本發(fā)明涉及一種心肌內(nèi)源性的非編碼小RNA保護心臟的用途，尤其涉及miR-378抑制心肌肥厚和心肌纖維化，并診斷心力衰竭的用途。

背景技術(shù)：

心血管疾病是當(dāng)今人類健康第一殺手，在中國，心血管病患病率處于持續(xù)上升階段。心肌重構(gòu)是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病及死亡率升高的獨立危險因素?？刂菩募≈貥?gòu)的發(fā)生發(fā)展，是防治心力衰竭發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是預(yù)防和治療心血管疾病的醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的重要任務(wù)之一。

心肌重構(gòu)是心臟功能從代償期向失代償期演變的關(guān)鍵時期，也是心臟結(jié)構(gòu)從可逆向不可逆發(fā)展的關(guān)鍵階段，是心功能受損并發(fā)生心力衰竭的病理生理基礎(chǔ)。心肌重構(gòu)通常表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)膠原沉積和纖維化、心肌細(xì)胞的凋亡與壞死，最終的結(jié)果是心臟的病理性增大、心肌收縮力下降，心功能失代償，即心力衰竭。多種心血管疾病包括高血壓、心肌梗死、心臟瓣膜疾病等都會導(dǎo)致心肌重構(gòu)的發(fā)生，它是心血管疾病的一種綜合性表現(xiàn)。當(dāng)心臟在損傷因素的刺激下，心肌內(nèi)源性的保護因子會被激活，發(fā)揮抗心肌重構(gòu)作用。尋找這些保護因子及作用途徑，有助于我們發(fā)現(xiàn)心臟疾病治療的有效藥物靶點，也有助于我們發(fā)現(xiàn)診斷心臟疾病發(fā)生的生物標(biāo)志物。

MicroRNA(簡稱miRNA)是一種廣泛存在于真核生物中，長度約為21nt的內(nèi)源單鏈小分子RNA，屬于非編碼RNA。作為一種基因表達的調(diào)控因子，miRNA可以參加很多重要的生理過程，它們疾病中重要作用越來越受到人們的關(guān)注。許多研究表明miRNA對于維持心臟正常的生理功能具有重要作用，同時當(dāng)其表達異常時與很多心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)。

目前，很多的miRNA作為人類疾病的生物標(biāo)志物和治療靶點被相繼發(fā)現(xiàn)，但在心肌肥厚和心肌纖維化相關(guān)疾病中的miRNA發(fā)現(xiàn)甚少，其發(fā)揮的生物學(xué)作用及對心肌病變的診斷價值仍需要科研人員去挖掘，進而研發(fā)針對這些靶點的臨床藥物及診斷試劑，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

目前有關(guān)抗心肌重構(gòu)，包括心肌肥厚、心肌纖維化的心肌內(nèi)源miRNA研究甚少，而其重要的生物學(xué)作用和治療疾病的靶點有待發(fā)掘。miRNA作為生物體的非編碼小片段RNA較傳統(tǒng)的分子標(biāo)記物在疾病診斷中具有的優(yōu)勢包括其具靈敏性、發(fā)病不同階段的表達特異性、穩(wěn)定性、易檢測性等特點，是較理想的疾病診斷標(biāo)志物。然而目前在心力衰竭以及心衰發(fā)生不同階段所開發(fā)出來的miRNA分子診斷試劑仍處于起步階段，所發(fā)現(xiàn)的與心衰發(fā)生相關(guān)的血清miRNA的數(shù)量極其有限，發(fā)現(xiàn)新的心衰診斷標(biāo)志物對于心臟疾病的預(yù)防和治療十分重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于本技術(shù)領(lǐng)域中存在的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種miRNA在預(yù)防或治療心肌肥厚、心肌纖維化中的應(yīng)用；其中，所述miRNA具體是指miR-378，其序列為：5’-CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU-3’(SEQ No.1)，本發(fā)明提供了miR-378在制備預(yù)防或治療心肌肥厚、心肌纖維化的藥物或試劑盒中的用途，并進一步提供了miR-378作為心力衰竭生物標(biāo)志物的用途。

本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)miR-378在心肌肥厚和肥大的心肌細(xì)胞中顯著下調(diào)。miR-378在心肌組織中高表達，并且在心肌細(xì)胞中特異性表達。在動物水平，利用化學(xué)修飾的miR-378模擬物和抑制劑通過靜脈注射的方式分別干預(yù)肥厚刺激的野生C57b/L6小鼠，發(fā)現(xiàn)miR-378可以顯著抑制心肌肥厚和心肌纖維化，miR-378基因敲除小鼠在肥厚因素刺激下對于野生型小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的心肌重構(gòu)，即加重的肥大表現(xiàn)及纖維化程度；在細(xì)胞水平，心肌細(xì)胞過表達miR-378能顯著抑制心肌細(xì)胞肥大，心肌成纖維細(xì)胞過表達miR-378能顯著抑制細(xì)胞的纖維化反應(yīng)。

進一步，本發(fā)明還提供了miR-378模擬物/合成的miR-378核酸序列在制備預(yù)防或治療心肌肥厚、心肌纖維化的藥物或試劑盒中的用途，優(yōu)選地，所述miR-378模擬物/合成的miR-378核酸序列經(jīng)過化學(xué)修飾，如與膽固醇、納米顆粒、脂質(zhì)體等修飾連接。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述miR-378模擬物在反義鏈3’端進行膽固醇修飾，5’端兩個硫代骨架修飾，3’端四個硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾。

進一步，所述預(yù)防或治療心肌肥厚、心肌纖維化的藥物通過靜脈或肌肉注射等方式，對心肌肥厚和心肌纖維化等心臟疾病進行治療。

本發(fā)明還提供了與人類心力衰竭發(fā)生發(fā)展相關(guān)的血液miRNA標(biāo)志物在制備診斷輕度和重度心力衰竭的試劑盒中的應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)心衰患者血清中miR-378表達水平對比健康對照組顯著升高，并且輕度心衰患者(LVEF>45％)的血清中miR-378的表達水平要高于重度心衰患者(LVEF<45％)組。因此，miR-378還可以作為臨床診斷心衰發(fā)生不同階段的分子標(biāo)志物。

進一步，miR-378還可以用于制備診斷心力衰竭發(fā)生及疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)的分子診斷試劑盒。

本發(fā)明具有以下有益技術(shù)效果：

miR-378通過抑制心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化對心臟具有抗心肌重構(gòu)的保護作用，對許多心臟疾病具有潛在的預(yù)防和治療價值。

血清miRNA是一種新型生物標(biāo)志物，具有靈敏性、發(fā)病不同階段的表達特異性、穩(wěn)定性、易檢測性等特點，能顯著提高疾病診斷的敏感性和特異性。miR-378有助于心力衰竭的輔助診斷，同時由于其在輕度和重度心力衰竭患者血液中的表達差異性，也有助于反映心力衰竭患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及時采取更具個性化的防治方案提供支持。

以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、產(chǎn)生的技術(shù)效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1所示為，小鼠使用主動脈縮窄方法(TAC)構(gòu)建小鼠壓力超負(fù)荷心肌重構(gòu)模型，TAC術(shù)后連續(xù)三天分別通過靜脈注射化學(xué)修飾的miR-378的模擬物和抑制劑，2周后，心臟超聲分別檢測假手術(shù)組、TAC組、TAC術(shù)后注射模擬物組、TAC術(shù)后注射抑制劑組的小鼠心功能指標(biāo)。

圖2所示為，2周后假手術(shù)組、TAC組、TAC術(shù)后注射模擬物組、TAC術(shù)后注射抑制劑組對照組及干預(yù)組代表性的心臟輪廓照片(標(biāo)尺：2mm)、心肌組織HE染色(橫切面)和膠原染色(藍色代表膠原沉積)(放大200倍)。

圖3所示為，TAC2周后的心重體重比。*代表與假手術(shù)組相比較p<0.05；**代表與假手術(shù)組相比較p<0.01；##代表與TAC組相比較p<0.01。

圖4所示為，TAC2周后小鼠心臟左室橫截面免疫組化HE染色，每組取3只小鼠，每只小鼠隨機選取10個視野計算心肌細(xì)胞橫截面積。**代表與假手術(shù)組相比較p<0.01；##代表與TAC組相比較p<0.01。

圖5所示為，TAC2周后小鼠心臟左室Masson染色，纖維化比例為單切面藍色部分面積所占切面面積比例。**代表與假手術(shù)組相比較p<0.01；#代表與TAC組相比較p<0.05；##代表與TAC組相比較p<0.01。

圖6所示為，TAC2周后小鼠左室射血分?jǐn)?shù)。#代表與TAC組相比較p<0.05。

圖7所示為，miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠經(jīng)過假手術(shù)及TAC造模，2周后各組小鼠心臟左室Masson染色。

圖8所示為，miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠經(jīng)過假手術(shù)及TAC造模，2周后小鼠心臟超聲測量左室射血分?jǐn)?shù)。&代表與野生型小鼠TAC造模組相比較p<0.05。

圖9所示為，miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠經(jīng)過假手術(shù)及TAC造模，2周后測量各組小鼠的心臟體重比值。*代表與野生型小鼠假手術(shù)組相比較p<0.05；**代表與野生型小鼠假手術(shù)組相比較p<0.01；##代表與基因敲除假手術(shù)組相比較p<0.01。

圖10所示為，根據(jù)miR-378基因敲除小鼠和野生型小鼠經(jīng)過假手術(shù)及TAC造模2周后心肌組織的Masson染色，纖維化比例為單切面藍色部分面積所占切面面積比例。**代表與野生型小鼠假手術(shù)組相比較p<0.01；##代表與基因敲除假手術(shù)組相比較p<0.01；&&代表與野生型小鼠TAC造模組相比較p<0.01。

圖11所示為，miR-378在小鼠各主要器官中的表達情況。取成年健康小鼠的腎、腦、胃、心臟、肺、骨骼肌和肝臟組織，分別提取總RNA，Northern blot檢測miR-378表達情況，u6為內(nèi)參。

圖12所示為，體外分離原代大鼠心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，提取總RNA，Northern blot檢測miR-378表達情況，u6為內(nèi)參。

圖13所示為，心肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-378模擬物、抑制劑及陰性對照物，48小時后分別給予機械牽張24小時刺激或不牽張。細(xì)胞免疫熒光檢測表面積，紅色為α輔肌動蛋白染色表示細(xì)胞形態(tài)，藍色為細(xì)胞核染色。

圖14所示為，各組細(xì)胞表面積的比較。**代表與與轉(zhuǎn)染miR-378陰性對照物未受機械牽張刺激組相比較p<0.01；#代表與轉(zhuǎn)染miR-378陰性對照物并給予機械牽張刺激組相比較p<0.05；##代表與轉(zhuǎn)染miR-378陰性對照物并給予機械牽張刺激組相比較p<0.01。

圖15所示為，心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-378模擬物及陰性對照物，48小時后分別給予機械牽張24小時刺激或不牽張。實時熒光定量PCR檢測心肌成纖維細(xì)胞中膠原I基因的表達。**代表與與轉(zhuǎn)染miR-378陰性對照物未受機械牽張刺激組相比較p<0.01；##代表與轉(zhuǎn)染miR-378陰性對照物并給予機械牽張刺激組相比較p<0.01。

圖16所示為，心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-378模擬物及陰性對照物，48小時后分別給予機械牽張24小時刺激或不牽張。Western blot檢測心肌成纖維細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達，GAPDH為內(nèi)參。**代表與與轉(zhuǎn)染miR-378陰性對照物未受機械牽張刺激組相比較p<0.01；##代表與轉(zhuǎn)染miR-378陰性對照物并給予機械牽張刺激組相比較p<0.01。

圖17所示為，利用絕對定量的實時熒光定量PCR方法檢測血清中miR-378的表達情況。根據(jù)心衰患者外周血中NT-proBNP的表達情況將心衰組分為兩組，NT-proBNP<2000(n＝12)組及NT-proBNP>2000(n＝15)組。*代表與健康對照組相比較p<0.05；**代表與健康對照組相比較p<0.01；##代表與NT-proBNP<2000心衰組相比較p<0.01。

圖18所示為，心衰患者的左室射血分?jǐn)?shù)與其血清中miR-378表達量的關(guān)系。根據(jù)心衰患者血清中miR-378的表達情況將心衰組分為兩組，miR-378大于200個拷貝(n＝11)組及miR-378小于200個拷貝(n＝16)組。**代表與健康對照組相比較p<0.01；##代表與miR-378大于200個拷貝心衰組相比較p<0.01。

具體實施方式

實施例1miR-378能夠抑制壓力超負(fù)荷引起的心肌重構(gòu)

8周到10周的C57B/L6小鼠使用主動脈縮窄方法(TAC)構(gòu)建小鼠壓力超負(fù)荷心肌重構(gòu)模型，TAC術(shù)后連續(xù)三天分別通過靜脈注射化學(xué)修飾的miR-378的模擬物和抑制劑(80mg/kg)。

具體地，每組8-10只，模擬物序列是5’-ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG-3’(反義鏈)5’-UUCUGACUCCAAGUCCAGUUU-3’(SEQ No.2)，模擬物在反義鏈進行修飾，3’端進行膽固醇修飾，5’端兩個硫代骨架修飾，3’端四個硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾。miR-378抑制劑序列是5’-CCUUCUGACUCCAAGUCCAGU-3’(SEQ No.3)，3’端進行膽固醇修飾，5’端兩個硫代骨架修飾，3’端四個硫代骨架修飾，全鏈甲氧基修飾。miR-378模擬物和抑制劑購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

2周后，心臟超聲檢測顯示心功能指標(biāo)包括舒張期左室后壁厚度、左室舒張期內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)，以及心重體重比；免疫組化進行HE染色和膠原染色。結(jié)果顯示，注射miR-378模擬物能夠顯著抑制壓力超負(fù)荷(TAC)引起的心肌肥厚和心肌細(xì)胞肥大(見圖1-4)，抑制心肌膠原沉積(見圖2、圖5)，而注射miR-378抑制劑會加重壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚和心肌纖維化(見圖1-5)，同時射血分?jǐn)?shù)所反映的心功能下降(見圖6)。證明了miR-378對心臟的保護作用。

實施例2miR-378基因敲除小鼠的制得

構(gòu)建sgRNA載體，使用工具載體pUC57-sgRNA(51132；Addgene,Cambridge,MA)，合成的sgRNA單鏈通過退火復(fù)性結(jié)合成小片段，插入BsaI線性化的載體上，目標(biāo)靶點位置序列為5’-GGCTCAGAGCTGAGCGGGAATGG-3’(SEQ No.4)，合成的gRNA單鏈分別是：M-mir378-be-gR-top:TAGGCTCAGAGCTGAGCGGGAA(SEQ No.5)和M-mir378-be-gR-dow:AAACTTCCCGCTCAGCTCTGAG(SEQ No.6)。構(gòu)建完成的sgRNA載體通過體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的sgRNA。

構(gòu)建CAS9載體，CAS9表達質(zhì)粒使用pST1374-NLS-flag-linker-Cas9(44758,Addgene)，PmeI線性化后使用T7Ultra kit(AM1345；Thermo Scientific,Waltham,MA)體外轉(zhuǎn)錄成為可注射的Cas9-RNA。

30只3-4周齡C57BL/6J小鼠注射激素進行超排，取約250枚受精卵進行注射(注射兩次，第一次150枚，第二次100枚)，制作30只8周齡輸精管結(jié)扎的ICR雄鼠，8-10周齡ICR雌鼠與結(jié)扎的ICR雄鼠交配后選取見栓的雌鼠，將注射后的受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部。出生后7-10天小鼠取鼠尾DNA鑒定基因型，擴增產(chǎn)物為：

M-mir378-F1：GATTGCCTGGAGTCGTGTCC(SEQ No.7)

M-mir378-R1：TAGCCACCAAAGACAAGAAGAACTC(SEQ No.8)

PCR反應(yīng)體系及擴增程序(TaKaRa RR042A)：

●反應(yīng)體系：

●擴增程序：

95℃ 15min；

95℃,30s 60℃,30s 72℃,60s 30循環(huán)；

72℃ 10min；

●6×loading buffer終止反應(yīng)

●用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳

選取PCR檢測有缺失條帶的PCR產(chǎn)物進行TA克隆，之后用檢測引物進行菌液PCR，篩選有插入的克隆測序。其中野生型擴增片段為890bp，缺失位點擴增片段為583bp。該基因敲除小鼠購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所(北京)。

實施例3miR-378基因敲除小鼠對比野生小鼠在壓力超負(fù)荷刺激表現(xiàn)出更嚴(yán)重的心肌肥厚和心肌纖維化

8周到10周的miR-378基因敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)使用主動脈縮窄方法(TAC)構(gòu)建小鼠壓力超負(fù)荷心肌重構(gòu)模型，2周后，心臟超聲檢測顯示心功能指標(biāo)包括舒張期左室后壁厚度、左室舒張期內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)，以及心重體重比；免疫組化進行HE染色和膠原染色。結(jié)果顯示，miR-378基因敲除小鼠心肌組織對比野生型小鼠心肌肥厚和纖維化程度加重(見圖7、圖9、圖10)，同時射血分?jǐn)?shù)所反映的心功能下降明顯(見圖8)。

實施例4miR-378表達水平具組織和細(xì)胞特異性

我們使用northern blot和real-time PCR的方法檢測了miR-378在小鼠各種組織中的發(fā)現(xiàn)，結(jié)果顯示miR-378主要在心臟組織和骨骼肌中呈高表達(見圖11)。進一步體外分離出心臟組織中的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-378在心肌細(xì)胞中特異性表達(見圖12)。

實施例5體外原代心肌細(xì)胞過表達miR-378顯著抑制肥大，抑制內(nèi)源miR-378在肥大因素刺激下加重心肌細(xì)胞肥大

實驗中使用Ambion公司的mirVanaTM mimics(35nM)和mirVanaTM miR-378inhibitor(50nM)轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞，48小時后肥大機械牽張刺激，發(fā)現(xiàn)miR-378能顯著抑制心肌細(xì)胞表面積、肥大基因表達和³[H]攝取量，相反，抑制內(nèi)源miR-378心肌細(xì)胞肥大加重、肥大基因表達上調(diào)，³[H]攝取量增加(見圖13、圖14)。

實施例6體外心肌成纖維細(xì)胞過表達miR-378顯著抑制成纖維細(xì)胞纖維化反應(yīng)

實驗中使用Ambion公司的mirVanaTM mimics(35nM)轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞，48小時后機械牽張刺激，發(fā)現(xiàn)miR-378能顯著抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原基因和MMP金屬蛋白酶的表達(見圖15、圖16)。

實施例7人血清中miR-378的表達與心力衰竭疾病狀態(tài)密切相關(guān)

收集28例健康人和27例心力衰竭患者的血清，其中心衰患者(左室射血分?jǐn)?shù)<45％)16例，心衰患者(左室射血分?jǐn)?shù)>45％)11例。上述所有樣本的取得均通過倫理委員會的同意。使用Trizol提取血清中的總RNA，用ABI的Taqman探針方法檢測miR-378表達水平，先用100ng總RNA為模板使用 MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)反轉(zhuǎn)錄，然后real-time PCR檢測miR-378表達，擴增程序95℃10分鐘，(95℃15秒，60℃60秒)40個循環(huán)。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來分析miR-378的表達量。我們發(fā)現(xiàn)心衰患者血清中miR-378表達水平對比健康對照組顯著升高，并且輕度心衰患者(左室射血分?jǐn)?shù)>45％)的血清中miR-378的表達水平要高于重度心衰患者(左室射血分?jǐn)?shù)<45％)組(見圖17、圖18)。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。

序列表

<110> 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院

<120> miR-378抑制心肌肥厚和心肌纖維化并診斷心力衰竭的用途

<130> 2017

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人

<400> 1

cuccugacuc cagguccugu gu 22

<210> 2

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 反義鏈

<222> (1)..(21)

<400> 2

acuggacuug gagucagaag guucugacuc caaguccagu uu 42

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccuucugacu ccaaguccag u 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 載體

<400> 4

ggctcagagc tgagcgggaa tgg 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taggctcaga gctgagcggg aa 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacttcccg ctcagctctg ag 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gattgcctgg agtcgtgtcc 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagccaccaa agacaagaag aactc 25