本發(fā)明屬于生物黏附性藥物載體的技術領域，具體涉及一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法。

背景技術：

殼聚糖(chitosan,cs)又名2-氨基-2-脫氧-β-d-葡糖,是甲殼素(2-乙酸氨基-2-脫氧-β-d-葡糖)脫乙?；漠a(chǎn)物。甲殼素又名蟹殼素、甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)和殼多糖等，是一種天然的線性多糖,是甲殼綱動物外殼的重要成分,也存在于低等植物如菌、藻類的細胞壁中。由于殼聚糖無毒，且具有優(yōu)良的生物相容性，在生物體內(nèi)易降解等特點，被廣泛應用于醫(yī)用輔料領域，殼聚糖能與黏膜蛋白形成氫鍵和靜電作用，具有良好的生物黏附性能，但這種基于非共價鍵的黏附作用不保證藥物在指定部位的持續(xù)釋放，限制了殼聚糖的應用，而殼聚糖經(jīng)巰基化后，黏附性能顯著提高，這是因為硫化聚合物(thiomers)能夠與黏膜層形成二硫鍵，與黏蛋白中半胱氨酸豐富的亞區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合。

然而巰基化聚合物到目前為止作為疏水性藥物載體應用并不理想，這是由于巰基化聚合物與疏水藥物分子作用很弱，常常導致藥物釋放、快、不持續(xù)釋放、包封率較差現(xiàn)象。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題在于針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，該新型巰基化納米粒子通過分步合成的方法合成巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子，合成過程中最后親水性聚乙二醇單甲醚(mpeg)與聚乳酸(pla)和殼聚糖(cs)形成mpeg-pla-cs聚合物，并在此基礎上通過5-氨基-2-巰基苯并咪唑(mbi)使聚合物巰基化，最終形成巰基聚合物(mpeg-pla-cs-mbi)。該巰基聚合物(mpeg-pla-cs-mbi)可負載疏水性藥物如大黃素等用作緩釋藥物。巰基聚合物通過巰基氧化形成二硫鍵粘附于黏膜表面，賦予納米粒子更強的黏附性能，達到延長藥物在黏膜上的滯留時間，有利于藥物分子的緩釋。同時，改性后殼聚糖與藥物結(jié)合形成納米復合物后，mpeg可在復合物表面形成核-殼結(jié)構膠束，保護納米復合物不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res系統(tǒng))識別和清除，使得所制得的粒子具有表面穩(wěn)定作用，能促進復合物粒子在體內(nèi)的長循環(huán)目的。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一：將5g～20g左旋丙交酯、2g～10g聚乙二醇單甲醚和0.2g～1g異辛酸亞錫溶解于20ml二氯甲烷中，在130℃的條件反應18h后置于冰乙醚中沉淀3次，再在40℃的真空條件下干燥3天，得到第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh；

步驟二：將10g步驟一中制備的第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh、2g丁二酸酐和1.2g4-二甲氨基吡啶溶于100ml氯仿中，攪拌均勻后加入2ml三乙胺，在室溫條件下反應3天，然后置于乙醚中沉淀3次，經(jīng)過濾得到濾渣，再將所述濾渣在40℃的真空條件下干燥3天，最后得到第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh；

步驟三：將2.5g步驟二中制備的第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh溶于40ml的二氯甲烷中，再加入0.7g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.7gn-羥基琥珀酰亞胺，在室溫條件下反應24h，旋蒸后溶于二甲基亞砜溶液中，再加入到添加有殼聚糖的60ml二甲基亞砜中反應24h，透析3天，冷凍干燥，得到第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs；所述殼聚糖的添加量為0.1g～1g，脫乙酰度為85％；

步驟四：將0.5g步驟三中制備的第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs溶于140ml水中，再加入0.3g高碘酸鈉溶液，室溫孵化2h后，加入300μl的乙二醇，在室溫條件下反應2h，透析3天，冷凍干燥，得到第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho，并在4℃下保存；所述高碘酸鈉溶液的濃度是2.14g/l；

步驟五：將0.2g～1g5-氨基-2-巰基苯并咪唑和0.2g步驟四中制備的第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho溶于在40ml二甲基亞砜溶液中，并在室溫條件下孵化2h，然后加入0.2g～2g的氰基硼氫化鈉，再在室溫條件下反應24h～72h，透析3天，冷凍干燥，得到用于負載大黃素的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子，并在4℃下保存；

步驟三中所述二甲基亞砜溶液和步驟五中所述二甲基亞砜溶液均由二甲基亞砜和水按照1:1的體積比混合而成。

上述一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，其特征在于，步驟一中所述聚乙二醇單甲醚的平均分子量為1000～4000。

上述一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，其特征在于，步驟一中所述左旋丙交酯的質(zhì)量為14.4g，聚乙二醇單甲醚的質(zhì)量為7.6g，異辛酸亞錫的質(zhì)量為0.2g。

上述一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，其特征在于，步驟三中所述殼聚糖的添加量為0.5g。

上述一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，其特征在于，步驟五中所述5-氨基-2-巰基苯并咪唑質(zhì)量為0.5g。

上述一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，其特征在于，步驟五中所述氰基硼氫化鈉的加入質(zhì)量為0.2g。

上述一種新型負載大黃素用納米粒子的制備方法，其特征在于，步驟五中所述反應的時間為48h。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明通過分步驟合成的方法合成巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子，合成過程中最后親水性聚乙二醇單甲醚(mpeg)與聚乳酸(pla)和殼聚糖(cs)形成mpeg-pla-cs聚合物，并在此基礎上通過5-氨基-2-巰基苯并咪唑(mbi)使聚合物巰基化，最終形成巰基聚合物(mpeg-pla-cs-mbi)。巰基聚合物通過巰基氧化形成二硫鍵粘附于黏膜表面，賦予新型巰基化納米粒子更強的黏附性能，達到延長藥物在黏膜上的滯留時間，有利于藥物分子的緩釋。同時，改性后殼聚糖與藥物結(jié)合形成納米復合物后，聚乙二醇單甲醚可在復合物表面形成核-殼結(jié)構膠束，保護納米復合物不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res系統(tǒng))識別和清除，使得所制得的新型巰基化納米粒子具有表面穩(wěn)定作用，能促進復合物粒子在生物體內(nèi)長循環(huán)目的。

2、采用本發(fā)明制備的巰基化納米粒子負載大黃素后的藥物包封率不小于83.6％，載藥量不小于3.89％，并且具有良好的水溶性和生物降解性。

3、本發(fā)明制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子不僅限于用于負載大黃素，還可應用于負載類似于大黃素的疏水性藥物，用作緩釋藥物的載體。

下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子的hnmr譜圖。

圖2為本發(fā)明實施例1中制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子的共軛紅外譜圖。

圖3為本發(fā)明實施例1中制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子在負載大黃素前后的紅外譜圖。

具體實施方式

實施例1

步驟一、將14.4g左旋丙交酯(l.a)、7.6g聚乙二醇單甲醚(mpeg)和0.2g異辛酸亞錫溶解于20ml二氯甲烷，在130℃反應18h后于冰乙醚中沉淀3次，40℃真空干燥3天，獲得第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh；

步驟二、將10g步驟一中制備的第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh、2g丁二酸酐和1.2g4-二甲氨基吡啶溶于100ml氯仿中，均勻后加入2ml三乙胺，室溫反應3天，乙醚沉淀3次，過濾，40℃真空干燥3天，獲得第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh；

步驟三、將2.5g步驟二中制備的第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh40ml的二氯甲烷溶液與0.7g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.7gn-羥基琥珀酰亞胺,室溫反應24h，旋蒸后溶于二甲基亞砜溶液，在加入到含0.5g殼聚糖60ml二甲基亞砜溶劑中，反應24h，透析3天，冷凍干燥獲得第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs；所述二甲基亞砜溶液均由二甲基亞砜和水按照1:1的體積比混合而成；

步驟四、將0.5g步驟三中制備的第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs溶于140ml水中，加入0.3g的高碘酸鈉(naio4)溶液，室溫孵化2h，加入300μl的乙二醇，室溫反應2h，透析3天，冷凍干燥，獲得第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho，在4℃下保存；所述高碘酸鈉溶液的濃度是2.14g/l；

步驟五、將0.5g5-氨基-2-巰基苯并咪唑(mbi)與0.2g步驟四中制備的第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho在40ml二甲基亞砜溶液中混合均勻，所述二甲基亞砜溶液均由二甲基亞砜和水按照1:1的體積比混合而成，2h室溫孵化后，加入0.2g的nacnbh3，室溫反應48h。透析3天，冷凍干燥得到巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子，在4℃下保存。

將本實施例制備的mpeg-pla-cs-mbi納米粒子分散于去離子水中，能夠完全分散，加入溶有質(zhì)量含量為40％的大黃素藥物的乙醇溶液，超聲處理，然后進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液在8000rpm離心處理，最后對負載了藥物的巰基化瓜爾膠納米粒子進行冷凍，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。圖3為本實施例制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子在負載大黃素前后的紅外譜圖，從圖中可以看出，在圖3中負載大黃素后其在436nm處有吸收，說明成功地將大黃素負載在巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子上。最后經(jīng)檢測，本實施例制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子載藥后的包封率為91％，載藥量5.01％。

圖1為本實施例制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子的hnmr譜圖，圖2為本實施例制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子的共軛紅外譜圖，從圖2可以看出，分別在1757cm^-1，1190cm^-1，1134cm^-1，1097cm^-1，在1629cm^-1為酰胺特征吸收峰，692cm^-1，784cm^-1存在證明苯環(huán)的存在，與圖1的hnmr圖譜中化學位移在7.08ppm，7.5ppm對應；1458cm^-1，1361cm^-1屬于為-ch3變形震動吸收峰，2883cm^-1，2949cm^-1為-ch2-反伸縮振動吸收峰，在3444cm^-1處存在一個較強的吸收峰，為nh的特征伸縮振動吸收峰，且只有一個為仲胺，吸收峰較強，在1045cm^-1處為伯醇的特征吸收峰?；瘜W位移在3.65ppm，5.2ppm分別對應聚乙二醇和聚乳酸上氫的位置，進一步證明改性成功。

本實施例的制備過程中親水性聚乙二醇單甲醚(mpeg)與聚乳酸(pla)形成mpeg-pla-cs聚合物，在此基礎上通過5-氨基-2-巰基苯并咪唑(mbi)使聚合物巰基化，最終形成巰基聚合物(mpeg-pla-cs-mbi)。巰基聚合物通過巰基氧化形成二硫鍵粘附于黏膜表面，達到延長藥物在黏膜上的滯留時間，有利于藥物分子的吸收，賦予制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子更強的黏附性能。同時，改性后殼聚糖與藥物結(jié)合形成納米復合物后，聚乙二醇單甲醚可在復合物表面形成核-殼結(jié)構膠束，保護納米復合物不被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res系統(tǒng))識別和清除，使得所制得的制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子具有表面穩(wěn)定作用，能促進復合物粒子在生物體內(nèi)長循環(huán)目的。

實施例2

步驟一、將5g左旋丙交酯(l.a)、2g聚乙二醇單甲醚(mpeg)和0.6g異辛酸亞錫溶解于20ml二氯甲烷，在130℃反應18h后于冰乙醚中沉淀3次，40℃真空干燥3天，得到第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh；

步驟二：將10g步驟一中制備的第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh、2g丁二酸酐和1.2g4-二甲氨基吡啶溶于100ml氯仿中，均勻后加入2ml三乙胺，室溫反應3天，乙醚沉淀3次，過濾，40℃真空干燥3天，獲得第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh；

步驟三、將2.5g步驟二中制備的第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh40ml的二氯甲烷溶液與0.7g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.7gn-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應24h，旋蒸后溶于二甲基亞砜溶液，在加入到含0.5g殼聚糖60ml二甲基亞砜溶劑中，反應24h，透析3天，冷凍干燥獲得第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs；所述二甲基亞砜溶液均由二甲基亞砜和水按照1:1的體積比混合而成；

步驟四、將0.5g步驟三中制備的第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs溶于140ml水中，加入0.3g的高碘酸鈉(naio4)溶液，室溫孵化2h，加入300μl的乙二醇，室溫反應2h，透析3天，冷凍干燥，獲得第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho，在4℃下保存；所述高碘酸鈉溶液的濃度是2.14g/l；

步驟五、將0.2g5-氨基-2-巰基苯并咪唑(mbi)與0.2g步驟四中制備的第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho在40ml二甲基亞砜溶液中混合均勻，2h室溫孵化后，加入0.5g的nacnbh3，室溫反應24h。透析3天，冷凍干燥得到巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子，在4℃下保存，所述二甲基亞砜溶液均由二甲基亞砜和水按照1:1的體積比混合而成。

將本實施例制備的mpeg-pla-cs-mbi納米粒子分散于去離子水中，能夠完全分散，加入溶有大黃素藥物的40％乙醇溶液，超聲處理，然后進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液在8000rpm離心處理，最后對負載了藥物的巰基化瓜爾膠納米粒子進行冷凍，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。經(jīng)檢測，本實施例制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子載藥后的包封率為86.3％，載藥量4.11％。

實施例3

步驟一、將20g左旋丙交酯(l.a)、10g聚乙二醇單甲醚(mpeg)和1g異辛酸亞錫溶解于20ml二氯甲烷，在130℃反應18h后于冰乙醚中沉淀3次，40℃真空干燥3天，獲得第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh；

步驟二、將10g步驟一中制備的第一中間產(chǎn)物mpeg-pla-oh、2g丁二酸酐和1.2g4-二甲氨基吡啶溶于100ml氯仿中，均勻后加入2ml三乙胺，室溫反應3天，乙醚沉淀3次，過濾，40℃真空干燥3天，獲得第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh；

步驟三、將2.5g步驟二中制備的第二中間產(chǎn)物mpeg-pla-cooh40ml的二氯甲烷溶液與0.7g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.7gn-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應24h，旋蒸后溶于二甲基亞砜溶液，在加入到含0.5g殼聚糖60ml二甲基亞砜溶劑中，反應24h，透析3天，冷凍干燥獲得第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs；所述二甲基亞砜溶液均由二甲基亞砜和水按照1:1的體積比混合而成；

步驟四、將1g步驟三中制備的第三中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs溶于140ml水中，加入0.3g的高碘酸鈉(naio4)溶液，室溫孵化2h，加入300μl的乙二醇，室溫反應2h，透析3天，冷凍干燥，獲得第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho，在4℃下保存；所述高碘酸鈉溶液的濃度是2.14g/l；

步驟五、將1g5-氨基-2-巰基苯并咪唑(mbi)與0.2g步驟四中制備的第四中間產(chǎn)物mpeg-pla-cs-cho在40ml二甲基亞砜溶液混合均勻，所述二甲基亞砜溶液均由二甲基亞砜和水按照1:1的體積比混合而成，2h室溫孵化后，加入2g的nacnbh3，室溫反應72h，透析3天，冷凍干燥得到巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子，在4℃下保存。

將本實施例制備的mpeg-pla-cs-mbi納米粒子分散于去離子水中，能夠完全分散，加入溶有大黃素藥物的40％乙醇溶液，超聲處理，然后進行磁力攪拌處理，將攪拌后的混合液在8000rpm離心處理，最后對負載了藥物的巰基化瓜爾膠納米粒子進行冷凍，得到最終負載藥物的納米靶向緩控釋系統(tǒng)。經(jīng)檢測本實施例制備的巰基化mpeg-pla-cs-mbi納米粒子載藥后的包封率為83.6％，載藥量3.89％。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制。凡是根據(jù)發(fā)明技術實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單的修改、變更以及等效變化，均仍屬于本發(fā)明技術方案的保護范圍內(nèi)。