本發(fā)明屬于藥物制劑技術領域，具體來說，涉及一種阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒及其制備方法。

背景技術：

骨質疏松癥（osteoporosis）是一種系統(tǒng)性骨病，其特征是骨量下降和骨的微細結構破壞，表現為骨的脆性增加，因此骨折是其常見的并發(fā)癥，以髖部，椎體和橈骨遠端發(fā)生最多。目前在世界常見病、多發(fā)病中居第7位。骨質疏松癥是一種多因素所致的慢性疾病。在骨折發(fā)生之前，通常無特殊臨床表現。婦女在進入絕經期后骨量丟失明顯，如無適當預防和治療，骨質疏松將不可避免地造成橈骨、脊柱和髖部等處的骨折。隨著我國老年人口的增加，骨質疏松癥發(fā)病率處于上升趨勢，在我國乃至全球都是一個值得關注的健康問題。

現有防治骨質疏松的藥物主要有骨吸收抑制劑、骨形成促進劑、解偶聯劑、骨礦化劑、降鈣素類、雌性激素類以及中醫(yī)藥等。臨床上以阿侖膦酸鈉(福善美)的應用最為廣泛,與降鈣素、雌激素受體調節(jié)劑和利塞膦酸鈉進行比較顯示,阿侖膦酸鈉升高骨密度（BMD）的作用最強。 Bone等報道了一項大樣本的研究,結果顯示接受阿侖膦酸鈉治療10年者其BMD持續(xù)增加,10年時與基線相比,腰椎BMD增加 13.7%, 股骨頸BMD增加 5.5%, 大轉子 BMD增加 10.2%。二膦酸鹽類藥物是近二十年發(fā)展起來的一種新藥，其作為骨吸收抑制劑來預防骨質疏松或者作為抗骨質疏松的主要藥物。二膦酸鹽類藥物主要機制是通過抑制破骨細胞活性減少骨吸收，降低骨轉換，增加骨密度，從而降低骨折的發(fā)生率。

阿侖膦酸鈉是第三代二膦酸鹽類藥物的代表藥物，也是臨床上使用最為廣泛的抗骨質疏松藥物。其結構式為：

阿侖膦酸鈉為白色結晶性粉末。在水中略溶，在熱水中溶解，在乙醇或丙酮中不溶，在氫氧化鈉試液中易溶。其化學名為[4-氨基-1-羥基亞丁基]二膦酸鈉。與前兩代二膦酸鹽類藥物相比，阿侖膦酸鈉的抗骨吸收性強，且沒有骨礦化抑制作用，是惡性腫瘤及佩吉特骨病引起的高鈣血癥的一線治療藥物。但是該藥物治療存在一定副作用，如胃腸道反應，反酸 、 胃灼熱 、 腹痛、食管炎、食管潰瘍等上消化道癥狀限制一部分骨質疏松患者使用該藥物。并且阿侖膦酸鈉口服生物利用度極低，據報道，鼠、犬猴的生物利用度分別為0.9%，1.8%，1.7%，人口服后絕對生物利用度低于1.0%。因此體內血藥濃度極低，常通過測定尿液中藥物的累積排泄量來評價其生物利用度。因此，提高其生物利用度，緩解其不良反應是該藥目前迫切要解決的問題。

目前關于阿侖膦酸鈉的專利主要有阿侖膦酸鈉藥物組合物、阿侖膦酸鈉粉物劑、阿侖膦酸鈉泡騰顆粒劑、阿侖膦酸鈉粉針劑、阿侖膦酸鈉固體分散體、阿侖膦酸鈉納米制劑、阿侖膦酸鈉環(huán)糊精包合物、阿侖膦酸鈉腸溶制劑、阿侖膦酸鈉復方制劑等，這些制劑在減少黏膜刺激性，降低不良反應具有顯著優(yōu)勢，但大部分沒有其口服生物利用度信息。

固體脂質納米粒 (Solid lipid nanoparticles， SLN) 是以固態(tài)的天然或合成的脂質為載體制成的粒徑約為50-1000 nm的膠體給藥系統(tǒng)。SLN可口服給藥、注射給藥、局部給藥、肺部給藥，SLN 口服后, 利用納米粒的黏附性可增加載藥粒子在藥效部位或藥物吸收部位的停留時間和接觸面積, 提高生物利用度 ,減少不規(guī)則吸收。納米微粒具有獨特的粒徑大小、其超微小體結構非常容易進入組織間隙，并通過被高分子材料包埋藥物，可減少藥物的刺激性，提高藥物的生物利用度。

鑒于此，本發(fā)明對阿侖膦酸鈉的固體脂質納米粒進行研究。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種簡單可行的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒制備方法，使其在發(fā)揮其治療作用時具有良好的緩控釋作用，提高阿侖膦酸鈉生物利用度，從而降低毒副作用。

所得的固體脂質納米粒具有粒徑小、包封率高、穩(wěn)定性好的特點。尿液排泄動力學結果顯示，大鼠口服固體脂質納米粒的生物利用度是阿侖膦酸鈉溶液劑的3-4倍。

為實現上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：本發(fā)明首先公開了一種阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒，包括以下各組分：阿侖膦酸鈉、固態(tài)脂質、脂溶性乳化劑、水溶性乳化劑和蒸餾水。

各組分的重量百分含量為 ：阿侖膦酸鈉0.01%-0.05%，固體脂質0.29%-0.5%，脂溶性乳化劑 0.19%-0.5%, 水溶性乳化劑0.49%-0.98%, 余量為蒸餾水。

所述固體脂質選自單硬脂酸甘油酯，硬脂酸，山崳酸甘油脂中的任意一種或任意兩種按照任意比例組成的混合物 ；優(yōu)選為山崳酸甘油脂。

所述脂溶性乳化劑選自大豆卵磷脂，蛋黃卵磷脂或二者按照任意比例組成的混合物 ；優(yōu)選為大豆卵磷脂。

所述水溶性乳化劑選自脂肪酸山梨坦類 , 聚山梨酯類 , 聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物類 ,聚氧乙烯脂肪酸酯類 , 聚氧乙烯脂肪醇醚類中的任意一種或者兩種以上按照任意比例組成的混合物；優(yōu)選為聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物類；最優(yōu)選為泊洛沙姆 188。

本發(fā)明所提供的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒制備方法包括以下步驟 ：

步驟一，精密稱取處方量的各組分，將阿侖膦酸鈉先溶于少量有機溶劑中，再與固態(tài)脂質和脂溶性乳化劑混合，加熱熔融，得到油相 ；

步驟二，將水溶性乳化劑加入蒸餾水中，并加熱到同油相相同的溫度，形成水相 ；

步驟三，將水相倒入油相，經高速剪切、超聲破碎后，既得阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒。

其中，步驟一所述有機溶劑選自無水乙醇、甲醇、二甲基亞砜或二氯甲烷中任意一種或兩種以上按照任意比例組成的混合物 ；優(yōu)選為無水乙醇。

步驟一、二所述油相和水相的溫度為 85℃。

步驟三所述高速剪切的轉速為7000轉，剪切時間為3min ；超聲破碎功率為300w，超聲時間為 3min。

本發(fā)明所制得的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒平均包封率62.65±2.41%，粒徑為120.27±1.17nm。

本發(fā)明中所述脂溶性乳化劑、固態(tài)脂質、水溶性乳化劑、有機溶劑的不同種類及其不同用量對阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒平均粒徑、多分散系數 (PDI)、包封率起重要影響作用。其中，阿侖膦酸鈉與山崳酸甘油脂、大豆卵磷脂、無水乙醇、泊洛沙姆 188 制備的阿侖膦酸鈉脂質納米粒質量評價較好 ；優(yōu)選的 ,3mg 阿侖膦酸鈉，30mg 山崳酸甘油酯，20mg 卵磷脂、0.4ml 無水乙醇、50mg 泊洛沙姆 188 所制得的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒平均粒徑120.27nm，PDI 為 0.29，zeta 電位為 -19.2，包封率為 62.5%，質量評價最好。

改變脂溶性乳化劑、固態(tài)脂質、水溶性乳化劑的種類或用量或者采用不同的制備方法，對制得的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的粒徑、分散系數、包封率均會有顯著影響。例如，在其他條件均一致的情況下，僅改變脂溶性乳化劑的用量，用量分別為 50mg、20mg、10mg時，所制得的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的質量評價存在明顯差異，平均粒徑為 90.43 ——130.17nm，多分散系數 (PDI) 為 0.34 —— 0.45，zeta 電位為 -10.85 —— -19.1，包封率為 2.71% —— 62..65% ；其中 , 脂溶性乳化劑用量為 20mg 時，平均粒徑為 120.27nm，PDI 為0.29，zeta 電位為 -19.1，包封率為 62.65%。質量評價最好。同時用溶劑揮發(fā)法和本發(fā)明制備方法制備阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒，對各自的最優(yōu)處方制得的納米粒進行評價結果為，溶劑揮發(fā)法制得的固體脂質納米粒平均粒徑為 128.9nm，PDI 為 0.37，zeta 電位為 -11.6，包封率為 23.8%，故本發(fā)明制備方法更優(yōu)于溶劑揮發(fā)法制備阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒。

本發(fā)明阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒體內藥代動力學研究 ：2 組 SD 大鼠（n=5）分別單劑量口服給與阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒（以阿侖膦酸鈉4.5mg/kg）和阿侖膦酸鈉溶液劑（4.5mg/kg）后，分別收集 3、6、9、12、15、24、36、48h 時間點的尿液。尿液樣品采用Agilent 1260 HPLC 測定各時間點阿侖膦酸鈉含量。大鼠體內阿侖膦酸鈉溶液劑和同濃度阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒微粒的口服阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的血藥濃度均高于口服溶液劑的濃度。阿侖膦酸鈉溶液劑的生物利用度為4.7%，阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的生物利用度為12.6%，二者代謝均符合一室模型。結果說明，相對阿侖膦酸鈉溶液劑，阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒能顯著提高阿侖膦酸鈉在體內的血藥濃度和生物利用度。

關于本發(fā)明的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的制備方法，其優(yōu)點在于 ：

（1）該固體脂質納米粒將阿侖膦酸鈉藥物包裹在內酯核中，增加其水溶性及穩(wěn)定性，可使藥物穩(wěn)定緩慢釋放，提高藥物的生物利用度，降低毒副作用

（2）使用易揮發(fā)、毒性較小的無水乙醇溶劑作為有機溶劑，且有機溶劑用量很少，與現有研究中多使用的溶劑揮發(fā)法制備納米粒比較 , 本發(fā)明使用的有機溶劑毒性更低、殘留更少；

（3）以泊洛沙姆 188 溶液作為水溶性乳化劑，且加入大豆卵磷脂作為脂溶性乳化劑，保證所制納米粒的粒徑減小、載藥量提高；

（4）制備工藝簡單，包封率高，便于工業(yè)化生產。

附圖說明

圖1是阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的 HPLC-UV 圖。A 為阿侖膦酸鈉標準品液相圖，B 為阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒中游離藥物的液相圖。

圖 2 是阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的粒徑分布圖。

圖 3 是阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的電位圖。

圖 4 是阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒體外釋放曲線圖。

圖 5 是阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒微粒透射電鏡圖。

圖 6是阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒及同濃度阿侖膦酸鈉溶液劑在大鼠體內的尿液排泄動力學曲線圖。

具體實施方式

為了更好的說明本實驗的技術方案，特給出了以下實例，但本發(fā)明并不僅限于以下實例。

實施例1：阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的制備；處方：阿侖膦酸鈉 3mg，山崳酸甘油脂 30mg，大豆卵磷脂 20mg，泊洛沙姆 188 50mg，無水乙醇 0.4ml，蒸餾水 10ml。

制得阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒 ：步驟一，精密稱取處方量的各組分，將阿侖膦酸鈉先溶于少量有機溶劑（無水乙醇）中，再與山崳酸甘油脂和大豆卵磷脂混合，加熱到 85℃使脂質熔融，得到油相 ；步驟二，將泊洛沙姆188加入10ml蒸餾水中，并加熱到同油相相同的溫度，形成水相 ；步驟三，將水相倒入油相，7000rpm 高速剪切 3min 后，300w 超聲破碎 3min，既得阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒。

實施例 2 阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的制備；處方如下 ：阿侖膦酸鈉 5mg；山崳酸甘油脂 50mg；大豆卵磷脂 20mg；泊洛沙姆 188 50mg；無水乙醇 0.4ml；蒸餾水 10ml。

制得阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒 ：步驟一，精密稱取處方量的各組分，將阿侖膦酸鈉先溶于少量有機溶劑（無水乙醇）中，再與山崳酸甘油脂和大豆卵磷脂混合，加熱到 85℃使脂質熔融，得到油相 ；步驟二，將泊洛沙姆188加入10ml蒸餾水中，并加熱到同油相相同的溫度，形成水相 ；步驟三，將水相倒入油相，7000rpm 高速剪切 3min 后，300w 超聲破碎 3min，既得阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒。

實施例 3 阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的制備；處方如下 ：阿侖膦酸鈉 1mg

山崳酸甘油脂 50mg；大豆卵磷脂 25mg；泊洛沙姆 188 30mg；無水乙醇 0.4ml；蒸餾水 10ml。

制得阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒 ：步驟一，精密稱取處方量的各組分，將阿侖膦酸鈉先溶于少量有機溶劑（無水乙醇）中，再與山崳酸甘油脂和大豆卵磷脂混合，加熱到 85℃使脂質熔融，得到油相 ；步驟二，將泊洛沙姆188加入10ml蒸餾水中，并加熱到同油相相同的溫度，形成水相 ；步驟三，將水相倒入油相，11000rpm 高速剪切 3min 后，300w 超聲破碎 3min，既得到阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒。

實施例 4：阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的包封率和載藥量測定。

4.1 本發(fā)明采用高效液相色譜法測定阿侖膦酸鈉濃度。其HPLC-UV色譜條件為 ：色 譜 柱 ：Venusil AA 分析柱(4.6×250 mm，5 μ m)；流 動 相 ：乙酸鈉乙腈溶液 (0.095mol﹒L^-1， pH 6.5，溶劑A)--80%乙 腈(溶劑B),梯度洗脫，條件如下：0-10 min， 100％A; 10.1-12 min，線性梯度100-70％A；12.1-15 min，線性梯度70-50％A；15.1-18 min，線性梯度50-0％A；18.1-20 min，恒梯度0-100％A；20.1-25 min，100％A。流速為0.8 mL/min，柱溫40 ?C，進樣量10 uL，檢測波長270 nm。

4.2 標準曲線及方法學驗證；標準曲線繪制：配制1mg/Ml ALE對照品溶液備用。加入蒸餾水將對照品溶液分別稀釋成1.0、5.0、25.0、50.0、100.0、200.0和250.0μg/mL后,衍生化后注入液相色譜儀測定。結果表明標準曲線方程為 標準曲線方程為y = 0.0032x + 0.0164，R2 = 0.999。阿侖膦酸鈉對照品 HPLC 圖譜如圖 1 所示。

4.3包封率和載藥量測定。

取實施例 1 的固體脂質納米粒混懸液 于Millipore（分子截留量 10,000 Da）離心超濾管上端，4000 rpm 離心15min，取下端溶液，衍生化后采用 HPLC-UV 測定外水相中游離藥物的含量。按照下列公式計算納米粒的包封率和載藥量，其測定結果表明所制得的阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒平均包封率為 62.65%，載藥量大于 4%。

包封率 =(W 總 一 W 游離 )/W 總 X100%；

載藥量 =(W 總 一 W 游離 )/W 載體 X100%；

其中，W 總 是藥物的總重量，W 游離 是未包進納米粒中的藥物的重量，W 載體 是納米粒中載體的重量。

實施例 5 阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的粒徑和電位的測定；所制阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的粒徑及電位均由南昌大學分析測試中心測定。結果如圖 2 和圖 3 所示。

實施例 6 阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的穩(wěn)定性考察。

6.1 評價指標；

1） 外觀 ：肉眼觀察不同取樣點的脂質體樣品，按以下標準進行評價 ：a. 無沉淀；b. 有少許絮凝，稍振搖可復原；c. 不可逆沉淀。

2） 包封率 ：包封率是評價脂質體制劑質量好壞的重要指標，同時脂質體在貯存過程中易發(fā)生滲漏，因此包封率的監(jiān)測十分必要。

3） 粒徑 ：脂質體粒子的表面自由能大，貯存過程中，粒子有自發(fā)的聚集傾向，使粒徑增大。

6.2 穩(wěn)定性加速試驗；我們在 25℃下進行穩(wěn)定性加速試驗。將 A-SLN 混懸液置于安瓿瓶中，于 25℃避光條件下保存，分別于 0，0.5，1，1.5，2 月定時取樣，按上述穩(wěn)定性考察項目進行測定。結果表明，ALE-SLN 液隨著放置時間的延長，制劑中粒徑增大不明顯，包封率有所降低，顏色漸漸加深成牛奶白色。

實施例 7 阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的體外釋放實驗

取5mL新制ALE-SLN和阿侖膦酸鈉溶液劑分別轉入處理好的透析袋中，置入內含100mL生理鹽水溶液的錐形瓶中，37±1℃磁力攪拌，轉速100-150 r/min。分別于0.5、l、2、4、6、8、10、12、14、24、36、48h取樣5mL（及時補充同溫生理鹽水溶液5mL）。 所得樣品衍生化后，色譜圖記錄，計算已釋放藥物量；另取新制ALE-SLN 0.5mL，加入4.0mL無水乙醇，加熱破壞后離心，取上清液，衍生化后進樣，計算總藥量。并根據已釋放藥量和總藥量計算累積釋放率(Q)。以Q對時間（t）作圖。

體外釋放結果表明：ALE-SLN在2h、4h、10h阿侖膦酸鈉累計釋放率分別為44.8%、62.14%、79.51%，且ALE-SLN 的釋放曲線明顯比ALE溶液劑的緩慢持久，即說明ALE-SLN在體外具有良好的緩釋性。

實施例 8 阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的在大鼠體內的藥代動力學研究

8.1 動物實驗

選取健康雌性 SD 大鼠 30 只，平均分為兩組，分別以 4.5 mg/kg 劑量單次口服給與阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒和阿侖膦酸鈉溶液劑。分別收集時間點 3、6、9、12、15、24、36、48h的尿液。尿液收集后立即5000 r·min^-1離心5min，取上清，記錄實際體積置于-20℃冰箱備用。

8.2 尿樣處理

取出凍存?zhèn)溆玫哪蛞簶悠?，自然溫度下解凍后，?800μl 于離心管內，加入甲醇3.2 mL以沉淀蛋白質，漩渦振蕩、超聲約2 min，于8000 r·min^-1離心5 min，取上清。真空離心烘干后，用200.0 μL蒸餾水復溶，過預先用水活化后的SPE柱，棄去濾液；SPE柱再用5%甲醇1.0 mL洗脫，棄去濾液；然后再用40%甲醇1.0 mL洗脫，收集濾液，烘干。用200.0 μL水復溶后，往每個離心管中分別準確加入20.0 μL二氨基庚二酸內標溶液，100.0 μL三乙胺乙腈溶液，100.0 μL異硫氰酸苯酯乙腈溶液，渦旋混勻，靜置1h，然后加入800.0 μL正己烷，振搖后放置10min，取下層溶液，用0.45 μm濾膜過濾，進樣10.0 μL。采用 Agilent 1260 HPLC 測定各時間點阿侖膦酸鈉含量。

8.3 口服生物利用度比較

口服阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的尿液累計排泄量均高于口服溶液劑的累計排泄量。二者尿液排泄動力學曲線如圖 6。采用 DAS 2.0 計算各藥代動力學參數。阿侖膦酸鈉溶液劑的生物利用度為 4.7%，阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒的生物利用度為12.6%，二者代謝均符合單室模型。結果說明，相對阿侖膦酸鈉溶液劑，阿侖膦酸鈉固體脂質納米粒能顯著提高阿侖膦酸鈉在體內的濃度和生物利用度。