本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載化學抗腫瘤藥物和anti-fas抗體智能型納米載藥體系的制備方法，實現(xiàn)免疫治療-化學藥物治療聯(lián)合的智能型納米載藥體系的制備工藝。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是嚴重威脅人類的重大疾病，目前的治療方法主要包括手術(shù)治療、藥物治療、放射治療，其中藥物治療包括常規(guī)化學藥物治療、靶向藥物治療、以及新興的免疫治療。作為腫瘤治療重要的組成部分，常規(guī)化學藥物治療在延長生命、改善健康方面發(fā)揮了重要的作用。但常規(guī)化學藥物如阿霉素，在殺傷腫瘤細胞的同時，對人體正常細胞造成可逆或不可逆性損傷，表現(xiàn)為一系列的毒副反應(yīng)，包括消化道反應(yīng)、骨髓抑制、器官毒性、神經(jīng)毒性等，嚴重阻礙了化療藥物在臨床上的應(yīng)用。

納米技術(shù)可以與抗腫瘤藥物相結(jié)合，包載化療藥物的納米顆粒腫瘤滲透滯留效應(yīng)強，可增加常規(guī)化療藥物在腫瘤組織中的聚集，即化療藥物“被動靶向性”增強；同時通過在納米顆粒上連接抗體、肽鏈等配體介導胞吞作用達到化療藥物“主動靶向性”，進一步減少對正常組織的毒副作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)是一大類和細胞外基質(zhì)降解有關(guān)的鋅指內(nèi)肽酶。腫瘤細胞通過旁分泌促進基質(zhì)細胞分泌,并募集mmps到腫瘤細胞周圍。由于腫瘤的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移必須首先突破腫瘤原發(fā)部位的細胞外基質(zhì)，因此，可降解基質(zhì)的mmps在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、特別是侵襲和轉(zhuǎn)移中，扮演了重要的角色。mmps家族中，mmp-2和mmp-9可降解明膠蛋白，ⅳ型、ⅴ、ⅶ和?型膠原，纖維黏連蛋白、層黏連蛋白等，在腫瘤的生長、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中有重要的地位。針對mmp-2和mmp-9的藥物設(shè)計，對于腫瘤的靶向治療，進一步提高抗癌藥物在腫瘤部位的療效以及降低其對機體的毒副作用有著重要的意義。

免疫治療是通過增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞識別和(或)細胞毒性作用達到治療目的。fas-fasl通路介導凋亡是免疫系統(tǒng)中及其重要的一種調(diào)節(jié)機制，細胞毒淋巴細胞(ctl)識別靶細胞后，細胞表面表達高水平fasl與靶細胞表面的fas相互識別，通過fas-fasl通路觸發(fā)靶細胞內(nèi)部的凋亡程序，使靶細胞發(fā)生程序性細胞死亡。fas-fasl通路在腫瘤細胞的凋亡和免疫逃逸的過程發(fā)揮重要的作用，可通過fas-fasl通路實現(xiàn)抗腫瘤治療。目前多采用抗體技術(shù)解除t細胞的制動器，或體外對t細胞進行基因修飾增強t細胞表面的fasl表達。這些技術(shù)復雜、適用面窄、費用昂貴，臨床應(yīng)用局限。因fas抗原在人體各組織中分布廣泛，為非特異性抗原分子，直接采用外源性anti-fas抗體(類內(nèi)源性fasl)或水溶性fasl(sfasl)將導致體內(nèi)正常的免疫系統(tǒng)遭受破壞，產(chǎn)生免疫性疾病。

因此，本發(fā)明設(shè)計了一種新型智能型的納米藥物載體，通過與腫瘤微環(huán)境中mmps響應(yīng)可程序性地在腫瘤組織中釋放anti-fas抗體及小分子抗腫瘤藥物，增強藥物的腫瘤靶向性，同時通過fas-fasl通路及化學抗腫瘤藥物聯(lián)合作用增強抗腫瘤效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種實現(xiàn)與腫瘤微環(huán)境中mmps響應(yīng)，程序性、持續(xù)性地在腫瘤組織中釋放anti-fas抗體及小分子抗腫瘤藥物，增強藥物的腫瘤靶向性及抗腫瘤效果，集納米載藥可控緩釋、被動靶向、主動靶向、酶響應(yīng)性與免疫治療-化學藥物治療聯(lián)合等多種優(yōu)勢于一體的一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載化學抗腫瘤藥物和anti-fas抗體智能型納米載藥體系的制備方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種基質(zhì)金屬酶響應(yīng)的anti-fas抗體智能型納米載藥體系的制備方法，包括以下步驟：

a.通過開環(huán)聚合法制備官能化的聚己內(nèi)酯pcl-cooh和pcl-nh2；

b.制備甲氧基聚乙二醇肽鏈(mpeg–pep)，然后將步驟a中制得的官能化的聚己內(nèi)酯(pcl-nh2)和mpeg-pep、二甲基氨基吡啶(dmap)、二氯乙烷(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)混合反應(yīng)，透析，于透析袋中液體凍干,制得mpeg–pep-pcl；

c.將步驟a中制得的pcl-cooh和nhs、edc混合溶于dmf溶液中反應(yīng)，隨后純水中透析，透析袋中液體凍干，制得pcl-nhs粉末；將pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基溶于dmf溶液反應(yīng)，隨后混合液在透析袋中透析，透析袋中液體凍干，制得pcl-peg-cooh粉末；

d.采用納米沉淀法制備包載小分子抗腫瘤藥物的納米粒,將步驟b制得mpeg–pep-pcl、步驟c制得pcl-peg-cooh和小分子抗腫瘤藥物溶解在二氯甲烷(ch2cl2)中,然后將混合溶液逐滴加到純水中，隨后將混合溶液超聲、攪拌4-8分鐘形成乳液；通過蒸發(fā)除去ch2cl2，制得包載小分子抗腫瘤藥物的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型納米粒子小分子抗腫瘤藥物-loadednps；

e.將步驟d制得小分子抗腫瘤藥物-loadednps粉末在ph4.5～5.5的n-嗎啉乙磺酸溶液中，加入含0.1mol/ledc的mes溶液和含0.1mol/lnhs的mes溶液，活化智能型納米粒子表面pcl-peg-cooh的羧基；攪拌將活化后的納米粒子懸浮液離心，收集納米粒子；隨后將納米粒子在0.1mol/l磷酸鹽緩沖液中重懸；洗去未參與反應(yīng)的edc和nhs，最終將納米粒子在1mlpbs溶液中重懸，加入anti-fas抗體反應(yīng)40-50小時；離心除去未連接抗體，制得基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載小分子抗腫瘤藥物和anti-fas抗體的智能型納米載藥體。

所述小分子抗腫瘤藥物為蒽環(huán)類、生物堿類抗腫瘤藥物。

具體的，所述小分子抗腫瘤藥物可以為阿霉素、柔紅霉素、長春新堿、喜樹堿、紫杉醇等。

所述步驟a中,用亮氨酸為引發(fā)劑，將ε-己內(nèi)酯單體、亮氨酸以摩爾比為100-120:1-1.2的比例加入聚合管中，通過開環(huán)聚合法制備pcl-cooh；將pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺中，加入乙二胺、二氯乙烷、n-羥基琥珀酰亞胺和二甲基氨基吡啶，反應(yīng)制得pcl-nh2。

所述步驟b中,將甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺和肽鏈按摩爾比1.0-1.2:1.2-1.5溶于含有2.5-3.5％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃攪拌反應(yīng)3-6小時，5500da透析袋中純水中透析40-50小時，除去未反應(yīng)的mpeg-nhs和肽鏈，所得溶液凍干，制得甲氧基聚乙二醇肽鏈mpeg–pep；將步驟a中pcl-nh2和mpeg-pep、dmap、edc、nhs按照摩爾比1.2:1:1:1:1混合反應(yīng)制備mpeg–pep-pcl。

所述步驟c中,將nhs、edc和步驟a中制得pcl-cooh按照摩爾比1.2:1:1混合反應(yīng)制備pcl-nhs粉末；將pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基按照摩爾比為1-1.5:1-2反應(yīng)制得pcl-peg-cooh粉末。

所述步驟d中，將步驟b制得mpeg–pep-pcl、步驟c制得pcl-peg-cooh和小分子抗腫瘤藥物以質(zhì)量比10:2:2溶解在溶劑中；然后將混合溶液逐滴加到20ml40℃純水中，隨后將混合溶液超聲、攪拌4-8分鐘形成乳液；蒸發(fā)除去溶劑，制得包載小分子抗腫瘤藥物的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型納米粒子。

所述步驟e中，將步驟d制得小分子抗腫瘤藥物-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph4.5～5.5的n-嗎啉乙磺酸溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液，活化智能型納米粒子表面pcl-peg-cooh的羧基，反應(yīng)溫度為18-25℃，反應(yīng)30-50分鐘。

所述步驟a、b、c中pcl-nh2、mpeg–pep-pcl和pcl-peg-cooh的純化均采用14000da透析袋，純水透析40-50小時。

本發(fā)明還保護采用上述方法制備的基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載小分子抗腫瘤藥物和anti-fas抗體的智能型納米載藥體。

本發(fā)明公開一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載化學抗腫瘤藥物和anti-fas抗體智能型納米載藥體系的制備方法，涉及一種共載抗腫瘤藥物和模仿毒性t細胞功能激活fas-fasl凋亡通路協(xié)同促進腫瘤細胞凋亡(或?qū)崿F(xiàn)免疫治療-化學藥物治療聯(lián)合)的智能型納米載藥體系的制備工藝。首先利用edc/nhs偶聯(lián)試劑將官能化的聚己內(nèi)酯(pcl-nh2)分別與甲氧基聚乙二醇肽鏈(mpeg-pep)、羧化氨基聚乙二醇(nh2-peg-cooh)反應(yīng)生成mpeg-pep-pcl及peg-pcl-cooh，然后將納米沉淀法合成的負載小分子抗腫瘤藥物納米粒子與mpeg-pep-pcl及peg-pcl-cooh溶解在二氯甲烷中，攪拌后逐滴加入40℃熱水中，超聲后室溫下攪拌除去二氯甲烷制得基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的負載小分子抗腫瘤藥物智能型納米顆粒。通過edc/mes和nhs/mes溶液活化納米粒子表面nh2-peg-cooh羧基后加入anti-fas抗體(fasl)，4℃反應(yīng)48小時，分離純化后即制成基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載小分子抗腫瘤藥物和anti-fas抗體智能型納米載藥體系。

納米載體主要具有以下優(yōu)點：(1)具有較高的藥物包載能力，能夠包載的藥物范圍較廣，可以是疏水性藥物也可以是親水性藥物，并且無論單方藥還是復方藥均可包載；(2)通過修飾可形成親水端，從而防止蛋白質(zhì)的吸附，躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉；(3)粒徑小且分布窄，易通過生理屏障，在體內(nèi)具有獨特的分布特征。納米粒在體內(nèi)的分布主要取決于粒徑的大小和表面形態(tài)，與核內(nèi)包裹的藥物性質(zhì)關(guān)系不大；(4)有緩釋作用，能夠延長藥物的作用時間；(5)通過連接靶體，可主動達到靶向部位，如腫瘤組織等；(6)可在保證藥效的前提下，減少給藥劑量，從而減輕或避免毒副作用。功能化修飾的mmps納米粒子大小約為100nm左右，作為一種納米載體在藥物的控釋以及腫瘤靶向性等方面具有良好的應(yīng)用價值。聚乙二醇和聚己內(nèi)酯均具有良好的生物相容性、安全、無毒、低免疫原性、能最大程度的避免蛋白和細胞非特異性吸附，使其避免被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬的最常用高分子聚合物。聚己內(nèi)酯是一種疏水性很強的半結(jié)晶聚合物，結(jié)構(gòu)重復單元上有個非極性亞甲基和一個極性酯基，有良好柔韌性和加工性，可通過開環(huán)反應(yīng)與兩親性聚乙二醇之間插入一段基質(zhì)金屬膜反應(yīng)的底物多肽。在血液循環(huán)中疏水性聚己內(nèi)酯形成保護層防止內(nèi)層物質(zhì)與正常組織細胞接觸，保持長循環(huán)的特征。在腫瘤微環(huán)境中，增強滲透效應(yīng)的作用下，被動靶向到腫瘤組織附近，受腫瘤微環(huán)境中高表達基質(zhì)金屬酶的影響，使得聚己內(nèi)酯與聚乙二醇之間多肽斷裂，暴露出內(nèi)層anti-fas抗體。anti-fas抗體與腫瘤細胞表面的fas相互識別，通過fas-fasl通路觸發(fā)靶細胞內(nèi)部的凋亡程序，同時聚乙二醇包載的小分子抗腫瘤藥物通過細胞外持續(xù)釋放及內(nèi)吞入細胞發(fā)揮抗腫瘤作用，達到程序性、持續(xù)性地在腫瘤組織中釋放anti-fas抗體及小分子抗腫瘤藥物，增強藥物的腫瘤靶向性，實現(xiàn)免疫治療-化學藥物治療聯(lián)合抗腫瘤作用。實驗表明，聚己內(nèi)酯和聚乙二醇修飾的基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的納米顆粒具有良好的分散性和較好的晶體結(jié)構(gòu)。anti-fas抗體通過與修飾后納米顆粒上羧基連接，負載于納米顆粒中層，使整個納米載藥體系成為類三明治結(jié)構(gòu)：包含mmps響應(yīng)性的長鏈peg外層，anti-fas抗體連接的中間層和包載小分子抗腫瘤藥物的聚己內(nèi)酯核。實驗表明該類新型的基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載小分子抗腫瘤藥物和anti-fas抗體智能型納米載藥體系具有較高的載藥率和藥物包封率，能夠顯著增強藥物靶向性，增加腫瘤細胞內(nèi)的藥物濃度，聯(lián)合激活fas-fasl通路增強抗腫瘤效果。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1)本發(fā)明以聚己內(nèi)酯、聚乙二醇為主要材料，采用表面工程化技術(shù)修飾后的基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的有fasl生物功能的anti-fas單抗的智能免疫納米載藥體，可防止蛋白質(zhì)的吸附，躲避內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的吞噬，并且具有良好的分散性、較高的包封率和包載率。

2)本發(fā)明制備的新型智能型納米載藥體系利用用載體對腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)金屬蛋白酶的響應(yīng)、anti-fas抗體和腫瘤細胞的相互作用，顯著增強腫瘤靶向性，提高藥物的藥效和利用率，降低對正常組織、細胞的損害，從而減輕毒副作用，提高化療效果。

3)該納米載藥體系設(shè)計了一種具有三明治結(jié)構(gòu)、表面修飾具有fasl生物功能的anti-fas單抗的智能免疫納米藥物，聯(lián)合化學抗腫瘤藥物，實現(xiàn)了納米技術(shù)、免疫治療、化學藥物治療的聯(lián)合，極大增強了抗腫瘤效果。

4)該納米載藥體系具有緩釋特征，能在較長時間內(nèi)穩(wěn)定維持化療藥物在病灶部位的濃度，延長化療藥物在細胞內(nèi)的作用時間，增強抗腫瘤作用。

附圖說明

圖1：掃描電子顯微鏡對基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體智能型納米載藥體進行直觀的表征。

圖2：紅外吸收光譜分析圖a。

圖3：紅外吸收光譜分析圖b。

圖4：核磁共振波譜圖a。

圖5：核磁共振波譜圖b。

圖6：智能型納米載藥體和明膠酶反應(yīng)后的透射電鏡圖像。

圖7：基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體智能型納米載藥體的體外釋放曲線。

圖8：用納米粒度及動電位測定儀測定基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的負載anti-fas抗體智能型納米載藥體的水合動力學半徑。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體的智能型納米載藥體的制備：

(1)通過開環(huán)聚合法制備官能化的聚己內(nèi)酯(pcl-nh2)。用亮氨酸(leu)為引發(fā)劑，將ε-己內(nèi)酯(ε-cl)單體、亮氨酸以摩爾比為100-120:1-1.2的比例加入聚合管中，雙排管抽真空、充高純氮氣三次，除去體系中的空氣和水，按體積比1000:1加入無水甲苯配制濃度為0.1mmol/ml的甲苯辛酸亞錫溶液。減壓除去溶解催化劑的溶劑甲苯。酒精噴燈真空封管，160℃油浴中反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后聚合管冷卻至18-25℃，加入二氯甲烷(ch2cl2)完全溶解反應(yīng)產(chǎn)物后冷乙醚沉淀，重復三次抽濾沉淀。25℃下真空干燥至恒重，制得白色固體pcl-cooh。將pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，按照pcl-cooh的摩爾量加入乙二胺、二氯乙烷(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和二甲基氨基吡啶(dmap)，37℃反應(yīng)18個小時，加入乙醇，中速濾紙過濾，重復3次，最后用去離子水沖洗濾渣，25℃下真空干燥制得pcl-nh2。

(2)將甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺(mpeg-nhs)和肽鏈，按照摩爾比1.0-1.2:1.2-1.5溶于含有3％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃攪拌反應(yīng)3-6小時，5500da透析袋中純水中透析40-50小時，除去未反應(yīng)的mpeg-nhs和肽鏈，所得溶液凍干，制得甲氧基聚乙二醇肽鏈(mpeg–pep)，1-8℃冰箱中備用。將mpeg-pep、步驟(1)中pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩爾比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中18-25℃反應(yīng)18-28小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析40-50小時，透析袋中液體凍干，制得mpeg–pep-pcl，4℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

(3)nhs、edc和步驟(1)中制得pcl-cooh按照摩爾比1.2:1:1混合，溶于dmf溶液中，18-25℃反應(yīng)12小時，隨后純水中透析40-50小時，透析袋中液體凍干，制得pcl-nhs粉末，4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。將pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基(nh2-peg-cooh)按照摩爾比為1:1.2溶于dmf溶液，18-25℃反應(yīng)18-28小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析40-50小時，透析袋中液體凍干，制得pcl-peg-cooh粉末，1-8℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

(4)采用納米沉淀法制備包載阿霉素的納米粒子。將10mg步驟(2)制得mpeg–pep-pcl、2mg步驟(3)制得pcl-peg-cooh和2mg阿霉素(dox)溶解在2mlch2cl2中。然后將混合溶液逐滴加到20ml40℃純水中，隨后將混合溶液超聲、攪拌4-8分鐘形成乳液。通過蒸發(fā)除去ch2cl2，制得包載dox的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型納米粒子(dox-loadednps)

(5)將步驟(4)制得dox-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝4.5-5.5n-嗎啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液活化智能型納米粒子表面pcl-peg-cooh的羧基。18-25℃攪拌30-50分鐘，將活化后的納米粒子懸浮液1-8℃12000r/min離心10分鐘，收集納米粒子。隨后將納米粒子在0.1mol/l磷酸鹽緩沖液(pbs)中重懸，通過懸浮-離心法3-5次，使用pbs溶液洗去未參與反應(yīng)的edc和nhs，最終將納米粒子在1mlpbs溶液中重懸，加入10μganti-fas抗體，1-8℃反應(yīng)40-50小時。1-8℃15000r/min10分鐘離心除去未連接抗體，制得基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體的智能型納米載藥體(dox-loadedanti-fasnps)。

以下結(jié)合附圖1～8進行說明對實施例1所制備產(chǎn)物的檢測：

圖1是實施例掃描電子顯微鏡對基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體智能型納米載藥體進行直觀的表征。其平均粒徑為140nm左右，球形結(jié)構(gòu)，表明該量子點具有良好的分散性和較好的晶體結(jié)構(gòu)，可在內(nèi)里具有長循環(huán)。圖2、3是紅外吸收光譜分析，圖2中2850cm-1-3000cm-1處的峰代表-ch2-，1180cm-1代表羰基，聚己內(nèi)酯的吸收峰和1650cm-1處的酰胺鍵說明成功地合成了mpeg-pep-pcl。圖3中3321cm-1和1550cm-1處是胺的典型吸收峰，1652cm-1處的酰胺鍵吸收峰，說明peg被成功地修飾到了pcl-nhs上。圖4、5是核磁共振波譜圖，圖中c、b、a和d是聚己內(nèi)酯重復單元的峰，核磁譜圖上沒有其它核磁質(zhì)子峰出現(xiàn)，證明得到了純凈的目標產(chǎn)物，圖中可見各自的特征峰。圖6是此智能型納米載藥體和明膠酶反應(yīng)后的透射電鏡圖像，納米粒子在明膠酶存在的環(huán)境下，表面修飾的peg從聚己內(nèi)酯核上脫離，納米粒子發(fā)生聚集，平均粒徑大于500nm，說明對基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的智能型納米載藥體可在基質(zhì)金屬蛋白酶的作用下滯留在腫瘤周圍。圖7是基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體智能型納米載藥體的體外釋放曲線，說明該納米載藥體系具有藥物緩釋功能，同時在明膠酶存在情況下，長鏈peg會從納米粒子上脫離，使得包載在聚己內(nèi)酯核中的阿霉素更容易擴散出來，具有酶響應(yīng)性釋放作用。圖8是用納米粒度及動電位測定儀測定基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的負載anti-fas抗體智能型納米載藥體的水合動力學半徑?？瞻纵d藥體其平均水合半徑為140nm，包載阿霉素后載藥體其平均水合半徑為170nm。

實施例2

一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體智能型納米載藥體系的制備方法：

(1)用亮氨酸為引發(fā)劑，將ε-己內(nèi)酯單體、亮氨酸以摩爾比為100:1的比例加入聚合管中，通過開環(huán)聚合法制備官能化的聚己內(nèi)酯(pcl-nh2)。

(2)將甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺和肽鏈，按照摩爾比1.0:1.2溶于含有3％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃攪拌反應(yīng)4小時，5500da透析袋中純水中透析48小時，制得甲氧基聚乙二醇肽鏈。將mpeg-pep、pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩爾比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中18-25℃反應(yīng)24小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析48小時制得mpeg–pep-pcl。

(3)nhs、edc和pcl-cooh按照摩爾比1.2:1:1混合，25℃反應(yīng)12小時，純水中透析48小時，制得pcl-nhs粉末。將pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基按照摩爾比為1:1.2溶于dmf溶液，25℃反應(yīng)24小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析48小時，制得pcl-peg-cooh。

(4)采用納米沉淀法制備包載阿霉素(dox)的納米粒子。將10mgmpeg–pep-pcl、2mgpcl-peg-cooh和2mg阿霉素溶解在2mlch2cl2中。然后將混合溶液逐滴加到20ml40℃純水中，隨后將混合溶液超聲、攪拌5分鐘形成乳液。蒸發(fā)除去ch2cl2，制得包載dox的mpeg–pep-pcl@pcl-peg-cooh的智能型納米粒子。

(5)將dox-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝5.0n-嗎啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液。25℃攪拌40分鐘，將活化后的納米粒子懸浮液4℃12000r/min離心10分鐘。pbs重懸，通過懸浮-離心法3次，洗去未參與反應(yīng)的edc和nhs，最終將納米粒子在1mlpbs溶液中重懸，加入10μganti-fas抗體，4℃反應(yīng)48小時。4℃15000r/min10分鐘離心除去未連接抗體，制得基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載阿霉素和anti-fas抗體的智能型納米載藥體。

實施例3

一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載喜樹堿和anti-fas抗體智能型納米載藥體系的制備方法：

(1)用亮氨酸(leu)為引發(fā)劑，將ε-己內(nèi)酯(ε-cl)單體、亮氨酸以摩爾比為120:1.0的比例加入聚合管中，雙排管抽真空、充高純氮氣三次，按體積比1000:1加入無水甲苯配制濃度為0.1mmol/ml的甲苯辛酸亞錫溶液。150℃油浴中反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后聚合管冷卻至22℃，加入二氯甲烷完全溶解反應(yīng)產(chǎn)物后冷乙醚沉淀，重復三次抽濾沉淀。制得pcl-cooh。將pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，按照pcl-cooh的摩爾量加入乙二胺、二氯乙烷(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和二甲基氨基吡啶(dmap)，37℃反應(yīng)18個小時，加入乙醇，中速濾紙過濾，重復3次，最后用去離子水沖洗濾渣，25℃下真空干燥制得pcl-nh2。

(2)將甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺(mpeg-nhs)和肽鏈，按照摩爾比1.0:1.2溶于含有2.5％的三乙胺的dmf溶液中，22℃攪拌反應(yīng)4小時，5500da透析袋中純水中透析48小時，制得甲氧基聚乙二醇肽鏈(mpeg–pep)。將mpeg-pep、pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩爾比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中22℃反應(yīng)24小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析48小時，制得mpeg–pep-pcl。

(3)nhs、edc和pcl-cooh按照摩爾比1.2:1:1混合，22℃反應(yīng)12小時，隨后純水中透析48小時，制得pcl-nhs粉末。將pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基(nh2-peg-cooh)按照摩爾比為1:1.2溶于dmf溶液，22℃反應(yīng)24小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析50小時，制得pcl-peg-cooh。

(4)采用納米沉淀法制備包載喜樹堿的納米粒子。將20mgmpeg–pep-pcl、4mgpcl-peg-cooh和4mg喜樹堿溶解在4mlch2cl2中。然后將混合溶液逐滴加到20ml40℃純水中，隨后將混合溶液超聲、攪拌5分鐘形成乳液。通過蒸發(fā)除去ch2cl2，制得包載喜樹堿的智能型納米粒子(cpt-loadednps)。

(5)將cpt-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝5.5n-嗎啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液。22℃攪拌30分鐘，將活化后的納米粒子懸浮液4℃12000r/min離心10分鐘。隨后磷酸鹽緩沖液(pbs)中重懸，通過懸浮-離心法5次，洗去未參與反應(yīng)的edc和nhs，最終將納米粒子在1mlpbs溶液中重懸，加入12μganti-fas抗體，4℃反應(yīng)47小時。4℃15000r/min10分鐘離心除去未連接抗體，制得基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載喜樹堿和anti-fas抗體的智能型納米載藥體。

實施例4

一種基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載長春新堿和anti-fas抗體智能型納米載藥體系的制備方法：

(1)將ε-己內(nèi)酯(ε-cl)單體、亮氨酸以摩爾比為110:1的比例加入聚合管中，雙排管抽真空、充高純氮氣三次，除去體系中的空氣和水，按體積比1000:1加入無水甲苯配制濃度為0.1mmol/ml的甲苯辛酸亞錫溶液。酒精噴燈真空封管，170℃油浴中反應(yīng)24小時。反應(yīng)結(jié)束后聚合管冷卻至25℃，加入二氯甲烷(ch2cl2)完全溶解反應(yīng)產(chǎn)物后冷乙醚沉淀，重復三次抽濾沉淀制得pcl-cooh。將pcl-cooh溶解在二甲基甲酰胺(dmf)中，按照pcl-cooh的摩爾量加入乙二胺、二氯乙烷(edc)、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和二甲基氨基吡啶(dmap)，37℃反應(yīng)20個小時，加入乙醇，中速濾紙過濾，重復3次，最后用去離子水沖洗濾渣，25℃下真空干燥制得pcl-nh2。

(2)將甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺(mpeg-nhs)和肽鏈，按照摩爾比1.0:1.5溶于含有3.5％的三乙胺的dmf溶液中，18-25℃攪拌反應(yīng)4小時，5500da透析袋中純水中透析48小時，除去未反應(yīng)的mpeg-nhs和肽鏈，制得甲氧基聚乙二醇肽鏈(mpeg–pep)。將mpeg-pep、pcl-nh2、dmap、edc、和nhs按照摩爾比1.2:1:1:1:1混合，溶于dmf溶液中18℃反應(yīng)24小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析50小時，透析袋中液體凍干，制得mpeg–pep-pcl。

(3)nhs、edc和步驟(1)中制得pcl-cooh按照摩爾比1.2:1:1混合，溶于dmf溶液中，20℃反應(yīng)12小時，隨后純水中透析48小時，透析袋中液體凍干，制得pcl-nhs粉末。將pcl-nhs、氨基-聚乙二醇-羧基(nh2-peg-cooh)按照摩爾比為1.1:1.2溶于dmf溶液，20℃反應(yīng)24小時，隨后混合液在14000da透析袋中透析48小時，制得pcl-peg-cooh粉末。

(4)采用納米沉淀法制備包載長春新堿(vcr)的納米粒子。將5mgmpeg–pep-pcl、1mgpcl-peg-cooh和1mg長春新堿溶解在2mlch2cl2中。然后將混合溶液逐滴加到20ml40℃純水中，隨后將混合溶液超聲、攪拌5分鐘形成乳液。蒸發(fā)除去ch2cl2，制得包載長春新堿的智能型納米粒子(vcr-loadednps)。

(5)將vcr-loadednps粉末按5mg/ml溶解在ph＝5.0n-嗎啉乙磺酸(mes)溶液中，加入200μl含0.1mol/ledc的mes溶液和600μl含0.1mol/lnhs的mes溶液。20℃攪拌30分鐘，將活化后的納米粒子懸浮液4℃12000r/min離心10分鐘，收集納米粒子。將納米粒子磷酸鹽緩沖液(pbs)中重懸，通過懸浮-離心法3次洗去未參與反應(yīng)的edc和nhs，將納米粒子在1mlpbs溶液中重懸，加入10μganti-fas抗體，4℃反應(yīng)50小時。4℃15000r/min10分鐘離心除去未連接抗體，制得基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的共載長春新堿和anti-fas抗體的智能型納米載藥體。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進等，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍之內(nèi)。