本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域。更具體地，涉及哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)合用藥在治療胃癌和結直腸癌方面的應用。

背景技術：

胃癌和腸癌是世界范圍內常見的胃腸道腫瘤，在我國各種惡性腫瘤中居首位，是全球范圍內致人死亡的主要病因之一，并且臨床治療存在很大的困難。

研究表明，合適的聯(lián)合用藥能夠發(fā)揮協(xié)同增效的作用，實現(xiàn)更好的治療目的。但是，藥物品種偏多，不同藥物之間的相互作用也是各不相同的，配合不好甚至可能影響藥物療效或毒性增加。因此，癌癥治療方面的聯(lián)合用藥藥物的篩選研究具有重要的意義。

哌克昔林是一種鈣離子通道拮抗劑，具有抑制Ca2+內流作用，能舒張血管平滑肌，明顯擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量，對心絞痛效果較好，臨床主要用于治療心絞痛。同時臨床上也用于室性心律失常，尤其是對其他抗心律失常藥無效的患者，本品往往能奏效。進一步研究發(fā)現(xiàn)，哌克昔林還可以抑制細胞內脂肪酸的分解代謝及促進自噬，有研究表明，哌克昔林可以在一定程度上殺死白血病細胞。目前，未見有哌克昔林應用于胃癌和腸癌等其他疾病領域的報道。

另外，奧沙利鉑是一類鉑類抗癌藥，目前也未見有哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)用的相關研究和報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有胃癌和腸癌治療藥物的不足以及哌克昔林應用的局限，提供一種新的抗胃癌和腸癌用藥方案。

本發(fā)明的目的是提供哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)用在制備防治胃癌和/或腸癌的藥物方面的應用。

本發(fā)明另一目的是提供一種包含有哌克昔林和奧沙利鉑的治療胃癌和/或腸癌的藥物。

本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明研究顯示，哌克昔林對胃癌和結直腸癌具有很好的防治效果，因此可應用于胃癌和結直腸癌的防治。而且進一步研究顯示，哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)用可以實現(xiàn)對胃癌和/或腸癌的協(xié)同增效治療作用，顯著提高對胃癌和/或腸癌的治療效果。

因此，哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)用在制備防治（包括預防和/或治療）胃癌和/或腸癌的藥物方面的應用，都在本發(fā)明的保護范圍之內。

其中，優(yōu)選地，所述腸癌為結直腸癌。

優(yōu)選地，所述胃癌為Ι到Ⅳ期胃癌。

更優(yōu)選地，所述胃癌為Ⅳ期胃癌。

更優(yōu)選地，所述結直腸癌為Ι到Ⅳ期結直腸癌。

更優(yōu)選地，所述結直腸癌為Ⅳ期結直腸癌。

另外，所述治療胃癌和/或腸癌的藥物是指抑制胃癌細胞和/或腸癌細胞的生長、增殖和/或克隆形成能力，抑制胃癌細胞和/或腸癌細胞的侵襲和/或轉移，和/或誘導胃癌細胞和/或腸癌細胞的凋亡的藥物。

優(yōu)選地，所述胃癌細胞為人胃癌細胞HGC27或MGC803；所述腸癌細胞為人結腸癌細胞HCT 116或人結腸腺癌細胞DLD-1。

一種包含有哌克昔林或其鹽、以及奧沙利鉑的防治胃癌和/或腸癌的藥物，也在本發(fā)明的保護范圍之內。

進一步地，所述藥物還可以包括其藥學上可接受的載體等。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次公開了哌克昔林及其鹽對胃癌和結直腸癌的治療作用，能夠顯著抑制胃癌和結直腸癌細胞的生長和增殖，誘導胃癌和結直腸癌細胞的凋亡，并抑制其轉移，對結胃癌和直腸癌具有顯著的療效，可應用于胃癌和結直腸癌的防治方面。同時，首次研究證明了哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)合用藥對胃癌和結直腸癌具有更顯著的治療效果，實現(xiàn)了協(xié)同增效的作用。

本發(fā)明提供了哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)合用藥治療胃癌和結直腸癌的新方案，不僅為胃癌和結直腸癌的治療提供了一種新的治療藥物和治療途徑，還為哌克昔林的應用提供了新的領域。

附圖說明

圖1為哌克昔林處理胃癌和結直腸癌細胞后存活細胞比例。

圖2為哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞成瘤的影響。

圖3為哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞增殖影響。

圖4為哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞轉移的影響。

圖5為哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞侵襲的影響。

圖6為哌克昔林單用或聯(lián)合奧沙利鉑處理胃癌和結直腸癌細胞后存活細胞比例。

具體實施方式

以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1 哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞及其成瘤的影響

1、實驗材料

（1）藥物：哌克昔林在臨床上常用其馬來酸鹽，本實施例以馬來酸哌克昔林為實驗藥物。

馬來酸哌克昔林的化學結構式如下所示：

（2）癌細胞：

胃癌細胞：人胃癌細胞HGC27和MGC803；

結直腸癌細胞：人結腸癌細胞HCT 116和人結腸腺癌細胞DLD-1。

（3）市購的細胞凋亡試劑盒。

2、實驗分組

（1）對照組：空白對照，即癌細胞不經(jīng)過任何藥物處理。

（2）實驗組：使用馬來酸哌克昔林處理癌細胞。

3、流式細胞術檢測馬來酸哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞凋亡的影響

（1）我們在十二孔板中鋪好結直腸癌細胞，待其貼壁后，加入0μM（即對照）、3μM、4μM（或5μM）的馬來酸哌克昔林處理細胞24h，然后通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

具體方法如下：

1）將對數(shù)生長期的HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞用胰酶消化后，取1~2×10⁵細胞均勻鋪到十二孔板中。

2）待細胞貼壁后，更換成含有不同濃度馬來酸哌克昔林的培養(yǎng)基，孵育24h。

3）消化細胞之后，根據(jù)凋亡檢測試劑盒的方法處理細胞，Annexin V和PI染色完成之后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

（2）實驗結果

結果如圖1所示，圖1中顯示的百分比為Annexin V和PI雙陰性（即存活細胞）比例，使用馬來酸哌克昔林處理后，胃癌和結直腸癌細胞的死亡數(shù)明顯增加，表明哌克昔林能夠誘導胃癌和結直腸癌細胞凋亡。

4、馬來酸哌克昔林對成瘤的影響

（1）在六孔板中鋪好胃癌和結直腸癌細胞，待其貼壁后，加入0μM 、1μM 和2μM 馬來酸哌克昔林處理胃癌和腸癌細胞，觀察馬來酸哌克昔林對HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞克隆形成的影響。

具體方法如下：

1）取對數(shù)生長期的HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞，用胰酶將細胞消化，取每孔500個細胞均勻鋪到六孔板中。

2）待細胞貼壁后，更換含有不同濃度馬來酸哌克昔林的培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃培養(yǎng)箱中孵育細胞。

3）孔板中的出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，用PBS小心清洗。

4）甲醇固定后用結晶紫染色，在空氣中風干。

5）倒置顯微鏡中拍照。

（2）實驗結果

結果如圖2所示，胃癌和結直腸癌細胞經(jīng)過馬來酸哌克昔林處理后，克隆形成數(shù)目明顯下降，表明哌克昔林可以顯著抑制胃癌和結直腸癌細胞成瘤。

實施例2 哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞增殖的影響

1、實驗材料

（1）藥物：同實施例1。

（2）癌細胞：同實施例1。

（3）市購的MTS試劑盒。

2、通過MTT方法檢測馬來酸哌克昔林處理后HGC27和MGC803細胞，以及HCT 116和DLD-1細胞活性

（1）在96孔板中鋪好胃癌和結直腸癌細胞，待其貼壁后，加入含有0μM 、5μM、10μM、20μM馬來酸哌克昔林的培養(yǎng)基處理細胞，然后在24h、48h、72h通過MTT方法檢測HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞活性。

具體方法如下：

1）將對數(shù)生長期的HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞用胰酶消化后，取4×10³細胞均勻鋪到96孔板中。

2）待細胞貼壁后，更換含有不同濃度馬來酸哌克昔林的培養(yǎng)基。

3）加入藥物24h、48h、72h后，按1:10比例加入MTS試劑，37℃孵育2h后，用酶標儀檢測490nm吸光值。

（2）實驗結果

結果如圖3所示，胃癌和結直腸癌細胞經(jīng)過馬來酸哌克昔林處理后，細胞活性明顯下降，表明哌克昔林可以顯著抑制胃癌和結直腸癌細胞增殖。

實施例3 哌克昔林對胃癌和結直腸癌細胞轉移的影響

1、實驗材料

（1）藥物：同實施例1。

（2）胃癌細胞：同實施例1。

（3）有預包被基質膠和無預包被基質膠的Transwell小室。

2、通過Transwell小室檢測馬來酸哌克昔林處理后，對HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞侵襲和遷移的影響

（1）在六孔板中鋪好胃癌和結直腸癌細胞，待其貼壁后，加入0μM 、3μM 和4μM （或5μM）馬來酸哌克昔林處理胃癌細胞48h，加入0μM、4μM和6μM馬來酸哌克昔林處理腸癌細胞48h，再通過Transwell小室檢測馬來酸哌克昔林處理后HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞侵襲和遷移的影響。

具體方法如下：

1）將對數(shù)生長期的HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞用胰酶消化后，取6×10⁵細胞均勻鋪到六孔板中。

2）待細胞貼壁后，更換含有不同濃度馬來酸哌克昔林的培養(yǎng)基。

3）加入藥物處理后，胰酶消化細胞，PBS清洗后，用無血清培養(yǎng)基重懸計數(shù)。

4）取200μl細胞懸液，分別含有細胞數(shù)為1×10⁵加到無預包被基質膠和有包被基質膠的Transwell上室，在下室中加入600μl含100%血清的培養(yǎng)基。

5）37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞48h，取出小室，甲醇固定后用結晶紫染色，用棉簽去除上室中殘余細胞后，在空氣中風干。

6）倒置顯微鏡中拍照。

（2）實驗結果

結果如圖4和圖5所示，胃癌和結直腸癌細胞經(jīng)過馬來酸哌克昔林處理后，遷移和侵襲到下室中的細胞數(shù)目明顯下降，表明哌克昔林可以顯著地抑制胃癌和結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力，且該抑制效果呈濃度依賴性。

實施例4 馬來酸哌克昔林和奧沙利鉑聯(lián)合用藥

1、實驗材料

（1）藥物：馬來酸哌克昔林、奧沙利鉑。

（2）胃癌細胞：人胃癌細胞HGC27和MGC803；結直腸癌細胞：人結腸癌細胞HCT 116和人結腸腺癌細胞DLD-1。

（3）市購的細胞凋亡試劑盒。

2、實驗分組

（1）對照組：空白對照，即胃癌和結直腸癌細胞不經(jīng)過任何藥物處理。

（2）單獨用藥組1：使用馬來酸哌克昔林處理胃癌和結直腸癌細胞。

（3）單獨用藥組2：使用奧沙利鉑處理胃癌和結直腸癌細胞。

（4）聯(lián)合用藥組：先后使用奧沙利鉑和馬來酸哌克昔林處理胃癌和結直腸癌細胞。

3、流式細胞術檢測馬來酸哌克昔林、奧沙利鉑和兩者聯(lián)用對胃癌和結直腸癌細胞凋亡的影響

（1）在十二孔板中鋪好胃癌和結直腸癌細胞，待其貼壁后，加入0μM（即對照）和20μM（胃癌）、40μM（腸癌）的奧沙利鉑，24h后再加入4μM的馬來酸哌克昔林，兩者聯(lián)用處理細胞24h，然后通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況。

具體方法如下：

1）將對數(shù)生長期的HGC27和MGC803細胞、HCT 116和DLD-1細胞用胰酶消化后，取1~2×10⁵細胞均勻鋪到十二孔板中。

2）待細胞貼壁后，更換成含有0μM和20μM奧沙利鉑的培養(yǎng)基孵育胃癌細胞；更換含有0μM和40μM奧沙利鉑的培養(yǎng)基孵育腸癌細胞。孵育24h后再加入含4μM馬來酸哌克昔林的培養(yǎng)基共同孵育24h。

3）消化細胞之后，根據(jù)凋亡檢測試劑盒的方法處理細胞，Annexin V和PI染色完成之后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

（2）實驗結果

結果如圖6所示，圖6中顯示的百分比為Annexin V和PI雙陰性（即存活細胞）比例，哌克昔林或奧沙利鉑均可以殺傷一定比例的胃癌和結直腸癌細胞，而兩者聯(lián)合用藥組的存活細胞比例顯著減少。

結果表明，在奧沙利鉑使用基礎上加用哌克昔林，相對于單獨用藥組能更顯著地誘導胃癌和結直腸癌細胞的凋亡，顯示了哌克昔林與奧沙利鉑協(xié)同聯(lián)合使用顯著提高了胃癌和結直腸癌的治療效果，實現(xiàn)了協(xié)同增效的治療作用。