本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種組織工程化軟骨移植物及其制備方法。

背景技術(shù)：

根據(jù)國(guó)家老齡工作委員會(huì)《中國(guó)老齡事業(yè)發(fā)展報(bào)告》，我國(guó)老年性骨關(guān)節(jié)疾病發(fā)病率高達(dá)55％，總患病人數(shù)超過(guò)1億；因運(yùn)動(dòng)及交通意外等原因引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損及骨組織損傷也越來(lái)越高發(fā)。由于軟骨細(xì)胞遷徙能力有限，再生能力低下，關(guān)節(jié)組織一旦受損，尤其是大面積軟骨缺損及軟骨下骨破壞，依靠自身組織修復(fù)再生能力難以自愈。傳統(tǒng)手術(shù)、細(xì)胞治療及組織工程化軟骨為軟骨缺損治療的主要方法，而傳統(tǒng)手術(shù)及單純細(xì)胞治療對(duì)大面積軟骨缺損治療效果有限，且遠(yuǎn)期效果下降，因此結(jié)合細(xì)胞與支架材料的組織工程化軟骨是當(dāng)今研發(fā)及應(yīng)用的重點(diǎn)，現(xiàn)有研發(fā)的組織工程化軟骨(如使用軟骨細(xì)胞、i型膠原支架、plga支架等)對(duì)軟骨修復(fù)效果有所提升，但也未能實(shí)現(xiàn)透明軟骨的完全修復(fù)，尤其是對(duì)大面積軟骨缺損中心區(qū)域的修復(fù)。

軟骨細(xì)胞具有取材困難、來(lái)源有限、體外培養(yǎng)困難等問(wèn)題，而間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有來(lái)源廣泛、方便取材、分離容易、增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，成為組織工程細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells，uc-mscs)具有來(lái)源廣泛、增殖快、分化能力強(qiáng)等特點(diǎn)，既克服軟骨細(xì)胞的缺點(diǎn)，又比成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells，bmscs)等在取材及細(xì)胞增殖分化方面具有一定優(yōu)勢(shì)，尤其對(duì)年齡較大患者優(yōu)勢(shì)更為明顯。軟骨外基質(zhì)主要由ii型膠原蛋白和蛋白聚糖等組成，ii型膠蛋白為軟骨細(xì)胞特異基質(zhì)，其微環(huán)境更利于軟骨特異基質(zhì)的產(chǎn)生與分泌，利于透明軟骨的生成，但ii型膠原蛋白促細(xì)胞增殖能力較弱。i型膠原蛋白支架是長(zhǎng)期以來(lái)應(yīng)用較廣的軟骨組織工程支架材料，其在促細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)優(yōu)異，然而對(duì)大面積軟骨缺損其仍難達(dá)到透明軟骨的完全修復(fù)。

在上世紀(jì)80年代，美國(guó)宇航局生命科學(xué)部開(kāi)始研究太空微重力對(duì)細(xì)胞組織的影響，為模擬微重力而設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)出旋壁式生物反應(yīng)器。培養(yǎng)液處于旋轉(zhuǎn)流動(dòng)狀態(tài)，置身其中的細(xì)胞會(huì)受到流體應(yīng)力，后期實(shí)驗(yàn)證實(shí)使用該反應(yīng)器進(jìn)行3d培養(yǎng)的細(xì)胞組織特性和基因表達(dá)更接近于正常體內(nèi)組織細(xì)胞，與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)有顯著區(qū)別，學(xué)者們紛紛將其應(yīng)用在神經(jīng)、肝臟、腎臟、腫瘤等方面進(jìn)行研究，結(jié)果皆支持該生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中透明軟骨不能完全修復(fù)的缺陷，提供一種綜合了細(xì)胞與支架材料的組織工程化軟骨移植物及其制備方法，旨在解決現(xiàn)有組織工程化軟骨材料不能同時(shí)滿足既促細(xì)胞增殖又促軟骨基質(zhì)分泌等問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供一種組織工程化軟骨移植物，所述組織工程化軟骨移植物包括三維支架材料和分散在所述三維支架材料中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，所述三維支架材料由i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備。

本發(fā)明提供的組織工程化軟骨移植物，綜合了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛、取材方便、增殖快、分化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，以及由i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備的三維支架材料的孔隙率大、孔徑均勻的特點(diǎn)，最終使組織工程化軟骨移植物既促細(xì)胞增殖又促軟骨基質(zhì)分泌的，可滿足透明軟骨的完全修復(fù)，尤其是對(duì)大面積軟骨缺損中心區(qū)域的修復(fù)。

本發(fā)明另一方面提供一種組織工程化軟骨移植物的制備方法，該方法包括如下步驟：

分別獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液和三維支架材料，所述三維支架材料由i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備；

將所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于所述三維支架材料中吸收后，得細(xì)胞-支架復(fù)合物，并將所述細(xì)胞-支架復(fù)合物初始恒溫孵育3-5h；

將初始恒溫孵育后的所述細(xì)胞-支架復(fù)合物置于旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器中旋轉(zhuǎn)恒溫孵育3-7天，得所述組織工程化軟骨移植物。

本發(fā)明提供的組織工程化軟骨移植物的制備方法，利用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖快、分化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，以及由i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備的特有三維支架材料，結(jié)合3d動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)；方法簡(jiǎn)單易行，條件容易控制，成本低，最終得到的產(chǎn)品既克服了軟骨細(xì)胞取材困難、來(lái)源有限、體外培養(yǎng)困難等問(wèn)題，又能優(yōu)化其促軟骨基質(zhì)分泌的特點(diǎn)，可使修復(fù)軟骨組織更貼近天然軟骨特性，從而實(shí)現(xiàn)軟骨的完全修復(fù)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1獲得的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2制備的三維支架材料結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3制備的組織工程化軟骨移植物結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3制備的組織工程化軟骨移植物組織學(xué)dapi染色效果圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種組織工程化軟骨移植物。該組織工程化軟骨移植物包括三維支架材料和分散在所述三維支架材料中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，所述三維支架材料由i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備。

上述組織工程化軟骨移植物，綜合了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖快、分化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，以及三維支架材料生物力學(xué)性能和生物相容性等特點(diǎn)，最終使組織工程化軟骨移植物既可以很好地促細(xì)胞增殖又促軟骨基質(zhì)分泌的，可滿足透明軟骨的完全修復(fù)，尤其是對(duì)大面積軟骨缺損中心區(qū)域的修復(fù)。

具體地，上述三維支架材料中的i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白的質(zhì)量比為：(99:1)-(1:99)。i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白的質(zhì)量比可以為：99:1，50:1，20:1，10:1，1:1，1:10，1:20，1:50，1:99中任意一種，本實(shí)施例中優(yōu)選質(zhì)量比為：1:1。在本發(fā)明提供的i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白的質(zhì)量比范圍內(nèi)獲得的三維支架材料，可顯著提高其柔韌性，改善生物力學(xué)性能，更有利于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的吸附生長(zhǎng)。

具體地，上述三維支架材料的制備過(guò)程為：

s011：獲得i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白原料；

s012：將上述i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白溶于水中得混合液，并將該混合液放置于模具中依次進(jìn)行第一次冷凍、第一次真空干燥得初始支架材料；

s013：將上述初始支架材料加入交聯(lián)劑溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將交聯(lián)反應(yīng)后的初始支架材料中的剩余交聯(lián)劑清洗干凈后，依次進(jìn)行第二次冷凍、第二次真空干燥得三維支架材料。

本發(fā)明實(shí)施例中利用i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備的三維支架材料，其孔徑范圍為550μm-150μm，孔隙率在85％-95％之間?？讖酱笮?、孔隙率對(duì)接種細(xì)胞孵育有非常大的影響，本實(shí)施例制備的三維支架材料所具有的孔徑范圍和孔隙率，既保持材料的生物力學(xué)性能，又有效提高臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞吸附滲透，使其更好孵育生長(zhǎng)，最終得到的組織工程化軟骨移植物可滿足透明軟骨的完全修復(fù)。

具體地，上述步驟s012中，混合液放置模具前，可先將該混合液于4-5℃條件下，冷存24-48h。在該冷存條件下，更有利于去除混合液中的氣泡，最終提高三維支架材料中的微孔分布均勻性。同時(shí)，模具的大小和形狀都無(wú)限制，根據(jù)臨床需要的三維支架材料大小而定。本實(shí)施例中，模具可為實(shí)驗(yàn)室用的6孔板、12孔板、24孔板等試驗(yàn)器材。

具體地，上述步驟s012中，第一次冷凍的條件為：在等于或低于負(fù)20℃的溫度下，冷凍24h；第一次真空干燥的時(shí)間為3-5天。上述步驟s013中的第二次冷凍的條件為：在等于或低于負(fù)20℃的溫度下，冷凍24h；第二次真空干燥時(shí)間為3-5天。冷凍溫度和時(shí)間影響三維支架材料的孔徑，在該優(yōu)選的冷凍、真空干燥條件下，得到孔徑合適、生物力學(xué)性能更加穩(wěn)定的三維支架材料。

具體地，上述步驟s013中的交聯(lián)劑溶液為碳化二亞胺酒精溶液；交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為12h。在該交聯(lián)劑處理的時(shí)間范圍內(nèi)，可使i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白結(jié)合更加穩(wěn)固，最終提高三維支架材料的生物力學(xué)性能。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種組織工程化軟骨移植物的制備方法。該制備方法包括如下步驟：

s01：分別獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液和三維支架材料，且該三維支架材料由i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備；

s02：將上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于三維支架材料中吸收后，得細(xì)胞-支架復(fù)合物，并將該細(xì)胞-支架復(fù)合物初始恒溫孵育3-5h；

s03：將初始恒溫孵育后的細(xì)胞-支架復(fù)合物置于旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器中旋轉(zhuǎn)恒溫孵育3-7天，即得組織工程化軟骨移植物。

上述組織工程化軟骨移植物的制備方法，利用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以及由i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白制備的特有三維支架材料，在3d動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)中制備；方法簡(jiǎn)單易行，條件容易控制，成本低，最終得到的產(chǎn)品可使修復(fù)軟骨組織更貼近天然軟骨特性，從而實(shí)現(xiàn)軟骨的完全修復(fù)。

具體地，上述步驟s01中，取離體的臍帶組織樣本進(jìn)行uc-mscs的分離及鑒定獲得臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液；而三維支架材料制備過(guò)程上面已經(jīng)說(shuō)明，這里不再闡述。

具體地，上述步驟s02中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于三維支架材料的細(xì)胞個(gè)數(shù)為：(5-7)×10⁶個(gè)。本實(shí)施例中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種個(gè)數(shù)為5×10⁶，在該優(yōu)選的接種細(xì)胞個(gè)數(shù)范圍內(nèi)，更有利于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在三維支架材料中的孵育增殖。

具體地，上述步驟s03中，初始恒溫孵育的條件為：溫度為37℃，co2濃度為5％，相對(duì)濕度為95％；旋轉(zhuǎn)恒溫孵育的條件為：轉(zhuǎn)速為10-50rpm/min，溫度為37℃、co2濃度為5％co2，相對(duì)濕度為95％。其中，以使細(xì)胞-支架復(fù)合物懸浮最佳轉(zhuǎn)速為優(yōu)選轉(zhuǎn)速，本實(shí)施例中優(yōu)選速度為15rpm/min；在該優(yōu)選的初始恒溫孵育的條件和旋轉(zhuǎn)恒溫孵育條件下，最終得到組織工程化軟骨移植物生物性能更加穩(wěn)定，更有利于軟骨的修復(fù)。

本發(fā)明先后進(jìn)行過(guò)多次試驗(yàn)，現(xiàn)舉一部分試驗(yàn)結(jié)果作為參考對(duì)發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述，下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明中下列實(shí)施例用到的儀器設(shè)備有：

生物安全柜：蘇州凈化二級(jí)安全柜；

細(xì)胞培養(yǎng)箱：thermalscientificseriesii；

倒置顯微鏡：leicadmilled；

化學(xué)發(fā)光儀：thermalscientificmultiscango；

pcr儀：appliedbiosystemsveriti96-wellthermalcycler；

熒光定量pcr儀：appliedbiosystemsviia7；

離心機(jī)：eppendorf5804r；

流式細(xì)胞儀：bdfacsaria；

旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器：synthecon；

真空冷凍干燥儀：lgj-10c；

磁力攪拌器：keezokms151e；

-20℃冰箱：海爾；

-80℃冰箱：thermalscientific。

實(shí)施例1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)

1、提供臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞樣品(沃頓膠分離)。

準(zhǔn)備高壓滅菌器械三套(每套配備一把剪刀和一只鑷子)。將臍帶樣本轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿中，以無(wú)菌含p/s生理鹽水沖洗2次。使用注射器插入血管，對(duì)臍帶內(nèi)的血進(jìn)行沖洗。將臍帶剪成2-3cm小段，分別對(duì)血管內(nèi)的血液進(jìn)行沖洗。沿著動(dòng)脈剪開(kāi)臍帶，再分別剔除兩條動(dòng)脈和一條靜脈。取沃頓膠(避開(kāi)外皮)，剪至1-2mm³大小，均勻貼布于10cm培養(yǎng)皿底部(間隔約1cm)，再加入2-3ml培養(yǎng)基，至潤(rùn)濕所有組織塊，于37℃、5％co2條件下過(guò)夜培養(yǎng)，繼續(xù)加入培養(yǎng)基蓋過(guò)組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，可見(jiàn)細(xì)胞從組織塊周?chē)莱觥?/p>

2、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

準(zhǔn)備mesengro培養(yǎng)液：mesengro培養(yǎng)基(stemrd，mgro-500b)；另加入10％胎牛血清替代物(compassbiomedical，pls6)、100u/ml的青霉素/鏈霉素雙抗(gibco，15140-122)、7.5mg/l的阿米卡星(sigma，37517-28-5)、10μg/l的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(peprotech，100-31)。

用胰蛋白酶(gibco，25200-072)消化離心，置于t25培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％-90％融合時(shí)，繼續(xù)進(jìn)行傳代。培養(yǎng)的細(xì)胞部分用于鑒定，部分用于后續(xù)三維支架材料進(jìn)行3d動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器培養(yǎng)。圖1為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果圖，從圖1可以看出，該臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成梭形貼壁培養(yǎng)，大小均一，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞完整。

進(jìn)行流式鑒定：胰酶消化后，離心收集細(xì)胞，用生理鹽水洗2-3次。分別進(jìn)行抗體染色，陽(yáng)性抗體為cd90、cd105、cd73，陰性抗體為cd34、cd45(細(xì)胞懸浮于100mlpbs中)。避光染色1h，生理鹽水洗一次，懸浮于500ulpbs中，過(guò)膜，置于流式管中。通過(guò)流式細(xì)胞儀鑒定檢測(cè)了軟骨細(xì)胞特異分子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示陽(yáng)性標(biāo)志分子均檢測(cè)達(dá)95％以上。本實(shí)驗(yàn)獲取的uc-mscs符合間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例2三維支架材料的制備

一種三維支架材料的制備方法，包括如下步驟：

s111：獲得0.5g的i型膠原蛋白和0.5g的ii型膠原蛋白原料。

s112：將上述i型膠原蛋白和ii型膠原蛋白溶于水中得混合液，并將該混合液放置模具中依次進(jìn)行第一次冷凍、第一次真空干燥，得到初始支架材料。具體過(guò)程如下：

將上述i型膠原蛋白溶于10ml去離子水中，然后攪拌過(guò)夜，使膠原蛋白完全溶解；將上述ii型膠原蛋白加入到i膠原蛋白溶液中，過(guò)夜混合均勻后得混合液，并放入4℃冰箱中冷存24-48h，去除氣泡。用5ml針管吸取配制好的混合液，把1ml混合液注入24孔板中的一個(gè)孔中，放入-20℃冰箱中冷凍過(guò)夜(24h)；把冷凍好的樣品放入預(yù)凍好的真空冷凍干燥儀內(nèi)冷凍干燥3天，得初始支架材料。

s113：將上述初始支架材料加入交聯(lián)劑溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將交聯(lián)反應(yīng)后的初始支架材料中的剩余交聯(lián)劑清洗干凈后，依次進(jìn)行第二次冷凍、第二次真空干燥，得到三維支架材料。具體過(guò)程如下：

在冷凍干燥好的初始支架材料中加入1.5ml20mm碳化二亞胺(edc，該溶液以酒精為溶劑)，對(duì)初始支架材料進(jìn)行交聯(lián)12小時(shí)后，吸出交聯(lián)液，以pbs浸泡清洗三遍后放入-20℃冰箱內(nèi)冷凍過(guò)夜(24h)，然后放入真空冷凍干燥儀內(nèi)冷凍干燥3天后制備得到三維支架材料。

該三維支架材料的宏觀和微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示：圖2(a)為三維支架材料的外觀圖，圖2(b)為三維支架材料的微觀掃描電鏡圖。該三維支架材料的孔徑范圍為550μm-150μm，孔隙率在85％-95％之間。

實(shí)施例3組織工程化軟骨移植物的制備

一種組織工程化軟骨移植物的制備方法，包括如下步驟：

s11：利用實(shí)施例1培養(yǎng)的細(xì)胞液制備用于接種于三維支架材料中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液，利用實(shí)施例2的方法獲得三維支架材料。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液的制備過(guò)程為：消化實(shí)施例1培養(yǎng)的重懸細(xì)胞，收集臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液至15ml的離心管中，在溫度4℃、轉(zhuǎn)速1500rpm條件下，進(jìn)行離心10min，隨后棄上清液，運(yùn)用移液槍加入1ml的培養(yǎng)基，輕輕吹打，取10ul的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液滴加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液濃度為1×10⁷個(gè)/ml。

s12：將上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于實(shí)施例2的三維支架材料中吸收后，得細(xì)胞-支架復(fù)合物，并將該細(xì)胞-支架復(fù)合物初始恒溫孵育3-5h。具體過(guò)程為：

將獲得的三維支架材料置于10ml培養(yǎng)皿上，吸取100ul的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞懸液滴定于支架上，待三維支架材料充分吸收細(xì)胞懸液后，再按上述程序重復(fù)一次，一共重復(fù)5次，一共500ul，細(xì)胞數(shù)量可達(dá)5×10⁶個(gè)，操作過(guò)程注意避免細(xì)胞懸液流至支架外，接種完畢后將細(xì)胞-支架復(fù)合物置于37℃、5％co2、95％濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h。

s13：將初始恒溫孵育后的細(xì)胞-支架復(fù)合物置于旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器中旋轉(zhuǎn)恒溫孵育3-7天，即得組織工程化軟骨移植物。具體過(guò)程為：

將細(xì)胞-支架復(fù)合物轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器的單體容器中，并加入適量的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連接生物反應(yīng)器體部與控制裝置，接上電源，啟動(dòng)反應(yīng)器，調(diào)整轉(zhuǎn)速為15rpm/min，再次檢查儀器轉(zhuǎn)態(tài)，觀察復(fù)合物是否處于懸浮狀態(tài)，最后將生物反應(yīng)器主體部分置于37℃、5％co2、95％濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3-7天，得組織工程化軟骨移植物。該組織工程化軟骨移植物的外觀如圖3所示。

dapi染色檢測(cè)：

取出三組樣品，pbs清洗后切薄片，往樣品上滴加dapi染色液，避光室溫下染色5min，吸掉染色液，置于多孔板內(nèi)，放置于熒光顯微鏡下觀察被染色的細(xì)胞在支架材料內(nèi)部的分布情況。其結(jié)果過(guò)圖4所示，圖4顯示細(xì)胞在支架內(nèi)分布均勻，支架具有良好的細(xì)胞相容性。

總之，本實(shí)施例制備的組織工程化軟骨移植物，既保持材料的生物力學(xué)性和生物相容性，能又保持臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化快的特點(diǎn)，最終可滿足透明軟骨的完全修復(fù)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。