本發(fā)明涉及分子影像學(xué)領(lǐng)域，具體涉及核磁探針領(lǐng)域，特別涉及一種TEM1特異性核磁探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵巢癌是一種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，死亡率高居?jì)D科癌癥首位，由于其發(fā)病隱蔽，臨床癥狀、體征不典型，目前缺乏有效的早期診斷方法。超聲檢查是探查卵巢癌最常用的方法，準(zhǔn)確率高于CT，但成像影響因素較多，如患者體型、腹壁厚薄、腫塊位置深淺、腹水影響等，且常和腸腔混淆，易出現(xiàn)漏診。CT對卵巢腫瘤的定位診斷較好，但除了在診斷囊性畸胎瘤方面準(zhǔn)確度高以外，對于其他卵巢腫瘤的良、惡性鑒別準(zhǔn)確度低于B超。MRI(核磁共振成像)是非損傷性、非輻射性成像方法，但MRI是非特異性的，同時受到磁性納米顆粒大小的影響，而使結(jié)果不穩(wěn)定。

新近發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物(TEM)，其在正常組織中少量表達(dá)或不表達(dá)，能夠成為良好的腫瘤標(biāo)志物。研究證明內(nèi)皮唾液酸蛋白(TEM1/endosialin/CD248)在卵巢癌組織中高表達(dá)，與體內(nèi)其他器官差異明顯。

分子影像探針是現(xiàn)代生物影像技術(shù)發(fā)展的一個重要領(lǐng)域，該技術(shù)的核心是具有細(xì)胞靶向功能的不同種類和大小的分子探針，包括蛋白、抗體、多肽、化學(xué)小分子等?？贵w靶向技術(shù)在腫瘤檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視。然而，抗體由于其分子量大，一方面，在血清中不易被清除，且抗體作為外源性蛋白其免疫原性較大，在體內(nèi)易引發(fā)特異性反應(yīng)；另一方面，抗體分子量大導(dǎo)致其不易進(jìn)入實(shí)體瘤周邊，影響它們與受體的結(jié)合效率，難以獲得足夠的影像對比度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種TEM1特異性核磁探針，其包括通過交聯(lián)劑連接的抗TEM1單鏈抗體和氨基化的SPIO(超順磁氧化鐵)納米顆粒，其中，所述氨基化的SPIO納米顆粒通過酰胺鍵與交聯(lián)劑連接，所述抗TEM1單鏈抗體的C末端為半胱氨酸，并通過硫醚鍵與交聯(lián)劑連接。

在本發(fā)明一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗TEM1單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗TEM1單鏈抗體由SEQ ID NO.2所示的核酸序列編碼。

本發(fā)明的編碼抗TEM1單鏈抗體的核酸，可以根據(jù)其序列通過現(xiàn)有技術(shù)已知的方法合成，如固相亞磷酸酰胺法等。

在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基化的SPIO納米顆粒粒徑為60-120nm，優(yōu)選為70-90nm。

在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，氨基化的SPIO納米顆粒的橫向弛豫率為70-90mM^-1S^-1。

在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑是SMCC或sulfo-SMCC。

在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述TEM1特異性核磁探針含有的鐵離子的濃度為0.15-2.2nM，優(yōu)選0.5-2nM，更優(yōu)選1-1.5nM。

本發(fā)明還提供了一種TEM1特異性核磁探針的制備方法，其包括以下步驟：

(1)合成C末端為半胱氨酸的抗TEM1單鏈抗體，然后進(jìn)行純化及復(fù)性；

(2)合成氨基化的SPIO納米顆粒；

(3)通過交聯(lián)劑連接抗TEM1單鏈抗體和氨基化的SPIO納米顆粒。

本發(fā)明還提供了TEM1特異性核磁探針在制備診斷卵巢癌的試劑中的用途。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含TEM1特異性核磁探針。

本文所使用的術(shù)語“試劑盒”包括本發(fā)明的TEM1特異性核磁探針和使用說明書。該試劑盒能進(jìn)一步包含至少一種另外的試劑。試劑盒通常包括一個標(biāo)簽，簡要地說明了試劑盒內(nèi)容的目的用途。

本發(fā)明提供的TEM1特異性核磁探針特異性好，靈敏度高，無細(xì)胞毒性，由于抗TEM1單鏈抗體的分子量較小，其在血清中易于清除，并且免疫原性較小，在體內(nèi)不易引發(fā)特異性反應(yīng)；另外，抗體分子量較小使其易進(jìn)入實(shí)體瘤周邊，并且與受體的結(jié)合效率很高，能夠獲得足夠的影像對比度。

附圖說明

圖1為構(gòu)建質(zhì)粒的克隆驗(yàn)證的結(jié)果；

圖2為各表達(dá)菌株超聲破碎后的SDS-PAGE結(jié)果；

圖3為不同批次復(fù)性的包涵體蛋白的SDS-PAGE結(jié)果；

圖4為抗TEM1單鏈抗體的親和力檢測結(jié)果；

圖5為氨基化的SPIO納米顆粒的粒徑的DLS測量結(jié)果；

圖6為氨基化的SPIO納米顆粒的橫向弛豫率的測量結(jié)果；

圖7為用Bradford蛋白測定試劑盒建立的檢測NP-linker-78C濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖8為NP-linker-78C飽和曲線的檢測的結(jié)果；

圖9為NP-linker-78C的毒性檢測的結(jié)果；

圖10為NP-linker-78C的親和力檢測的結(jié)果；

圖11為NP-linker-78C的特異性檢測的結(jié)果；

圖12為NP-linker-78C的內(nèi)吞能力檢測的結(jié)果；

圖13為NP-linker-78C的內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果；

圖14為熒光共聚焦的方法驗(yàn)證NP-linker-78C具有內(nèi)吞的效果；

圖15為NP-linker-78C特異性結(jié)合抗原的MRI掃描結(jié)果；

圖16為NP-linker-78C的特異性結(jié)合抗原能力的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行描述，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1載體構(gòu)建與抗TEM1單鏈抗體的表達(dá)、純化與復(fù)性

編碼抗TEM1單鏈抗體的核酸其序列如SEQ ID NO.2所示，3’末端是編碼半胱氨酸(Cys)的密碼子，用限制性內(nèi)切酶Nsi I/Xho I將其克隆到PET302載體上，構(gòu)建成一個完整的質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，鋪板并過夜培養(yǎng)。待平板上長出菌落后提取質(zhì)粒，用外源基因上的一個引物與載體上的另一個引物進(jìn)行PCR，克隆驗(yàn)證的結(jié)果如圖1所示，除了2號克隆沒有特異性的條帶之外，其他克隆均有特異性條帶出現(xiàn)。測序結(jié)果也證明載體構(gòu)建成功。

將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21D3，鋪板并過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，用5ml LB培養(yǎng)基重懸，并置于37℃培養(yǎng)過夜。按1:100的比例將上述5ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到裝有500ml LB培養(yǎng)基的燒瓶內(nèi)，置于37℃搖床中培養(yǎng)2小時。按1:1000的比例加入IPTG誘導(dǎo)(計(jì)算得到IPTG終濃度為1mM)作為誘導(dǎo)組，設(shè)置未加IPTG的對照組，37℃培養(yǎng)2小時。4℃條件下以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集菌體。用40ml EQ緩沖液洗滌一次，并用40ml含8M尿素的EQ緩沖液將菌體配成懸液。將菌體懸液的容器置于冰浴中，采用超聲波破碎，設(shè)置功率40％，破碎時間1秒，間歇時間2秒，運(yùn)行6分鐘，超聲后的對照組菌液作為誘導(dǎo)前蛋白，超聲后的誘導(dǎo)組菌液作為誘導(dǎo)后總蛋白。4℃條件下以最大轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集上清(誘導(dǎo)后可溶性蛋白)和菌體。分別取10μl誘導(dǎo)前蛋白、誘導(dǎo)后總蛋白和誘導(dǎo)后可溶性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見圖2，可以看出誘導(dǎo)后總蛋白里面有大量的誘導(dǎo)蛋白存在，而誘導(dǎo)后可溶性蛋白中卻沒有相應(yīng)的誘導(dǎo)蛋白，證明誘導(dǎo)蛋白以包涵體形式存在。因此按以下步驟進(jìn)行包涵體純化和復(fù)性。

用PBS重懸菌體，加入3ml磁珠液(預(yù)先用10ml EQ緩沖液清洗磁珠)，4℃條件下結(jié)合2小時。用20ml含8M尿素的清洗液洗滌磁珠2次。用3ml含8M尿素的洗脫液洗滌2次，將目的蛋白78C洗脫下來。將2次洗滌后的洗脫液合并共6ml，用含8M尿素的EQ緩沖液定容至25ml。4℃條件下，將上述25ml懸液放置于1L PBS緩沖液中透析過夜。將不同批次復(fù)性的包涵體蛋白(1-12批)進(jìn)行SDS-PAGE，上樣量為5μl或10μl。結(jié)果見圖3，可見蛋白純度較高，幾乎沒有雜質(zhì)存在。利用Millipore公司50ml濃縮管的對蛋白懸液濃縮離心，將蛋白濃度濃縮至1mg/ml。

實(shí)施例2 ELISA檢測抗TEM1單鏈抗體的親和力

用2％明膠為96孔板鋪板，每孔50μl。37℃下孵育30至60分鐘。將MS1-TEM1細(xì)胞(轉(zhuǎn)染了TEM1質(zhì)粒能夠高表達(dá)TEM1蛋白的小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞)加入96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為10⁴-10⁵。37℃培養(yǎng)過夜。利用PBS液洗滌細(xì)胞3次。每孔加入合適濃度(0.0001nM、0.001nM、0.01nM、0.1nM、1nM、10nM、100nM、1mM、10mM)的抗TEM1單鏈抗體，4℃條件下孵育1小時。再次用PBS液洗滌細(xì)胞3次。加入抗His-HRP二抗，4℃條件下孵育1小時。再次用PBS液洗滌細(xì)胞3次。每孔加入100μl TMB液，37℃條件下孵育時間不超過30分鐘。每孔加入100μl終止液，利用bioteck比色儀檢測OD值。圖4顯示了抗TEM1單鏈抗體的親和力檢測結(jié)果，可見抗TEM1單鏈抗體具有極高的親和力，親和常數(shù)達(dá)到3.941nM。

實(shí)施例3 SPIO納米顆粒的合成

取一只250ml燒瓶，在其內(nèi)部放置攪拌子。放入12.5g葡聚糖。加入25ml去離子水，同時準(zhǔn)備好可加熱的攪拌臺(ika RCT基本型加熱磁力攪拌器)，將攪拌器速度設(shè)置為4級。將攪拌器溫度調(diào)節(jié)至120℃，并用鋁箔將封閉燒瓶開口，將燒瓶放置于盛滿二甲硅油的玻璃容器內(nèi)，開啟攪拌器持續(xù)1小時(此步驟也可選擇過夜，同時攪拌器溫度需設(shè)置為75℃-80℃，確保不超過100℃)。1小時后停止加熱待其自然冷卻。用0.22μm的濾器對葡聚糖溶液進(jìn)行過濾，之后讓其混勻過夜。過夜后的葡聚糖溶液經(jīng)氮?dú)?N₂)清洗。清洗過程持續(xù)30分鐘，在前20分鐘過后，在玻璃容器內(nèi)裝滿碎冰。(在燒瓶橡膠蓋上插入2根針管，其中一根連接氮?dú)?，這根針管底部需順著燒瓶壁，并沒入溶液內(nèi)部；另一根連接外部空氣，維持燒瓶內(nèi)部壓力平衡。當(dāng)?shù)獨(dú)膺M(jìn)入時，可以觀察到溶液中出現(xiàn)許多氣泡。)

稱量0.985g FeCl₃及0.366g FeCl₂，分別放入50ml離心管內(nèi)，并且加入6.25ml去離子水。旋轉(zhuǎn)搖動使溶質(zhì)完全融化混勻。隨后用大型注射器將FeCl₃溶液以及FeCl₂溶液注入到含有葡聚糖溶液的燒瓶中，注入時確保注射器頭部進(jìn)入葡聚糖溶液內(nèi)。(注：在稱量氯化鐵時，如果之后需要加其他稀有金屬，氯化鐵的量需減去60mg稀有金屬的質(zhì)量。)新得到混合溶液置于冰上并再次用氮?dú)鈨艋?5至60分鐘。啟動Kds洗脫儀(美國伯樂422型)，在注射器內(nèi)準(zhǔn)備15ml氫氧化銨溶液。氫氧化銨溶液將被加入到步驟7所得的溶液內(nèi)，加入過程遵循以下幾步(因納米顆粒溶液的不穩(wěn)定性，需時刻關(guān)注并及時調(diào)整速率)：(1)將機(jī)器速率調(diào)節(jié)至每3至4分鐘1滴，持續(xù)1小時；(2)將機(jī)器速率調(diào)節(jié)至前一步驟(1)的2倍，持續(xù)30分鐘；(3)將機(jī)器速率調(diào)節(jié)至步驟(1)的3倍，持續(xù)30分鐘；(4)將機(jī)器速率調(diào)節(jié)至步驟(1)的4倍，持續(xù)30分鐘；(5)將機(jī)器速率調(diào)節(jié)至每小時5ml，持續(xù)15分鐘；(6)將速率調(diào)節(jié)至每小時4至5ml，加入準(zhǔn)備好的15ml氫氧化銨溶液。全部結(jié)束后，將裝有溶液的燒瓶移出冰浴，停止氮?dú)鈨艋?。將燒瓶置?0℃干浴1小時。室溫下攪拌過夜。

4℃條件下，以20000g的轉(zhuǎn)速對納米顆粒溶液進(jìn)行離心30分鐘。離心完后，上清轉(zhuǎn)移到100kd MW的超濾離心管(Amicon Ultra Centrifugation tubes)中。4℃條件下，以每分鐘2000轉(zhuǎn)離心過夜。離心過后，納米顆粒將保存在超濾離心管的上部溶液內(nèi)。盡可能將上部所有溶液都收集起來，放入50ml的錐形瓶中。殘留的納米顆?？捎脵幟仕猁}緩沖液轉(zhuǎn)移出來(過濾器底部呈V型處容易有納米顆粒的殘留，可以用移液器吸取5ml檸檬酸鹽緩沖液(氯化鈉35g，脫水檸檬酸鈉23.5g，4L去離子水)對其進(jìn)行吹打，再將溶液全部吸出。對納米顆粒溶液進(jìn)行過濾。過濾系統(tǒng)首先用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗，確保廢液進(jìn)入廢液瓶。先用檸檬酸鹽緩沖液沖洗過濾系統(tǒng)，壓強(qiáng)不能超過20psi。當(dāng)體積達(dá)到25ml的時候，開始將合成好的SPIO納米顆粒加入到檸檬酸緩沖液中。當(dāng)廢液變澄清后，意味著過濾結(jié)束。過濾結(jié)束后，用2L的檸檬酸緩沖液沖洗過濾系統(tǒng)。

實(shí)施例4 SPIO納米顆粒加氨基尾巴

取實(shí)施例3制備的SPIO納米顆粒溶液25ml加入到500ml的三角瓶中，加入25ml的10M NaOH，然后將該混合液體在攪拌器上混勻攪拌10分鐘。10分鐘后，加入50ml的表氯醇，然后用錫箔紙將瓶口封住，接著在攪拌器上攪拌過夜。第二天，將混合液體轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，2000g離心10分鐘。離心后，用玻璃管去掉最上面的表氯醇層，然后將下層的SPIO納米顆粒重新轉(zhuǎn)移到一個新的500ml的三角瓶中。在同一個三角瓶中加入相同體積的氫氧化銨，然后開口攪拌過夜。第二天，將已經(jīng)氨基化的SPIO納米顆粒繼續(xù)在35℃下攪拌過夜，同時將瓶口蓋上錫箔紙。分別用0.45μm以及0.22μm的過濾管將氨基化的SPIO納米顆粒過濾。等氨氣揮發(fā)完后，將氨基化的SPIO納米顆粒重新應(yīng)用過濾系統(tǒng)進(jìn)行過濾和純化，最終所得到的氨基化的SPIO納米顆粒體積需要降低到至多5ml。

實(shí)施例5氨基化的SPIO納米顆粒的表征

取100μl氨基化的SPIO納米顆粒溶液，利用儀器Malvern HPPS5001進(jìn)行動態(tài)光散射(DLS)測量，測3次，取平均值分析氨基化的SPIO納米顆粒的粒徑大小。從圖5可以看出，氨基化的SPIO納米顆粒的粒徑為80nm左右。

利用Bruker(美國)1.4T minispec mq60NMR分析儀檢測氨基化的SPIO納米顆粒的橫向弛豫率(R2)。首先將納米簇樣品按鐵濃度稀釋成不同的濃度，濃度范圍為0.001-10mM，并且恒溫至310K。取0.3mL的溶液于測試管中，采用標(biāo)準(zhǔn)Carr-Purcell-Meiboom-Gill脈沖序列測量其T2弛豫時間。以測得的T2時間為縱坐標(biāo)，鐵濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得到的直線斜率就為樣品的橫向弛豫率。由圖6可知氨基化的SPIO納米顆粒的橫向弛豫率為80.48mM^-1S^-1。

實(shí)施例6氨基化的SPIO納米顆粒與抗TEM1單鏈抗體連接

(1)氨基化的SPIO納米顆粒與交聯(lián)劑sulfo-SMCC的結(jié)合

在100μl的sulfo-SMCC中加入500μg氨基化的SPIO納米顆粒，加水稀釋到sulfo-SMCC終濃度為4.8mg/ml，此時混合液中sulfo-SMCC過量?；旌弦褐糜谑覝叵戮徛鹗幗Y(jié)合30分鐘。脫鹽柱(Thermo)預(yù)先用水清洗2次，以1000g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘。利用結(jié)合緩沖液(PBS)在脫鹽柱中將過量的sulfo-SMCC清除。將混合液緩慢注入脫鹽柱內(nèi)，以1000g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘，收集溶液，即得氨基化的SPIO納米顆粒與sulfo-SMCC的連接體，簡稱NP-linker。

(2)在NP-linker溶液中加入400μg抗TEM1單鏈抗體，室溫下緩慢震蕩結(jié)合2小時，或者4℃過夜。將NP-linker與抗TEM1單鏈抗體的連接體簡稱為NP-linker-78C。

(3)加入100μl濃度為20mM的新鮮配置的半胱氨酸溶液，室溫下緩慢震蕩結(jié)合1小時，封閉sulfo-SMCC上剩余的馬來酰亞胺基團(tuán)。

(4)磁柱(Invitrogen)預(yù)先用結(jié)合緩沖液洗滌2次。

(5)用磁柱純化NP-linker-78C。加入結(jié)合緩沖液和NP-linker-78C到磁柱內(nèi)，離心純化，最終將NP-linker-78C濃度調(diào)至40μg/ml。

實(shí)施例7 NP-linker-78C飽和曲線的檢測

將實(shí)施例6制備的NP-linker-78C等比例稀釋，以氨基化的SPIO納米顆粒作為空白對照，應(yīng)用Bradford蛋白測定試劑盒建立檢測NP-linker-78C濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)。以不同濃度(72μg、200μg、400μg、800μg、1600μg)的抗TEM1單鏈抗體分別加入到500ng氨基化的SPIO納米顆粒中，進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)完成后，應(yīng)用Bradford蛋白測定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測定。由圖8可見，隨著反應(yīng)體系中抗TEM1單鏈抗體濃度的增加，NP-linker-78C濃度也在增加，但是當(dāng)體系中單鏈抗體的濃度達(dá)到800μg時，NP-linker-78C濃度增加的趨勢減緩。

實(shí)施例8 NP-linker-78C的毒性檢測

將對數(shù)期生長的MS1(小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞)、MS1-TEM1(轉(zhuǎn)染了TEM1質(zhì)粒能夠高表達(dá)TEM1蛋白的小鼠胰島內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞按照2×10⁴個/ml的密度接種于96孔板中。培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。將含有不同鐵離子濃度的納米顆粒分別加入到細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)24小時。在每一個孔中加入10μl5mg/ml的MTT，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時。再在每孔中加入100μl DMSO(Sigma-Aldrich)，20分鐘后，在570nm下進(jìn)行檢測。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用軟件One-way ANOVA和Turkey test對所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖9所示，當(dāng)NP-linker-78C中鐵離子濃度小于2.4nM的時候，無論是MS1細(xì)胞還是MS1-TEM1細(xì)胞都沒有出現(xiàn)明顯的降低，即細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯的死亡趨勢；但是當(dāng)鐵的濃度達(dá)到2.4nM的時候，兩種細(xì)胞的細(xì)胞存活率都降低到原來的50％，說明高濃度的磁性納米顆粒具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，因此本發(fā)明的TEM1特異性核磁探針中鐵離子的濃度為0.15-2.2nM，優(yōu)選0.5-2nM，更優(yōu)選1-1.5nM。

實(shí)施例9 NP-linker-78C的親和力檢測

采用ELISA方法進(jìn)行親和力檢測。首先用2％明膠為96孔板鋪板，每孔50μl。37℃下孵育30至60分鐘。將MS1-TEM1細(xì)胞加入96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為10⁴-10⁵。37℃培養(yǎng)過夜。利用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入合適濃度(10^-2nM、10^-1nM、1nM、10nM、100nM、1mM)的NP-linker-78C，4℃條件下孵育1小時。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次。加入抗His-HRP二抗，4℃條件下孵育1小時。再次用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入100μl TMB，37℃條件下孵育時間不超過30分鐘。每孔加入100μl終止液，利用bioteck比色儀檢測OD值。通過上述細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)檢測出當(dāng)反應(yīng)體系中含有200μg的單鏈抗體時，最終NP-linker-78C的親和力為196.8nM(圖10A)，當(dāng)反應(yīng)體系中含有400μg的單鏈抗體時，NP-linker-78C的親和力為56.72nM(圖10B)。

實(shí)施例10 NP-linker-78C的特異性檢測

在細(xì)胞長滿的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入6ml維爾烯(versene)溶液，37℃下消化10分鐘。加入6ml的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。用7ml流式緩沖液(FACS緩沖液)重懸細(xì)胞，緩慢吹打混勻，按每管1ml分裝入7只流式管中。每管加入2ml緩沖液混勻后，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。加入用流式緩沖液稀釋的濃度為50mM的抗體100μl。4℃條件下(避免抗體被細(xì)胞內(nèi)吞)孵育結(jié)合1小時。加入3ml緩沖液混勻，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。再次用3ml緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源His抗體，4℃條件下孵育結(jié)合1小時。加入3ml緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源APC抗體，4℃條件下孵育結(jié)合1小時。加入3ml緩沖液洗滌2次。加入300μl vial死細(xì)胞探針溶液，上機(jī)。由圖11可以看出，NP-linker-78C保持了其特異性結(jié)合抗原的能力，而氨基化的SPIO不與抗原結(jié)合，因此可以排除抗原與NP-linker-78C的結(jié)合是由于納米顆粒的粘附等作用。

實(shí)施例11 NP-linker-78C的內(nèi)吞能力檢測

準(zhǔn)備2塊24孔板，將蓋玻片放入24孔板的每孔中。每孔加入2×10⁴個細(xì)胞過夜培養(yǎng)。每孔中加入預(yù)先結(jié)合好的鼠源His抗體和鼠源APC抗體，2塊24孔板分別置于37℃和4℃下孵育2小時使細(xì)胞與抗體結(jié)合。用PBS洗滌3次。每孔加入100μl濃度為1％的甲醛，常溫孵育30分鐘。用PBS洗滌3次。37℃條件下，用100μl濃度為5％的胎牛血清(BSA)封閉1小時。每孔加入100μl細(xì)胞膜綠色熒光探針(DIOc18(3))并孵育30分鐘，DIOc18(3)的終濃度為10μg/ml。用PBST洗滌3次，每次10分鐘。每孔加入100μl DAPI室溫孵育5分鐘，DAPI的終濃度為0.1μg/ml。用PBST洗滌3次，每次10分鐘。用3μl甘油封片。通過圖12可以看出，NP-linker-78C仍然保持內(nèi)吞的作用。圖13是對三次實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析，證明NP-linker-78C具有內(nèi)吞的作用。

本實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)用了熒光共聚焦的方法驗(yàn)證NP-linker-78C具有內(nèi)吞的效果。首先是將相應(yīng)的抗體預(yù)反應(yīng)，然后分別在4℃和37℃的條件下與相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)，通過圖14結(jié)果，可以明顯看到，37℃條件下，細(xì)胞內(nèi)部由很多的熒光信號，而在4℃條件下，細(xì)胞內(nèi)部沒有相應(yīng)的熒光信號，再次證明，NP-linker-78C具有內(nèi)吞的效果。

實(shí)施例12 MRI的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測

在細(xì)胞(MS1，MS1-TEM1)長滿的75cm²細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入6ml維爾烯(versene)溶液，37℃下消化10分鐘。加入6ml的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。用7ml流式緩沖液(FACS緩沖液)重懸細(xì)胞，緩慢吹打混勻，按每管1ml分裝入7只流式管中。每管加入2ml FACS緩沖液混勻后，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。加入100μl用FACS緩沖液稀釋的濃度為50mM的氨基化的SPIO和NP-linker-78C。37℃條件下孵育結(jié)合1小時。加入3ml緩沖液混勻，以每分鐘2000轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄上清。再次用3ml緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源His抗體，4℃條件下孵育結(jié)合1小時。加入3ml緩沖液洗滌2次。每管加入100μl的鼠源抗體APC，4℃條件下孵育結(jié)合1小時。加入3ml緩沖液洗滌2次。將洗好后的細(xì)胞用PBS重懸，放入到細(xì)胞MRI專用的板子中。

應(yīng)用細(xì)胞團(tuán)(cell pellet)實(shí)驗(yàn)對NP-linker-78C的特異性在MRI水平上進(jìn)行檢測。將NP-linker-78C和未結(jié)合NP-linker的抗TEM1單鏈抗體分別與細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合，在37℃的條件下反應(yīng)，然后將細(xì)胞通過離心與洗脫的方式去掉沒有與細(xì)胞結(jié)合的抗TEM1單鏈抗體，再將剩余的細(xì)胞放入到其相對應(yīng)的細(xì)胞板上，再放入MRI儀器進(jìn)行檢測。未結(jié)合抗TEM1單鏈抗體的SPIO納米顆粒作為陽性對照，在該實(shí)驗(yàn)中，陰性為亮色，顏色越深，表明結(jié)合到細(xì)胞上的磁性納米顆粒越多，圖15為相應(yīng)的MRI結(jié)果圖，圖16為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析，由該結(jié)果可以看出，NP-linker-78C具有特異性結(jié)合抗原的性質(zhì)，同時該性質(zhì)在MRI檢測水平上同樣被檢測到。

本文中應(yīng)用了具體實(shí)施例對本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)。

序列表

<110> 天津醫(yī)科大學(xué)

<120> TEM1特異性核磁探針及其應(yīng)用

<130> PP169733

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗TEM1單鏈抗體的編碼序列

<400> 1

gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt aaactttaag aaggagatat 60

acatatgcat catcatcacc atcaccatgt ccagcctgtg ctgactcagc caccttccct 120

ctctgcatct cctggagcat cagccagtct cacctgcacc ttacgcagtg acatcaatgt 180

tggttcctac aggatatcct ggtaccagca gaagccaggg agtcctcccc agtatctcct 240

gagctacaaa tcagactcag ataagcagaa gggctctgga gtccccagcc gcttctctgg 300

atccaaagat gcttcggcca atgcagggat tttactcatc tctgggctcc agtctgagga 360

tgaggctgac tattattgta tgatttggca caacagcgct ggggtgttcg gcgggggcac 420

caagctgacc gtcctaggcg gtggttcctc tagatcttcc tcctctggtg gcggtggctc 480

gggcggtggt gggcaggtgc agctgcagga gtcgggggga accttggtac agcctggggg 540

gtccctgaga ctctcttgtg aagcctctgg attcaccttt agcaactatg ccatgggctg 600

ggtccgccag actccaggaa aggggctgga gtggctgtcg gctattcgta aaagtggcac 660

taccacatac tacgcggact ccgtgaaggg ccggttcatc atctccagag acaattccaa 720

gaacaccctg tatctgcaaa tgaataggct gagagtcggc gacacggcca cttattactg 780

tgcgactcac cccatcgcgg gctactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctccgg 840

aggttcttgc tagctcgaga tcgatgatat tcgagcctag gtataatcgg atccggctgc 900

taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccac 939

<210> 2

<211> 262

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His His His His His His His Val Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro

1 5 10 15

Pro Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr

20 25 30

Leu Arg Ser Asp Ile Asn Val Gly Ser Tyr Arg Ile Ser Trp Tyr Gln

35 40 45

Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu Leu Ser Tyr Lys Ser Asp

50 55 60

Ser Asp Lys Gln Lys Gly Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

65 70 75 80

Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Ile Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln

85 90 95

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Asn Ser Ala

100 105 110

Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Thr Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

145 150 155 160

Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala

165 170 175

Met Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ser

180 185 190

Ala Ile Arg Lys Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

195 200 205

Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

210 215 220

Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Thr His Pro Ile Ala Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

245 250 255

Ser Ser Gly Gly Ser Cys

260