道蔓延至下呼吸道而被加劇。而且，延長的癥狀和住院患者延長的住院時間與下氣道中持續(xù)的病毒脫落有關。使用人類肺支氣管上皮細胞(人類中流感復制的重要部位)，我們開發(fā)了確立的下呼吸道a型流感病毒感染的模型。考察了ifn-β在該模型中的效應。

方法

細胞培養(yǎng)和感染方案

在含有glutamax(invitrogen)、10％胎牛血清(fbs)(invitrogen)、青霉素(50u/ml)和鏈霉素(50μg/ml)(invitrogen)的最小必需培養(yǎng)基(mem)中培養(yǎng)人肺支氣管上皮(hbe)細胞。將hbe細胞以1.5x10⁵/孔、傳代41-49鋪板于24孔板。大約60-70％匯合時，在減少血清的培養(yǎng)基(含有glutamax(invitrogen)和0.75-1％fbs(invitrogen)的mem)中培養(yǎng)細胞24小時。在37℃下用活化的流感病毒株(a型流感病毒/wsn/33(h1n1)(retroscreen))以0.0001moi感染細胞。一小時之后，通過洗滌去除未結合的病毒。添加減少血清的培養(yǎng)基并在37℃下培養(yǎng)細胞另外4天。在病毒感染后48小時，用1000iu/ml的人類ifn-β1a(rentschler)處理細胞。開始ifn-β治療后，每24小時重復劑量。

確定流感陽性細胞百分比的流式細胞術

在感染后24、48、72和96小時收集細胞培養(yǎng)基并在-80℃貯存。在感染后24、48、72和96小時，用胰蛋白酶處理細胞，計數，并在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中洗滌。取出多達2x10⁵細胞用于流式細胞術分析。將細胞以400g離心并棄掉上清液。在二甲亞砜(dmso)(500μl)中重構活/死細胞染料(molecularprobes)并在pbs中1:100稀釋。將稀釋的活/死細胞染料(100μl)與細胞在室溫下孵育30分鐘。將細胞在pbs中洗滌，以400g離心并棄掉上清液。每管添加250μlcytofix/cytoperm(bdbiosciences)，使細胞在4℃下靜置20分鐘。通過在500g離心，用2mlperm/wash(bdbiosciences)溶液洗滌細胞兩次。第二次洗滌之后，將細胞重懸于100μlperm/wash溶液并在室溫下靜置15分鐘。將抗a型流感病毒基質蛋白抗體(serotec)在perm/wash溶液中稀釋至2.5μg/ml，并向細胞添加100μl，在室溫下持續(xù)30分鐘。通過在500g離心，用2mlperm/wash溶液洗滌細胞兩次。在perm/wash溶液中稀釋抗小鼠igg-fitc(sigma)至5μg/ml，并向細胞添加100μl，在室溫下避光持續(xù)30分鐘。通過在500g離心，用2mlperm/wash溶液洗滌細胞兩次。在perm/wash溶液中重懸細胞并使用facscalibur(bdbiosciences)和cellquestpro軟件通過流式細胞術分析。隨后使用winmdi軟件分析數據。

確定病毒脫落的空斑測定法

在含有glutamax(invitrogen)、10％fbs(invitrogen)、非必需氨基酸(invitrogen)和青霉素/鏈霉素(invitrogen)的mem中培養(yǎng)madindarby犬腎(mdck)細胞。將mdck細胞以1.5x10⁵/孔、傳代25-30鋪板于12孔板。達到100％匯合時，用pbs洗滌細胞兩次。在無血清培養(yǎng)基(dmem(invitrogen)、青霉素/鏈霉素(invitrogen)、l-谷氨酰胺(invitrogen)、非必需氨基酸(invitrogen)和丙酮酸鈉(invitrogen))中稀釋在感染實驗期間收集的細胞培養(yǎng)基，以產生1:10至1:10⁶之間十倍稀釋的稀釋范圍。向雙重孔添加稀釋的細胞培養(yǎng)基(200μl)。在37℃下孵育孔板1小時。吸出病毒并用pbs洗滌細胞。制備覆蓋層培養(yǎng)基(100ml的10倍濃縮的mem(invitrogen)、20ml7.5％碳酸氫鈉(sigma)、10ml1mhepes(fluka)、28ml7.5％牛血清白蛋白(bsa)級分v(sigma)、5ml1％deae-葡聚糖(sigma)、20ml青霉素/鏈霉素(invitrogen)、10ml200mm谷氨酰胺(invitrogen)、507mld.h2o)，并添加17.5ml至12.5μl1mg/ml胰蛋白酶和7.5mlavicel懸液(4.8gavicel(fmcbiopolymer)于186mld.h2o中)，所述胰蛋白酶經l-(甲苯磺酰氨基-2-苯基)乙基氯甲基酮處理(trtpck胰蛋白酶)(worthingtonbiochemicalcorp.)。通過翻轉混合覆蓋層培養(yǎng)基并每孔添加1ml。在無移動或搖動下，將孔板孵育2天。吸出覆蓋層培養(yǎng)基，并用pbs洗滌細胞兩次。添加結晶紫溶液(0.5ml)(0.65g結晶紫(sigma)、25ml甲醛(sigma)、25ml100％乙醇(sigma)、450ml1xpbs(5dulapbs片(sigma)+500mld.h2o))，室溫下持續(xù)30分鐘。去除結晶紫，將孔板在水中洗滌。使孔板干燥并計數空斑。

進行了三次獨立實驗。提供了來自第一實驗的數據和匯總數據。

數據分析

使用graphpadprism軟件分析數據。

結果

在該模型中，流式細胞術分析表明，5％至40％的細胞在48至96小時之間被感染(參考圖1a和1b)，這類似于在峰值感染的臨床環(huán)境中報道的高效感染細胞水平(baccam等人.(2006)journalofvirology,80:7590-7599)。相應地，該時期還與我們模型中病毒脫落的最高水平相關(圖2a和2b)。

模擬確立感染的治療，在感染后48小時用ifn-β治療細胞，導致感染細胞比例和病毒脫落的大大減少(圖1a、1b、2a和2b)。認為超過10倍的病毒載量的減少是臨床上相關的(barnett等人.(2000)antimicrob.agentschemother44:78-87)。

結論

這些結果顯示，ifn-β治療具有改變肺中確立的流感病毒感染過程并因此減少在確立的流感樣疾病(ili)期間或之后發(fā)展的呼吸道疾病的潛力。因為老年患者和罹患哮喘和/或copd的那些患者很可能在需要時難以產生ifn-β，本文描述的用途和方法對于這樣的易感群體特別有用。

體內研究：

引言

流感樣疾病的主要并發(fā)癥是在病毒蔓延至下呼吸道之后發(fā)展的病毒性肺炎。

人類ifn-β在其生物學活性方面具有高度的物種特異性。食蟹獼猴是適合研究人類ifn-β的效應的物種。已經顯示人類ifn-β將食蟹獼猴血細胞和人類血細胞中的干擾素敏感性抗病毒基因粘液病毒抗性蛋白1(mxa)(圖3)和2’-5’寡腺苷酸合成酶(2’-5’oas)(圖4)上調至相同程度。而且，在體外研究中，人類ifn-β保護食蟹獼猴細胞免受流感病毒感染(圖5)。

使用食蟹獼猴開發(fā)了針對高度致病性a型流感病毒(h5n1)(rimmelzwaan等人.(2001)jvirol.75:6687-91)和2009年流行性a型流感病毒(h1n1)(herfst等人.(2010)vet.pathol.47:1040-7)的下呼吸道疾病的臨床前模型。這些模型已經預測了神經氨酸酶抑制劑在感染之前施用時對抗流感病毒的臨床效力。

本研究考察了肺遞送的ifn-β在流感病毒誘導的下呼吸道疾病的類似食蟹獼猴模型中的效應。攻擊病毒株是a/印度尼西亞/5/05(h5n1)和a/荷蘭/602/2009(流行性h1n1)，已經顯示兩者在下呼吸道中復制并引起顯著的肺病變(herfst等人.(2010)vet.pathol.47:1040-7；rimmelzwaan等人.(2001)jvirol.75:6687-91)。

本研究包括兩個階段。在第一階段，通過顯示在通過支氣管-肺泡灌洗液(bal)獲得的肺細胞中上調ifn-β依賴性抗病毒標志物，建立了吸入型ifn-β的成功遞送。臨床研究中的類似數據支持了吸入型ifn-β作為抗病毒療法的進一步發(fā)展。在第二階段，考察了使用肺遞送的ifn-β的預防性和治療性治療對流感引起的肺病變和肺病毒載量的效應。

第1階段：ifn-β成功遞送至肺的證實

簡言之，通過噴霧器將溶液形式的ifn-β兩次施用至食蟹獼猴的肺。在每劑之前和之后收集bal。使用定量pcr方法確定ifn-β依賴性抗病毒標志物(mxa，2’-5’oas和干擾素γ誘導的蛋白10kda(ip-10)在bal細胞中的基因表達。將上調水平與臨床研究中產生的數據相比較，以選擇下一階段的劑量。研究方案和方法的更多細節(jié)在下文描述。

在施用吸入型ifn-β之前7天，年齡大約3歲的五只雄性食蟹獼猴用氯胺酮-dormitor麻醉，收集血液和支氣管-肺泡灌洗液(bal)并測量其體重。bal涉及用10ml磷酸鹽緩沖鹽水沖洗肺，預想回收大約5ml。在每次，將bal樣品分成上清液和細胞級分。在rlt緩沖液(qiagen)中溶解細胞級分并使用定量pcr方法分析ifn-β依賴性抗病毒生物標志物mxa、2’-5’oas和ip-10。

在第0天，在麻醉下，收集血液，測量體重，并將3ml吸入型ifn-β(rentschler)遞送至每只獼猴。使用與小兒面罩(philipsrespironics，零件號hs81110eu-001)偶聯(lián)的i-neb裝置(philipsrespironics)通過吸入來遞送ifn-β噴霧溶液。設計i-neb裝置程序以在開啟時產生連續(xù)的氣霧劑流。

在第1天，在麻醉下，收集血液和bal并測量體重。

在第8天，在麻醉下，收集血液，測量體重，并將1.5ml或4.5ml吸入型ifn-β遞送至每只獼猴。選擇的ifn-β的劑量將取決于第1劑獲得的結果。

在第9天，在麻醉下，收集血液和bal并測量體重。

第2階段：使用肺遞送的ifn-β的預防性和治療性治療對流感引起的肺病變和肺病毒載量的效應

本研究第2階段包括三個治療組：第1組接受安慰劑；第2組在用攻擊病毒感染之前24小時接受吸入型ifn-β治療，并且隨后每天用ifn-β治療；第3組在用攻擊病毒感染之后4小時接受吸入型ifn-β治療，并且隨后每天用ifn-β治療。治療組在感染后4小時施用，因為在該模型中，相對高劑量的病毒被直接施用至下呼吸道以模擬確立的下氣道疾病。樣品大小計算指示，要求每組9只動物以觀察治療動物和對照(未治療)動物之間病毒滴度的1.5對數差異的治療效應。基于使用神經氨酸酶抑制劑的臨床研究結果，認為這是臨床上顯著的(barnett等人.(2000)antimicrob.agentschemother.44:78-87)。下面顯示了研究方案：

由于研究中包括的動物數目，使用了區(qū)塊設計。分三個區(qū)塊進行研究，每個區(qū)塊由9只動物組成，從每個治療組取三只動物。

病毒攻擊之前14天，在被證實為循環(huán)流感病毒血清陰性的9只食蟹獼猴的腹腔中配備預先程序化的溫度傳感器，并在氯胺酮和dormitor麻醉下收集血液。

在第-1天，在從手術完全恢復之后，所有動物被麻醉、稱重并收集樣品(用于獲得血清的全血和鼻/喉拭子)。在麻醉下給屬于組1和組2的動物施用噴霧型安慰劑或ifn-β(以第1階段確定的劑量)。

在第0天，組1和組2的動物用如上所述的噴霧型安慰劑或ifn-β治療。然后用流感病毒(10⁵tcid50h5n1或10⁷tcid50h1n1)氣管內攻擊所有動物。氣管內攻擊之后4小時，組3動物被施用如上所述的噴霧型ifn-β。

在第1、2、3和4天，所有動物被麻醉、稱重并收集樣品(用于獲得血清的全血和鼻/喉拭子)，并用如上所述的噴霧型安慰劑或ifn-β治療。

在攻擊后5天，所有動物被麻醉、稱重并通過放血而安樂死。進行全身宏觀病理(fullgrosspathology)，檢查所有的主要器官并描述肺病變。從所有動物收集樣品，包括：用于獲得血清的全血、鼻/喉拭子和來自右肺的組織。整個實驗收集的拭子和右肺切片經受定量pcr和病毒滴定以確定病毒載量。左肺用10％福爾馬林膨脹用于隨后的組織病理學評價。

主要終點是肺病毒載量和肺病理評分。每日采集的喉拭子會給出病毒感染的時間過程的指示。陽性數據，即特別是在用ifn-β治療性治療之后肺病毒載量或肺病變的減少，將支持用于治療由流感引起的下呼吸道疾病的吸入型ifn-β的開發(fā)。

序列表

<110>希納爾根研究有限公司

<120>流感樣疾病的療法

<130>gmw/p42062wo

<140>pct/gb2011/050480

<141>2011-03-10

<150>gb1004144.0

<141>2010-03-12

<150>gb1008114.9

<151>2010-05-17

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>757

<212>dna

<213>智人(homosapiens)

<220>

<221>cds

<222>(64)..(564)

<400>1

atgaccaacaagtgtctcctccaaattgctctcctgttgtgcttctccactacagctctt60

tccatgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaatttt108

metsertyrasnleuleuglypheleuglnargserserasnphe

151015

cagtgtcagaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatattgc156

glncysglnlysleuleutrpglnleuasnglyargleuglutyrcys

202530

ctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctg204

leulysaspargmetasnpheaspileproglugluilelysglnleu

354045

cagcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctc252

glnglnpheglnlysgluaspalaalaleuthriletyrglumetleu

505560

cagaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctgg300

glnasnilephealailepheargglnaspserserserthrglytrp

657075

aatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagata348

asngluthrilevalgluasnleuleualaasnvaltyrhisglnile

80859095

aaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagatttt396

asnhisleulysthrvalleugluglulysleuglulysgluaspphe

100105110

accaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatggg444

thrargglylysleumetserserleuhisleulysargtyrtyrgly

115120125

aggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctgg492

argileleuhistyrleulysalalysglutyrserhiscysalatrp

130135140

accatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacaga540

thrilevalargvalgluileleuargasnphetyrpheileasnarg

145150155

cttacaggttacctccgaaactgaagatctcctagcctgtccctctgggactgg594

leuthrglytyrleuargasn

160165

acaattgcttcaagcattcttcaaccagcagatgctgtttaagtgactgatggctaatgt654

actgcaaatgaaaggacactagaagattttgaaatttttattaaattatgagttattttt714

atttatttaaattttattttggaaaataaattatttttggtgc757

<210>2

<211>166

<212>prt

<213>智人

<400>2

metsertyrasnleuleuglypheleuglnargserserasnphegln

151015

cysglnlysleuleutrpglnleuasnglyargleuglutyrcysleu

202530

lysaspargmetasnpheaspileproglugluilelysglnleugln

354045

glnpheglnlysgluaspalaalaleuthriletyrglumetleugln

505560

asnilephealailepheargglnaspserserserthrglytrpasn

65707580

gluthrilevalgluasnleuleualaasnvaltyrhisglnileasn

859095

hisleulysthrvalleugluglulysleuglulysgluaspphethr

100105110

argglylysleumetserserleuhisleulysargtyrtyrglyarg

115120125

ileleuhistyrleulysalalysglutyrserhiscysalatrpthr

130135140

ilevalargvalgluileleuargasnphetyrpheileasnargleu

145150155160

thrglytyrleuargasn

165

<210>3

<211>720

<212>dna

<213>智人

<220>

<221>cds

<222>(64)..(564)

<400>3

atgaccaacaagtgtctcctccaaattgctctcctgttgtgcttctccactacagctctt60

tccatgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaatttt108

metsertyrasnleuleuglypheleuglnargserserasnphe

151015

cagagtcagaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatattgc156

glnserglnlysleuleutrpglnleuasnglyargleuglutyrcys

202530

ctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctg204

leulysaspargmetasnpheaspileproglugluilelysglnleu

354045

cagcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctc252

glnglnpheglnlysgluaspalaalaleuthriletyrglumetleu

505560

cagaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctgg300

glnasnilephealailepheargglnaspserserserthrglytrp

657075

aatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagata348

asngluthrilevalgluasnleuleualaasnvaltyrhisglnile

80859095

aaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagatttt396

asnhisleulysthrvalleugluglulysleuglulysgluaspphe

100105110

accaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatggg444

thrargglylysleumetserserleuhisleulysargtyrtyrgly

115120125

aggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctgg492

argileleuhistyrleulysalalysglutyrserhiscysalatrp

130135140

accatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacaga540

thrilevalargvalgluileleuargasnphetyrpheileasnarg

145150155

cttacaggttacctccgaaactgaagatctcctagcctgtccctctgggactgg594

leuthrglytyrleuargasn

160165

acaattgcttcaagcattcttcaaccagcagatgctgtttaagtgactgatggctaatgt654

actgcaaatgaaaggacactagaagattttgaaatttttattaaattatgagttattttt714

atttat720

<210>4

<211>166

<212>prt

<213>智人

<400>4

metsertyrasnleuleuglypheleuglnargserserasnphegln

151015

serglnlysleuleutrpglnleuasnglyargleuglutyrcysleu

202530

lysaspargmetasnpheaspileproglugluilelysglnleugln

354045

glnpheglnlysgluaspalaalaleuthriletyrglumetleugln

505560

asnilephealailepheargglnaspserserserthrglytrpasn

65707580

gluthrilevalgluasnleuleualaasnvaltyrhisglnileasn

859095

hisleulysthrvalleugluglulysleuglulysgluaspphethr

100105110

argglylysleumetserserleuhisleulysargtyrtyrglyarg

115120125

ileleuhistyrleulysalalysglutyrserhiscysalatrpthr

130135140

ilevalargvalgluileleuargasnphetyrpheileasnargleu

145150155160

thrglytyrleuargasn

165