本發(fā)明涉及藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種委陵菜酸在制備抗缺氧藥物中的應用。

背景技術(shù)：

細胞是人體的結(jié)構(gòu)和功能單位。人體結(jié)構(gòu)的老化，首先表現(xiàn)為細胞的衰老和細胞數(shù)量的減少。當細胞減少到一定數(shù)量時，就會使器官功能下降，甚至危及生命。21世紀的人體保健目標，就是要保護細胞，改善細胞代謝，增強細胞的抗病能力。由于空氣中氧氣不足(高原缺氧)或人體自身的生理、病理原因而不能攝入足夠的氧，或細胞不能充分利用氧氣(亞健康缺氧)，均可引起人體代謝、生理功能或形態(tài)上的改變，這種狀態(tài)就是缺氧(anoxia)。急性或嚴重缺氧常出現(xiàn)呼吸困難、皮膚和黏膜發(fā)紺、精神異常，甚至意識喪失或昏迷：慢性缺氧常表現(xiàn)乏力、頭痛、眩暈、面色蒼白、食欲不振等癥狀；當人體細胞含氧量低于正常值的65％時，缺氧細胞甚至易癌變，導致癌癥。

目前臨床對于人體亞健康性缺氧多采用各種中藥復方保健品用于抗缺氧。通常有紅景天、冬蟲夏草、銀杏、沙棘、黨參、黃芪、茯苓、人參、唐古特青蘭、刺五加、靈芝、枸杞等等中藥及其有效成分的復方制劑。對于高原缺氧常用的抗缺氧藥物包括以紅景天提取物為主的復方制劑；復方丹參片或復方丹參滴丸；21金維他；由地塞米松、氨茶堿和安定制成的化學藥復方制劑高原康等。乙酰唑胺是FDA批準的單一成分的抗高原缺氧藥物。上述藥物中中藥復方通常起效慢，服用時間長，適用于亞健康的保健調(diào)理，但對于高原缺氧尤其是急性高原缺氧作用不理想。而化學合成藥的使用往往會在抗缺氧的同時帶來其他副作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種委陵菜酸在制備抗缺氧藥物中的應用。本發(fā)明制備的藥物具有良好的臨床應用前景，制備得到的抗缺氧藥物能夠?qū)崿F(xiàn)缺氧類疾病的治療。

本發(fā)明提供了一種委陵菜酸在制備抗缺氧疾病藥物中的應用。

優(yōu)選的是，所述抗缺氧疾病包括心肌缺氧導致的胸悶、氣短、心絞痛；腦缺氧所致的頭暈、頭痛；高原缺氧性腦水腫、高原缺氧性肺水腫。

優(yōu)選的是，所述藥物的劑型包括片劑、膠囊、糖漿劑和顆粒劑。

優(yōu)選的是，所述藥物還包括輔料，所述輔料包括淀粉、乳糖、蔗糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、微粉硅膠、乙醇、檸檬酸、苯甲酸鈉、香精和色素。

優(yōu)選的是，所述藥物的劑量為0.8～2.4mg/kg。

本發(fā)明提供了一種委陵菜酸在制備抗缺氧藥物中的應用。本發(fā)明制備的藥物可通過提高機體抗氧化能力，改善細胞呼吸功能，其抗缺氧起效劑量小，且在細胞及整體動物均未觀察到明顯的毒性作用，可用于緩解和治療缺氧導致的機體不適和病變，尤其適用于高原缺氧導致的高原反應和臟器損傷。具有良好的臨床應用前景，制備得到的抗缺氧藥物能夠?qū)崿F(xiàn)缺氧類疾病的治療。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明制備的藥物能夠顯著減輕急性低壓缺氧大鼠腦水腫，對內(nèi)皮細胞和心肌細胞缺氧損傷亦具有顯著的保護作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例7提供的委陵菜酸對缺氧心肌細胞代謝活力的影響結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實施例7提供的委陵菜酸對缺氧心肌細胞LDH外漏影響結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實施例7提供的委陵菜酸對缺氧心肌細胞SOD活性影響結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明實施例7提供的委陵菜酸對缺氧心肌細胞MDA影響結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明實施例7提供的委陵菜酸對缺氧心肌細胞GSH影響結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明實施例7提供的委陵菜酸對缺氧心肌細胞凋亡率的影響結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種委陵菜酸在制備抗缺氧疾病藥物中的應用。

本發(fā)明對所述委陵菜酸的來源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的委陵菜酸的市售產(chǎn)品即可，如購自安徽蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司的委陵菜酸。在本發(fā)明中，所述委陵菜酸的純度優(yōu)選>98％。

在本發(fā)明中，所述抗缺氧疾病包括心肌缺氧導致的胸悶、氣短、心絞痛；腦缺氧所致的頭暈、頭痛；高原缺氧性腦水腫、高原缺氧性肺水腫。

在本發(fā)明中，所述藥物的劑型包括片劑、膠囊、糖漿劑和顆粒劑。本發(fā)明對所述劑型藥物的制備方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的相應劑型的常規(guī)制備方法即可。

在本發(fā)明中，所述藥物還包括輔料，所述輔料淀粉、乳糖、蔗糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、微粉硅膠、乙醇、檸檬酸、苯甲酸鈉、香精和色素中的一種或多種。本發(fā)明對所述輔料的添加量沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各輔料的常規(guī)添加量進行添加即可。本發(fā)明對所述輔料的來源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的上述輔料的市售產(chǎn)品即可。

在本發(fā)明中，所述藥物的劑量為0.8～2.4mg/kg。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的一種委陵菜酸在制備抗缺氧藥物中的應用做進一步詳細的介紹，本發(fā)明的技術(shù)方案包括但不限于以下實施例。

實施例1

以委陵菜酸為原料制成的片劑

將上述配方采用壓片機進行直接壓片，得到片劑。

實施例2

以委陵菜酸為原料制成的膠囊

委陵菜酸 20mg

淀粉 70mg

將上述組分混合，裝入2號膠囊。

實施例3

以委陵菜酸為原料制成的口服糖漿劑：

將上述組分加入水中調(diào)至所需量，混勻后裝瓶即可。

實施例4

以委陵菜酸為原料制成的顆粒劑：

將上述組分混合后加入顆粒機中，制成顆粒后進行包裝。

實施例5

1、方法

體重(20±2)g的昆明小鼠120只，隨機分為對照組、鹽酸普奈洛爾組、委陵菜酸高中低劑量組共6組，灌胃給藥?？瞻讓φ战M給予質(zhì)量濃度為3％的CMC-Na溶液(2ml/Kg)，鹽酸普奈洛爾組給予鹽酸普奈洛爾CMC-Na溶液(20mg/Kg)，委陵菜酸組分別按20mg/Kg、10mg/Kg、5mg/Kg的劑量給予委陵菜酸CMC-Na溶液，給藥體積按2ml/Kg計算。給藥50min后，將小鼠放入125ml廣口瓶中，瓶內(nèi)放置5g鈉石灰，并預先用水校正體積，蓋緊瓶塞，以呼吸停止為標志，記錄小鼠存活時間。

2、結(jié)果

與對照組相比委陵菜酸10mg.Kg^-1、20mg.Kg^-1使小鼠在常壓密閉條件下的存活時間分別延長了28.9％和42.3％，差異具有顯著性(表1)

表1委陵菜酸對缺氧小鼠存活時間的影響(n＝20)

Note:**P<0.01vs對照組；^#P<0.05vs模型組。

實驗結(jié)果表明，委陵菜酸可顯著延長窒息性缺氧小鼠存活時間，具有抗缺氧作用。

實施例2

委陵菜酸對EA.hy926內(nèi)皮細胞缺氧損傷的保護作用研究

1、方法

(1)EA.hy926內(nèi)皮細胞缺氧損傷模型建立EA.hy926內(nèi)皮細胞用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液(培養(yǎng)液含有100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將生長成單層的EA.hy926細胞換無血清無糖的DMEM培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)12小時后，用預先以95％N₂-5％CO₂混合氣飽和30min的D-hanks液替代正常培養(yǎng)基，而后將培養(yǎng)板移入混合氣體培養(yǎng)箱(95％N₂、5％CO₂、O₂濃度＜1％)，于37℃缺氧培養(yǎng)2h。

(2)實驗分組實驗設(shè)空白對照組、缺氧模型組、委陵菜酸高濃度組(1×10^-11mol/L)、委陵菜酸中濃度組(1×10^-12mol/L)和委陵菜酸低濃度組(1×10^-13mol/L)、維拉帕米對照組(1×10^-11mol/L)，共6組，每組8孔。除空白對照組外，其他各組均缺氧處理2h，正常對照組則于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中同步孵育2h。

(3)缺氧損傷內(nèi)皮細胞MTT實驗取出各組樣本，每孔加入20μl MTT(5g/L)，于37℃、5％CO₂孵箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，倒板。加入150μl DMSO振搖15min，使結(jié)晶充分溶解，于測定波長570nm、參考波長630nm處，測定各孔吸光度(OD)值。

(4)生化指標檢測接種于24孔板的EA.hy926內(nèi)皮細胞，缺氧損傷模型組及委陵菜酸干預組缺氧處理2h，正常對照組二氧化碳培養(yǎng)箱同步孵育，取各組細胞培養(yǎng)上清液200μl，按試劑盒說明用比色法測定培養(yǎng)基中LDH活性，細胞內(nèi)MDA含量，SOD、CAT活性和GSH含量。

2、結(jié)果

與正常對照組相比，缺氧損傷模型組內(nèi)皮細胞活力明顯降低，MDA含量明顯增高，GSH含量和SOD、CAT活性明顯下降，LDH外漏增加(P<0.01)；與模型組相比，各濃度委陵菜酸組內(nèi)皮細胞代謝活力、SOD、CAT活性及GSH含量均提高，MDA產(chǎn)生及LDH外漏均減少(P<0.01或P<0.05)。(表3-5)。

表3委陵菜酸對缺氧損傷EA.hy926細胞代謝活力及細胞外LDH活性的影響(x±s,n＝8)

^**P<0.01vs對照組；^#P<0.05，^##P<0.01vs模型組

表4委陵菜酸對缺氧損傷EA.hy926細胞內(nèi)SOD活性及MDA含量的影響(x±s,n＝8)

Note:^**P<0.01vs對照組；^#P<0.05，^##P<0.01vs模型組

表5委陵菜酸對缺氧損傷EA.hy926細胞內(nèi)CAT活性及GSH含量的影響(x±s,n＝8)

Note:^**P<0.01vs對照組；^#P<0.05，^##P<0.01vs模型組

實驗結(jié)果顯示3個劑量委陵菜酸組與模型組相比培養(yǎng)基中LDH活性均明顯降低，細胞內(nèi)SOD，CAT活性和GSH含量均提高，MDA的產(chǎn)生均減少，表明委陵菜酸可在急性缺氧條件下，可通過增強內(nèi)皮細胞清除自由基的能力，對抗缺氧導致的細胞膜氧化損傷，保持內(nèi)皮細胞膜的完整性。

實施例7

委陵菜酸對H9c2心肌細胞缺氧損傷的保護作用研究

1、方法

(1)H9c2心肌細胞缺氧損傷模型建立H9c2心肌細胞37℃培養(yǎng)于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入100IU/L青霉素及100μg/mL鏈霉素。取狀態(tài)良好的H9c2心肌細胞消化后接入平皿中，飽和度達到90％左右，經(jīng)過24h后，以提前低氧處理40min的D-Hank’s液代替正常培養(yǎng)基，然后將細胞立即放入混合氣體培養(yǎng)箱(<1％O₂)中缺氧6h。

(2)實驗分組實驗設(shè)空白對照組(C)、缺氧模型組(M)、委陵菜酸高濃度組(1×10^-10mol/L，T10^-10mol/L)、委陵菜酸中濃度組(1×10^-11mol/L，T10^-11mol/L)和委陵菜酸低濃度組(1×10^-12mol/L，T10^-12mol/L)、維拉帕米對照組(1×10^-10mol/L，W10^-10mol/L)，共6組，每組8孔。除C組外，其他各組均缺氧處理6h，C組則于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中同步孵育6h。

(3)缺氧損傷心肌細胞MTT實驗取出各組樣本，每孔加入20μLMTT(5g/L)，于37℃、5％CO₂孵箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，倒板。加入150μl DMSO振搖15min，使結(jié)晶充分溶解，于測定波長570nm、參考波長630nm處，測定各孔吸光度(OD)值。

(4)生化指標檢測接種于24孔板的H9c2心肌細胞，缺氧損傷模型組及委陵菜酸干預組缺氧處理6h，正常對照組二氧化碳培養(yǎng)箱同步孵育，取各組細胞培養(yǎng)上清液200μL，按試劑盒說明用比色法測定培養(yǎng)基中LDH活性，細胞內(nèi)SOD活性及MDA和GSH含量。

(5)細胞凋亡檢測取對數(shù)生長期細胞用胰酶消化并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為6×10⁵/ml，1ml/孔接種在6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24h后更換1％FBS高糖DMEM 24h，按分組進行缺氧。缺氧結(jié)束后，將細胞收集于EP管中，離心1200rpm，10min，再用培基重懸，離心10min，1200rpm。棄去上清液，用PBS緩沖液洗兩次后加入bindingbuffer，調(diào)整細胞濃度，使之為10⁶個/ml，從中吸取100μL并加入5μLAnnexinⅤ和10μLPI，4℃避光孵育15min后加入400μL bindingbuffer。過300目篩網(wǎng)使之成為單個細胞懸液，采用流式細胞檢測儀檢測。使用FlowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)。

2、結(jié)果

委陵菜酸各濃度組均可提高其缺氧損傷后的心肌細胞活性，各組細胞活力隨委陵菜酸濃度的降低而降低。與正常對照組相比較，缺氧損傷組LDH、MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD、GSH水平降低(P<0.01)，與缺氧損傷組比較，維拉帕米組及委陵菜酸高、中、低濃度組LDH、MDA降低(P<0.01)，SOD、GSH升高，表明各濃度委陵菜酸和維拉帕米均可明顯升高細胞內(nèi)SOD活性及GSH含量。減少缺氧引起的LDH的外漏量，降低MDA含量。1×10^-10mol/L委陵菜酸可顯著降低缺氧心肌細胞的凋亡率。實驗結(jié)果如圖1～6所示(^##P<0.01vs C組；^*P<0.05，^**P<0.01vs M組)，圖1為委陵菜酸對缺氧心肌細胞代謝活力的影響結(jié)果圖；圖2為委陵菜酸對缺氧心肌細胞LDH外漏影響結(jié)果圖；圖3為委陵菜酸對缺氧心肌細胞SOD活性影響結(jié)果圖；圖4為委陵菜酸對缺氧心肌細胞MDA影響結(jié)果圖；圖5為委陵菜酸對缺氧心肌細胞GSH影響結(jié)果圖；圖6為委陵菜酸對缺氧心肌細胞凋亡率的影響結(jié)果圖。

上述實驗結(jié)果表明：委陵菜酸可以通過增加心肌細胞抗氧化酶活性、減少脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，有效抑制缺氧所誘導的心肌細胞凋亡，對心肌細胞缺氧損傷起到保護作用。

經(jīng)一年動物實驗觀察，應用本發(fā)明藥物對動物未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。

以上可看出，委陵菜酸具有顯著的抗缺氧損傷作用，此外動物實驗證實該藥物毒性較低，可以用于制備防治缺氧損傷的藥物。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。