本申請(qǐng)是原案申請(qǐng)日為2011年02月22日、原案申請(qǐng)?zhí)枮?01180010529.6(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/us2011/025770)、發(fā)明名稱為“用于治療腱病的血小板衍生生長(zhǎng)因子組合物和方法”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2010年2月22日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/306,938、2010年3月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)順序號(hào)61/311,284、2010年12月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)順序號(hào)61/428,809和2011年1月3日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/429,428的權(quán)益，所有申請(qǐng)都通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

本發(fā)明涉及用于治療以下腱病(tendinopathy)的組合物和方法，例如腱鞘炎、腱退變(tendinosis)或腱炎，包括跟腱病(achillestendinopathy)、髕腱病、外上髁炎(lateralepicondylitis)即“網(wǎng)球肘”、內(nèi)上髁炎即“高爾夫球員肘”、足底筋膜炎和肌腱套腱病，具體地講，涉及通過給予包含血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)的組合物治療腱病的方法。

發(fā)明背景

肌腱是一種堅(jiān)韌的纖維性結(jié)締組織帶，通常將肌肉與骨連接。肌腱的彈性特性調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)期間的力，在無主動(dòng)工作的情況下提供額外的穩(wěn)定性。它們還以高效率儲(chǔ)存和恢復(fù)能量。正常的健康肌腱主要由緊密壓在一起的平行排列的i型膠原纖維組成，但也包括少量彈性蛋白和蛋白聚糖。由其高度特化的超微結(jié)構(gòu)、低水平的血管形成和緩慢的膠原更新所致，肌腱如果受損則痊愈非常緩慢，并且很難恢復(fù)其最初的強(qiáng)度。部分撕裂通過快速產(chǎn)生無序的iii型膠原而愈合，無序的iii型膠原比正常肌腱弱。肌腱受損區(qū)域的損傷復(fù)發(fā)是普遍的。

腱病是肌腱的慢性病癥或損傷，似乎由分解代謝和合成代謝反應(yīng)之間的不平衡導(dǎo)致，這種不平衡是由過度使用或老化致使肌腱逐步磨損而引起的。這種不平衡的結(jié)果是肌腱變性、衰弱、撕裂和疼痛。相比之下，急性肌腱損傷例如肌腱破裂或從骨上脫落十分突然，通常需要手術(shù)修復(fù)破裂或使肌腱與骨再附著。任何人都可能發(fā)生腱病，但在其工作、運(yùn)動(dòng)或常規(guī)日?；顒?dòng)中趨于一再進(jìn)行相同動(dòng)作的人更可能發(fā)生腱病。腱病通常在受累部位引起疼痛、僵硬和喪失強(qiáng)度。

術(shù)語腱病是指兩種類型的肌腱損傷：腱退變和腱炎。該術(shù)語還包括腱鞘炎，一種發(fā)生在某些肌腱例如屈肌腱和跟腱中的肌腱外襯腱病。

腱退變是肌腱的非炎性損傷，其特征在于因過度使用引起的通常呈在肌腱中和肌腱周圍的組織微撕裂形式的肌腱的肌腱內(nèi)變性，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域周圍肌腱修復(fù)細(xì)胞的數(shù)目增加。肌腱的變性是由肌腱的膠原纖維、細(xì)胞和血管成分的損傷或結(jié)構(gòu)破壞引起的，其可降低肌腱的抗張強(qiáng)度，如果不治療的話，可導(dǎo)致肌腱破裂。膠原組構(gòu)的變化的特征在于纖維分離/松散/卷曲、平行取向喪失、纖維直徑減小和膠原總體密度降低。此外，也可發(fā)生被紅細(xì)胞、血纖蛋白和纖連蛋白沉積物包繞的膠原微撕裂。另一方面，存在iii型(修復(fù)性)膠原增加。這些基質(zhì)組構(gòu)變化可導(dǎo)致在偏振光顯微術(shù)下雙折射降低。除膠原含量和組構(gòu)以外，腱退變的特征還在于在受累區(qū)域粘液樣基質(zhì)(蛋白聚糖)增加和細(xì)胞密度改變。一些區(qū)域含有異常豐富的肌腱細(xì)胞，其有成圓形的核和蛋白聚糖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生增加的超微結(jié)構(gòu)跡象。相比之下，受累肌腱的其它區(qū)域可含有比正常少的肌腱細(xì)胞，其具有小的固縮核。腱退變的另一個(gè)特有特征是毛細(xì)血管和微動(dòng)脈增生。通過電子顯微鏡術(shù)鑒定出腱退變中肌腱變性的若干亞類：(1)低氧變性，(2)透明變性，(3)粘液樣變性(mucoid或myxoiddegeneration)，(4)纖維蛋白樣變性，(5)類脂質(zhì)變性，(6)鈣化，和(7)纖維軟骨和骨轉(zhuǎn)化。這些病理可以不同的發(fā)生率共存，這取決于解剖部位和引起這些病理的損傷的性質(zhì)(例如缺氧與機(jī)械載荷；急性與慢性損傷)。例如，粘液樣變性區(qū)域通過光學(xué)顯微鏡術(shù)、大的粘液斑和纖維之間的空泡表征。然而，類脂質(zhì)變性的特征在于肌腱內(nèi)脂質(zhì)蓄積異常，導(dǎo)致膠原纖維結(jié)構(gòu)被破壞。在一些情況下，腱退變伴發(fā)肌腱局灶性壞死或鈣化。它是引起關(guān)節(jié)周圍慢性疼痛的一個(gè)十分常見的原因。腱退變的特征還在于缺乏初期炎癥反應(yīng)。炎性細(xì)胞被認(rèn)為是修復(fù)過程的早期介質(zhì)，沒有它腱退變可能變成慢性病況。

與腱退變有關(guān)的含水量的特征性增加和膠原基質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞可通過超聲檢查或磁共振成像診斷。癥狀可從肌腱局部區(qū)域的單純疼痛和僵硬到受損肌腱附近整個(gè)關(guān)節(jié)周圍的燒灼感而不同。對(duì)于許多患者，疼痛常常在活動(dòng)期間和活動(dòng)之后惡化，肌腱和關(guān)節(jié)區(qū)域在次日可能變得更僵硬，因?yàn)槟[脹對(duì)肌腱的活動(dòng)有重大影響。

腱炎是肌腱的炎性損傷，其特征在于像在腱退變中觀察到的變性，但還伴有伴發(fā)血管破壞和炎性修復(fù)反應(yīng)的肌腱炎癥。腱炎常常伴有成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞增殖，以及出血和組織化肉芽組織。腱炎一般通過所涉及的身體部位來命名，例如跟腱炎(影響跟腱)或髕腱炎(亦稱為“跳躍膝”，影響髕腱)，但是有某些例外，例如外上髁炎(亦稱為“網(wǎng)球肘”，影響橈側(cè)腕短伸肌腱)。癥狀可從持續(xù)性疼痛或疼痛和局部僵硬到發(fā)炎肌腱附近整個(gè)關(guān)節(jié)周圍的燒灼感而不同。在一些情況下，腱炎的特征在于腫脹，有時(shí)伴有發(fā)熱和發(fā)紅；在關(guān)節(jié)周圍還可有可見結(jié)節(jié)。對(duì)于許多患者，疼痛通常在活動(dòng)期間和活動(dòng)之后惡化，次日肌腱和關(guān)節(jié)區(qū)域可變得僵硬，因?yàn)榧∪庖蚣‰旎顒?dòng)而收緊。

現(xiàn)行治療在性質(zhì)上主要是治標(biāo)的，治療在傳統(tǒng)上集中在抗炎方法上，包括用非甾體抗炎藥(nsaid)治療、類固醇注射和物理治療，盡管腱退變往往與炎癥反應(yīng)不相關(guān)的事實(shí)。最近，測(cè)試了沖擊波療法、水平激光療法、硬化療法和其它實(shí)驗(yàn)性治療。對(duì)于大部分，似乎一些治療(例如nsaid和可的松注射)提供短期緩解，而現(xiàn)行治療的長(zhǎng)期益處尚不清楚。因此，需要與現(xiàn)有治療方式相比提供長(zhǎng)期益處的治療腱病的改進(jìn)方法。

pdgf存儲(chǔ)于血小板的α-顆粒中，并在組織修復(fù)期間由局部活化細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)分泌。pdgf-bb是急性肌腱損傷出血和炎癥的主要產(chǎn)物之一。血小板衍生生長(zhǎng)因子-bb(pdgf-bb)是一種傷口愈合蛋白質(zhì)，已知其對(duì)于包括骨(成骨細(xì)胞)和肌腱(肌腱細(xì)胞)細(xì)胞在內(nèi)的間充質(zhì)源細(xì)胞是趨化性的(細(xì)胞遷移)和促有絲分裂的(細(xì)胞增殖)。此外，已表明pdgf-bb增量調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)，導(dǎo)致血管生成(血管重建)增加，這是成功再生過程所必需的。

跟腱是人體中最厚和最強(qiáng)的肌腱，這允許它支持高載荷。其中跟腱起作用的機(jī)械載荷環(huán)境使之易于破裂。跟腱破裂可作為各種因素的結(jié)果而發(fā)生，然而破裂常常與退行性病變有關(guān)。(mafullin，wongj，almekindersl.typesandepidemiologyoftendinopathy(腱病的類型和流行病學(xué)).clinicsinsportsmedicine.2003;22:675-692)。在修復(fù)過程后，破裂的跟腱顯示i型膠原減少，而iii型膠原的量相對(duì)增加。這種組成的變化導(dǎo)致交聯(lián)較少和抗張強(qiáng)度降低。甚至在愈合后，破裂的跟腱由于細(xì)胞過多、結(jié)構(gòu)破壞和膠原交聯(lián)減少而仍舊較弱(maffullin,mollerhd,evansch.tendonhealing:canitbeoptimized(肌腱愈合：可能最優(yōu)化嗎)britishjournalofsportsmedicine,2002;36:315-316)。對(duì)于跟腱破裂的最佳治療存在爭(zhēng)論，對(duì)保守(非手術(shù))和手術(shù)治療兩者有贊成的也有反對(duì)的。非手術(shù)治療導(dǎo)致較高的再破裂率且強(qiáng)度降低，但卻避免了與手術(shù)有關(guān)的費(fèi)用和風(fēng)險(xiǎn)。(inglisae,scottwn,sculcotp等.rupturesofthetendoachillis:anobjectiveassessmentofsurgicalandnon-surgicaltreatment(跟腱破裂：手術(shù)和非手術(shù)治療的客觀評(píng)價(jià)).jbonejointsurgam.1976;58:990-993；nistorl.surgicalandnonsurgicaltreatmentofachillestendonrupture:aprospectiverandomizedtrial(跟腱破裂的手術(shù)和非手術(shù)治療：前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)).jbonejointsurgam198163(3):394-9；chalmersj.reviewarticle:treatmentofachillestendonruptures(綜述文章：跟腱破裂的治療).journaloforthopaedicsurgery2008(1):97-99)。手術(shù)修復(fù)伴有手術(shù)和麻醉風(fēng)險(xiǎn)；然而它提供增強(qiáng)的強(qiáng)度、較低的再破裂率和較早恢復(fù)體育活動(dòng)。(nistorl.surgicalandnonsurgicaltreatmentofachillestendonrupture:aprospectiverandomizedtrial(跟腱破裂的手術(shù)和非手術(shù)治療：前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)).jbonejointsurgam198163(3):394-9；rettiga,liottafj,klootwykte,porterda,mielingp.potentialriskofreruptureinprimaryachillestendonrepairinathletesyoungerthan30yearsofage(30歲以下運(yùn)動(dòng)員重大跟腱修復(fù)中再破裂的潛在風(fēng)險(xiǎn)).amjofsportsmed2005:33(1):119-123)。不論臨床醫(yī)生對(duì)急性跟腱破裂的治療的偏愛，手術(shù)修復(fù)在活躍患者群的這些損傷的各種治療中將繼續(xù)占有一席之地。與現(xiàn)行的治療方式相比，強(qiáng)化生物修復(fù)過程從而改善肌腱愈合，可能導(dǎo)致更快恢復(fù)活動(dòng)并改進(jìn)臨床結(jié)局。

有關(guān)肌腱愈合的生物學(xué)增強(qiáng)已有若干體內(nèi)和體外研究。參見例如：seehermanhj,archambaultjm,rodeosa,等.rhbmp-12accelerateshealingofrotatorcuffrepairsinasheepmodel(rhbmp-12加快綿羊模型的肌腱套修復(fù)的愈合).jbonejointsurgam.2008;90(10):2206-2219；chanbp,fusc,qinl等.supplementation-timedependenceofgrowthfactorsinpromotingtendonhealing(促進(jìn)肌腱愈合中的生長(zhǎng)因子的補(bǔ)充-時(shí)間依賴性).clinorthoprelatres.2006;448:240-247；uggenjc,dinesj,uggencw等.tendongenetherapymodulatesthelocalrepairenviromentintheshoulder(肌腱基因治療調(diào)節(jié)肩部的局部修復(fù)環(huán)境).jamosteopathassoc.2005;105(1):20-21；gelbermanr,thomopouloss,sakiyama-elberts等.theearlyeffectsofsustainedplatelet-derivedgrowthfactoradministrationonthefunctionalandstructuralpropertiesofrepairedintrasynovialflexortendons:aninvivobiomechanicstudyat3weeksincanines(持續(xù)給予血小板衍生生長(zhǎng)因子對(duì)經(jīng)修復(fù)的滑膜內(nèi)屈肌腱的功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的早期作用：犬中三周的體內(nèi)生物力學(xué)).jhandsurgam.2007;32(3):373-379；thomopouloss,dasr,silvamj等.enhancedflexortendonhealingthroughcontrolleddeliveryofpdgf-bb(通過受控遞送pdgf-bb加快屈肌腱愈合).jorthopres.2009;27(9):1209-1215；thomopouloss,zaegelm,dasr等.pdgf-bbreleasedintendonrepairusinganoveldeliverysystempromotescellproliferationandcollagenremodeling(采用新的遞送系統(tǒng)在肌腱修復(fù)中釋放的pdgf-bb促進(jìn)細(xì)胞增殖和膠原重建).jorthopres.2007;25(10):1358-1368；dinesj,granded,dinesd.tissueengineeringandrotatorcufftendonhealing(組織工程學(xué)和肌腱套肌腱愈合).jshoulderelbowsurg,2007年9月/10月:204s-206s。

以足夠的劑量并在合適的時(shí)程內(nèi)將rhpdgf-bb遞送至修復(fù)部位在實(shí)現(xiàn)所需臨床效果中很重要。若干研究描述了用生物成分(biologies)涂覆的縫線。參見例如rickertm,jungm,adiyamanm,richterw,wimankhg.growthanddifferentiationfactor5coatedsuturestimulatestendonhealinginanachillestendonmodelinrats(生長(zhǎng)和分化因子5涂覆的縫線刺激大鼠跟腱模型的肌腱愈合).growthfactors2001;19:115-126；weilera,forsterc,huntp,falkr,jungt,unterhauserfn,bergmannv,schmidmaierg,haasnp.theinfluenceoflocallyappliedplatelet-derivedgrowthfactor-bbonfreetendongraftremodelingafteranteriorcruciateligamentreconstruction(前十字韌帶重建后局部施用血小板衍生生長(zhǎng)因子-bb對(duì)游離肌腱移植物重建的影響).americanjournalofsportsmedicine2004;32(4):881-891；dinesj,weberl,razzanop等.theeffectofgrowthdifferentiationfactor-5-coatedsuturesontendonrepairinaratmodel(大鼠模型中生長(zhǎng)分化因子-5涂覆的縫線對(duì)肌腱修復(fù)的作用).jshoulderelbowsurg2007;16:215s-221s；uggenc,dinesj,mcgarrym等.theeffectofrecombinanthumanplateletderivedgrowthfactorbbcoatedsuturesonrotatorcuffhealinginasheepmodel(綿羊模型中重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子bb涂覆的縫線對(duì)肌腱套愈合的作用).arthroscopy:2010:26(11):1456-1462。

所需要的是用于將pdgf遞送至肌腱以用于例如修復(fù)破裂的肌腱(例如破裂的跟腱)的改良縫線。

概述

一方面，本文提供治療腱病的方法，所述方法包括給予受累部位有效量的包含pdgf和緩沖液的組合物。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱鞘炎。在一些實(shí)施方案中，pdgf選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd。在一些實(shí)施方案中，pdgf是pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，pdgf是重組人(rh)pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約75μg和約7,500μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約500μg-約1,000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約5,000μg至約7,500μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約450μg-約3000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約400μg-約1000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約500μg-約900μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約600μg-約800μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約650μg-約750μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含每劑量約700μg的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，組合物的體積為約1.0-約2.0ml/劑量。在一些實(shí)施方案中，組合物的體積為約1.5ml/劑量。在一些實(shí)施方案中，緩沖液選自磷酸緩沖鹽溶液(“pbs”)、乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、三(羥甲基)氨基乙烷(“tris”)、n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(“hepes”)、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(“mops”)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(“mes”)、n-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(“ada”)、哌嗪-n,n'-雙(2-乙磺酸)(“pipes”)和n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“aces”)。在一些實(shí)施方案中，緩沖液是乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度介于約10mm和約100mm之間。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度約為20mm。在一些實(shí)施方案中，組合物的ph介于約4.0和約7.0之間。在一些實(shí)施方案中，組合物的ph約為6。在一些實(shí)施方案中，通過直接注射至受累部位來給藥。在一些實(shí)施方案中，受累部位是骨-肌腱連接處。在一些實(shí)施方案中，受累部位是肌腱。在一些實(shí)施方案中，腱病選自跟腱病、髕腱病、外上髁炎、內(nèi)上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些實(shí)施方案中，腱病是外上髁炎。在一些實(shí)施方案中，以單劑量給予組合物。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射給予組合物。在一些實(shí)施方案中，以不止一個(gè)劑量給予組合物。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射一周一次給予組合物達(dá)4周。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，該方法導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約60%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，該方法導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約65%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，該方法導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約70%。在一些實(shí)施方案中，該方法導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約80%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，該方法導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約85%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，該方法導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約90%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。

另一方面，本文提供治療腱病的方法，所述方法包括給予受累部位有效量的由pdgf和緩沖液組成的組合物。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱鞘炎。在一些實(shí)施方案中，pdgf選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd。在一些實(shí)施方案中，pdgf是pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，pdgf是重組人(rh)pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約75μg和約7,500μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約500μg-約1,000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約5,000μg至約7,500μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約450μg-約3000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約400μg-約1000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約500μg-約900μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約600μg-約800μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約650μg-約750μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含每劑量約700μg的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，組合物的體積為約1.0-約2.0ml/劑量。在一些實(shí)施方案中，組合物的體積為約1.5ml/劑量。在一些實(shí)施方案中，緩沖液選自磷酸緩沖鹽溶液(“pbs”)、乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、三(羥甲基)氨基乙烷(“tris”)、n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(“hepes”)、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(“mops”)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(“mes”)、n-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(“ada”)、哌嗪-n,n'-雙(2-乙磺酸)(“pipes”)和n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“aces”)。在一些實(shí)施方案中，緩沖液是乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度介于約10mm和約100mm之間。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度約為20mm。在一些實(shí)施方案中，組合物的ph介于約4.0和約7.0之間。在一些實(shí)施方案中，組合物的ph約為6。在一些實(shí)施方案中，通過直接注射至受累部位來給藥。在一些實(shí)施方案中，受累部位是骨-肌腱連接處。在一些實(shí)施方案中，受累部位是肌腱。在一些實(shí)施方案中，腱病選自跟腱病、髕腱病、外上髁炎、內(nèi)上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些實(shí)施方案中，腱病是外上髁炎。在一些實(shí)施方案中，以單劑量給予組合物。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射給予組合物。在一些實(shí)施方案中，以不止一個(gè)劑量給予組合物。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射一周一次給予組合物達(dá)4周。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，該方法導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約60%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，該方法導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約65%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，該方法導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約70%。在一些實(shí)施方案中該方法導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約80%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，該方法導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約85%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，該方法導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約90%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，該方法由給予受累部位有效量的由pdgf和緩沖液組成的組合物組成。

另一方面，本文提供用于治療腱病的包含有效量的pdgf和緩沖液的組合物。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱鞘炎。在一些實(shí)施方案中，pdgf選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd。在一些實(shí)施方案中，pdgf是pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，pdgf是重組人(rh)pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約75μg和約7,500μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約500μg-約1,000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約5,000μg至約7,500μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約450μg-約3000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約400μg-約1000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約500μg-約900μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約600μg-約800μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含介于每劑量約650μg-約750μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量包含每劑量約700μg的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，組合物的體積為約1.0-約2.0ml/劑量。在一些實(shí)施方案中，組合物的體積為約1.5ml/劑量。在一些實(shí)施方案中，緩沖液選自磷酸緩沖鹽溶液(“pbs”)、乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、三(羥甲基)氨基乙烷(“tris”)、n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(“hepes”)、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(“mops”)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(“mes”)、n-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(“ada”)、哌嗪-n,n'-雙(2-乙磺酸)(“pipes”)和n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“aces”)。在一些實(shí)施方案中，緩沖液是乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度介于約10mm和約100mm之間。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度約為20mm。在一些實(shí)施方案中，組合物的ph介于約4.0和約7.0之間。在一些實(shí)施方案中，組合物的ph約為6。在一些實(shí)施方案中，治療包括通過直接注射到受累部位來給予組合物。在一些實(shí)施方案中，受累部位是骨-肌腱連接處。在一些實(shí)施方案中，受累部位是肌腱。在一些實(shí)施方案中，腱病選自跟腱病、髕腱病、外上髁炎、內(nèi)上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些實(shí)施方案中，腱病是外上髁炎。在一些實(shí)施方案中，以單劑量給予組合物。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射給予組合物。在一些實(shí)施方案中，以不止一個(gè)劑量給予組合物。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射一周一次給予組合物達(dá)4周。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約60%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約65%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給藥約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約70%。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約80%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約85%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致肌腱在給藥約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約90%，其中在給藥后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，組合物由有效量的pdgf和緩沖液組成。

另一方面，本文提供與本文所述方法關(guān)聯(lián)的本文所述pdgf組合物的用途，除非另有說明或如從具體的上下文來看是顯然的。本文所述pdgf組合物還可用于制備用于本文所述方法的藥物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1表示rhpdgf-bb治療對(duì)肌腱細(xì)胞細(xì)胞遷移的作用。

圖2表示rhpdgf-bb治療對(duì)肌腱細(xì)胞細(xì)胞增殖的作用，通過brdu摻入測(cè)定。

圖3表示右腿肌腱-跟骨(calcaneous)連接處的注射部位。用使用28.5g針的胰島素注射器進(jìn)行注射。

圖4表示在處理用于生物力學(xué)測(cè)試的試驗(yàn)動(dòng)物后大鼠趾-跟-腓腸肌復(fù)合體的代表性圖像。

圖5表示跟骨(c)-跟腱(t)附著部位側(cè)邊矢狀切面的代表性圖像。

圖6a表示治療后7天膠原酶誘導(dǎo)的大鼠跟腱損傷模型中，肌腱內(nèi)施用重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子同種型bb(“rhpdgf-bb”)的總體觀察的肌腱生長(zhǎng)的劑量反應(yīng)研究結(jié)果。rhpdgf-bb治療后7天，單次注射中等(10.2μg)或高(102μg)劑量的rhpdgf-bb引起肌腱大小顯著增加。

圖6b表示rhpdgf-bb治療后21天同一研究的結(jié)果。治療后21天，單次注射高(102μg)劑量的rhpdgf-bb對(duì)肌腱大小的作用與僅用乙酸鈉緩沖液注射的作用相當(dāng)。

圖7是與圖6a和圖6b相同的數(shù)據(jù)的不同圖示，表示在rhpdgf-bb治療后7天和21天總體肌腱大小(0=無生長(zhǎng)至3=強(qiáng)烈生長(zhǎng))。

圖8表示在rhpdgf-bb治療后7天和21天跟骨附著部的肌腱寬度(μm±sem)。

圖9表示在rhpdgf-bb治療后7天和21天肌腱體處的肌腱寬度(μm±sem)。

圖10表示在rhpdgf-bb治療后7天和21天rhpdgf-bb對(duì)細(xì)胞增殖速率(細(xì)胞計(jì)數(shù)±sem)的作用。

圖11表示跟腱的機(jī)械性質(zhì)：在rhpdgf-bb治療后7天和21天的最大破裂載荷(n±sem)。

圖12表示iv給藥后的平均血清rhpdgf-bb濃度-時(shí)間值(concentration-timevalue)。

圖13表示在it給藥后的平均血清rhpdgf-bb濃度-時(shí)間值。

圖14a表示在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)從vicryl縫線釋放的rhpdgf-bb的量的體外釋放概況。

圖14b表示在48小時(shí)內(nèi)體外從4-0vicryl縫線累積釋放的rhpdgf-bb(平均值±sem)。

圖14c表示rhpdgf-bb的估計(jì)體內(nèi)累積劑量對(duì)比縫線涂覆溶液中的起始rhpdgf-bb濃度。

圖14d表示植入的4-0vicryl縫線長(zhǎng)度。

詳述

本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括而不限于專利、專利申請(qǐng)和科技參考文獻(xiàn)，均在此通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

本發(fā)明的組合物和方法出人意料地導(dǎo)致腱病治療得到改進(jìn)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法導(dǎo)致肌腱的強(qiáng)度提高和肌腱強(qiáng)度復(fù)原的速度加快。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法導(dǎo)致肌腱的強(qiáng)度提高。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法導(dǎo)致肌腱強(qiáng)度復(fù)原的速度加快。例如，隨著肌腱在損傷后愈合，肌腱的生物力學(xué)強(qiáng)度隨著肌腱愈合的過程而提高。給予本發(fā)明的組合物可導(dǎo)致更快地提高肌腱強(qiáng)度。雖不希望受理論束縛，但強(qiáng)度的這種更快速的提高可能有助于促進(jìn)肌腱的愈合；只要承載不進(jìn)一步加大肌腱損傷，肌腱上的承載一般提高肌腱的愈合反應(yīng)，因?yàn)樗话阋鸾M織重建和重構(gòu)改進(jìn)。肌腱強(qiáng)度的較快的初始提高(例如因給予本發(fā)明的組合物引起)可導(dǎo)致更快地在肌腱上開始承載的能力，因此進(jìn)一步提高肌腱愈合反應(yīng)。雖不希望受理論束縛，可通過細(xì)胞增殖和/或胞外基質(zhì)的產(chǎn)生增加，和/或通過組織的組構(gòu)改進(jìn)(例如胞外基質(zhì)組構(gòu)的改進(jìn))引起肌腱強(qiáng)度的改善。

此外，雖不希望受理論束縛，但本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)當(dāng)將本發(fā)明的組合物直接給予肌腱(例如通過注射)時(shí)，pdgf保持定位于給藥部位(例如在注射部位)。例如，如在下面的實(shí)施例5中的進(jìn)一步詳述，預(yù)料不到的是給予由緩沖液中的pdgf組成的組合物可引起pdgf保持定位于注射部位。

定義

本文所用術(shù)語“治療”是指設(shè)計(jì)以改變待治療病癥(例如腱病，例如腱退變、腱炎或腱鞘炎)的臨床病理的天然進(jìn)程的臨床干預(yù)。所需治療效果包括例如以下的一種或多種：減輕受累關(guān)節(jié)或肢體的疼痛或僵硬、提高受累關(guān)節(jié)或肢體的活動(dòng)性和強(qiáng)度、減緩腱病進(jìn)展的速率、減輕炎癥、提高肌腱強(qiáng)度、提高肌腱強(qiáng)度恢復(fù)的速率、改善或減輕病癥狀態(tài)和緩解或改善預(yù)后。例如，如果與腱病相關(guān)的一種或多種癥狀減輕或消除，則個(gè)體被成功“治療”。

本文所用術(shù)語“有效量”是指對(duì)達(dá)到所需治療或預(yù)防效果有效(以劑量計(jì)且持續(xù)所需的時(shí)間)的最低限度的量?？梢砸淮位蚨啻谓o藥來提供有效量。

本文提及的值或參數(shù)前的“約”也包括(和描述)涉及該值或參數(shù)本身的實(shí)施方案。

本文和隨附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)所指物，除非文中另明確說明。例如，提及“pdgf同二聚體”是提及一個(gè)或多個(gè)pdgf同二聚體，并包括其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同物等。

要理解的是，本文所述本發(fā)明的所有方面和實(shí)施方案包括“包含”、“包括”各方面和實(shí)施方案及“基本由各方面和實(shí)施方案組成”。要理解的是，“基本由所述要求組成的”的方法或組合物只包括規(guī)定的步驟或材料和不會(huì)在實(shí)質(zhì)上影響所述方法和組合物的基本特征和新的特征的步驟或材料(例如給予受累部位有效量的基本上由pdgf和緩沖液組成的組合物或基本上由有效量的緩沖溶液中的pdgf組成的組合物)。

血小板衍生生長(zhǎng)因子及其組合物

本文所用術(shù)語“血小板衍生生長(zhǎng)因子”或“pdgf”是指4種不同的pdgf同種型的任一種，其通過兩種不同的受體激活細(xì)胞反應(yīng)。所述同種型包括a(觀察到作為同二聚體(命名為pdgf-aa)并作為與b同種型的異二聚體(命名為pdgf-ab)的一部分)、b(觀察到作為同二聚體(命名為pdgf-bb)并作為與a同種型的異二聚體(命名為pdgf-ab)的一部分)、c(觀察到為同二聚體，其命名為pdgf-cc)和d(觀察到為同二聚體，其命名為pdgf-dd)。在本文中總的來說，術(shù)語“pdgf”一般是指已知的pdgf同二聚體和異二聚體(例如pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd)。

本文提供治療個(gè)體的腱病的方法和用于這些方法的組合物?？傮w來說，治療方法包括將包含pdgf的組合物給予患有腱病的個(gè)體的受累部位。準(zhǔn)確地講，治療方法包括將包含pdgf和緩沖液的組合物給予腱病的部位。在一些實(shí)施方案中，組合物包含pdgf和緩沖液(例如pdgf的緩沖溶液)。

在一些實(shí)施方案中，組合物包含pdgf和緩沖液。在一些實(shí)施方案中，pdgf包括選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc、pdgf-dd的pdgf二聚體及其混合物和衍生物。在一些實(shí)施方案中，pdgf二聚體是同二聚體。在一些實(shí)施方案中，pdgf同二聚體選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-cc和pdgf-dd。在一些實(shí)施方案中，pdgf同二聚體是pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，pdgf二聚體是異二聚體。在一些實(shí)施方案中，pdgf異二聚體是pdgf-ab。

在一些實(shí)施方案中，pdgf可獲自天然來源。在一些實(shí)施方案中，pdgf可通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的肽合成技術(shù)例如固相肽合成，來產(chǎn)生pdgf或其片段。

當(dāng)從天然來源獲得時(shí)，pdgf可來源于生物流體。在一些實(shí)施方案中，生物流體可包括與活體有關(guān)的任何處理或未處理的流體(包括血液)。生物流體還可包括血液成分，包括血小板濃縮液、單采血液成分提取的血小板、富集血小板的血漿、血漿、血清和新鮮冷凍的血漿。生物流體可包括從血漿分離并重新懸浮于生理液體或緩沖液的血小板。

當(dāng)通過重組dna技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，可將編碼單一單體(例如pdgfb鏈或a鏈)的dna序列插入培養(yǎng)的用于表達(dá)的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，以便隨后產(chǎn)生同二聚體(例如pdgf-bb或pdgf-aa)。在一些實(shí)施方案中，pdgf包括pdgf同二聚體(例如pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-cc或pdgf-dd)。在一些實(shí)施方案中，pdgf異二聚體可如下產(chǎn)生：將編碼異二聚體的兩個(gè)單體單元的dna序列插入培養(yǎng)的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，使翻譯的單體單元通過細(xì)胞加工產(chǎn)生異二聚體(例如pdgf-ab)。在一些實(shí)施方案中，pdgf包含pdgf異二聚體(例如pdgf-ab)。市售的重組人pdgf-bb可獲自許多商業(yè)來源，包括但不限于leincotechnologies,inc.(st.louis,mo)和r&dsystems,inc.(minneapolis,mn)。

在本文描述的一些實(shí)施方案中，pdgf包含重組人pdgf(“rhpdgf”)。在一些實(shí)施方案中，重組人pdgf(“rhpdgf”)是選自rhpdgf-aa、rhpdgf-bb、rhpdgf-ab、rhpdgf-cc、rhpdgf-dd的pdgf二聚體及其混合物和衍生物。在一些實(shí)施方案中，重組人pdgf是rhpdgf同二聚體。在一些實(shí)施方案中，重組人pdgf同二聚體選自rhpdgf-aa、rhpdgf-bb、rhpdgf-cc和rhpdgf-dd。在一些實(shí)施方案中，重組人pdgf同二聚體是rhpdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，重組人pdgf是rhpdgf異二聚體。在一些實(shí)施方案中，重組人pdgf異二聚體是rhpdgf-ab。

在一些實(shí)施方案中，pdgf-b包含一個(gè)或多個(gè)下列片段：完整人b鏈的氨基酸1-31、1-32、33-108、33-109和/或1-108。美國(guó)專利號(hào)5,516,896的圖15中提供人pdgfb鏈的完整氨基酸序列(氨基酸1-109)。要理解的是，本發(fā)明的pdgf-bb組合物可包含完整人pdgf-b(氨基酸1-109)及其片段的組合?？墒褂胮dgf的其它片段，例如美國(guó)專利號(hào)5,516,896中公開的片段。在一些實(shí)施方案中，pdgf-bb包含全長(zhǎng)人pdgf-b(氨基酸1-109)的至少65%。在一些實(shí)施方案中，pdgf-bb包含全長(zhǎng)人pdgf-b(氨基酸1-109)的至少75%、80%、85%、90%、95%或99%。

在一些實(shí)施方案中，組合物包含選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd的pdgf二聚體(例如rhpdgf二聚體)，且組合物包含以下濃度范圍的pdgf二聚體：約0.01mg/ml-約10.0mg/ml、約0.05mg/ml-約5.0mg/ml、約0.1mg/ml-約1.0mg/ml或約0.1mg/ml-約2.0mg/ml、約0.1mg/ml-約3.0mg/ml、約0.1mg/ml-約4.0mg/ml、約0.1mg/ml-約0.4mg/ml、約0.1mg/ml-約5.0mg/ml、約0.9mg/ml-約1.5mg/ml。在一些實(shí)施方案中，組合物包含濃度為約3.4mg/ml的pdgf二聚體。在一些實(shí)施方案中，組合物包含濃度為約1.0mg/ml的pdgf二聚體。在一些實(shí)施方案中，組合物包含濃度為約0.34mg/ml的pdgf二聚體。在一些實(shí)施方案中，組合物包含任一以下濃度的pdgf二聚體：約0.05mg/ml、約0.1mg/ml、約0.15mg/ml、約0.2mg/ml、約0.25mg/ml、約0.3mg/ml、約0.35mg/ml、約0.4mg/ml、約0.45mg/ml、約0.5mg/ml、約0.55mg/ml、約0.6mg/ml、約0.65mg/ml、約0.7mg/ml、約0.75mg/ml、約0.8mg/ml、約0.85mg/ml、約0.9mg/ml、約0.95mg/ml、約1.0mg/ml、約1.5mg/ml、約2.0mg/ml、約2.5mg/ml、約3.0mg/ml、約3.5mg/ml、約4.0mg/ml、約4.5mg/ml或約5.0mg/ml。要理解的是，這些濃度只是具體實(shí)施方案的實(shí)例，pdgf二聚體的濃度可落入上述任何濃度范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，pdgf二聚體(例如rhpdgf二聚體)是pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，組合物包含以下濃度范圍的pdgf-bb：約0.01mg/ml-約10.0mg/ml、約0.05mg/ml-約5.0mg/ml、約0.1mg/ml-約1.0mg/ml或約0.1mg/ml-約2.0mg/ml、約0.1mg/ml-約3.0mg/ml、約0.1mg/ml-約4.0mg/ml、約0.1mg/ml-約5.0mg/ml、約0.1mg/ml-約0.4mg/ml、約0.9mg/ml-約1.5mg/ml。在一些實(shí)施方案中，組合物包含濃度為約3.4mg/ml的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，組合物包含濃度為約1.0mg/ml的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，組合物包含濃度為約0.34mg/ml的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，組合物包含任一種下列濃度的pdgf-bb：約0.05mg/ml、約0.1mg/ml、約0.15mg/ml、約0.2mg/ml、約0.25mg/ml、約0.3mg/ml、約0.35mg/ml、約0.4mg/ml、約0.45mg/ml、約0.5mg/ml、約0.55mg/ml、約0.6mg/ml、約0.65mg/ml、約0.7mg/ml、約0.75mg/ml、約0.8mg/ml、約0.85mg/ml、約0.9mg/ml、約0.95mg/ml、約1.0mg/ml、約1.5mg/ml、約2.0mg/ml、約2.5mg/ml、約3.0mg/ml、約3.5mg/ml、約4.0mg/ml、約4.5mg/ml或約5.0mg/ml。要理解的是，這些濃度只是具體實(shí)施方案的實(shí)例，且rhpdgf-bb的濃度可落入上述任何濃度范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，pdgf選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd。不同量的pdgf可用于本發(fā)明的組合物?？刹捎玫膒dgf的量包括但不限于以下范圍的量：約1μg-約50mg、約10μg-約25mg、約100μg-約10mg、約250μg-約5mg和約450μg-約3mg。在一些實(shí)施方案中，pdgf是pdgf-bb。不同量的pdgf-bb可用于本發(fā)明的組合物?？刹捎玫膒dgf-bb的量包括但不限于以下范圍的量：約1μg-約50mg、約10μg-約25mg、約100μg-約10mg、約250μg-約5mg和約450μg-約3mg。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，可通過采用例如美國(guó)專利號(hào)6,221,625、5,747,273和5,290,708中描述的酶聯(lián)免疫測(cè)定法或本領(lǐng)域已知的用于測(cè)定pdgf濃度的任何其它測(cè)定法，來測(cè)定pdgf(例如rhpdgf)(包括pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd)的濃度。當(dāng)提供于本文中時(shí)，rhpdgf的摩爾濃度根據(jù)pdgf同二聚體的分子量(例如pdgf-bb，mw約25kda)確定。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，pdgf(例如rhpdgf)可以是高度純化的形式。在加到本發(fā)明的溶液中之前，本文使用的純化pdgf包括具有大于約95%(重量)pdgf的組合物。溶液可采用任何藥學(xué)上可接受的緩沖劑或稀釋劑制備。在一些實(shí)施方案中，pdgf可以是基本純的。在加入本發(fā)明的溶液中之前，本文使用的基本純化的pdgf包括具有約5%-約95%(重量)pdgf的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在加入本發(fā)明的溶液中之前，基本純化的pdgf包括具有約65%-約95%(重量)pdgf的組合物。在一些實(shí)施方案中，在加入本發(fā)明的溶液中之前，基本純化的pdgf包括具有約70%-約95%、約75%-約95%、約80%-約95%、約85%-約95%或約90%-約95%(重量)pdgf的組合物。可將純化的pdgf和基本純化的pdgf加入組合物中。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，pdgf可以是部分純化的。在富集血小板的血漿、新鮮冷凍的血漿或需要收集和分離以產(chǎn)生pdgf的任何其它血液產(chǎn)品的情況下，本文使用的部分純化的pdgf包括具有pdgf的組合物。本發(fā)明的實(shí)施方案預(yù)期，本文提供的任何pdgf同種型(包括同二聚體和異二聚體)可以是純化的或部分純化的。本發(fā)明的包含pdgf混合物的組合物可以部分純化的比例包含pdgf同種型或pdgf片段。在一些實(shí)施方案中，可按照美國(guó)申請(qǐng)順序號(hào)11/159,533(美國(guó)專利公布號(hào)2006/0084602a1)中披露的方法制備部分純化的和純化的pdgf。

在本文所述的任何實(shí)施方案中，高度純化的或部分純化的pdgf選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd。在本文所述的任何實(shí)施方案中，高度純化的或部分純化的pdgf是pdgf-bb。

緩沖液

在一些實(shí)施方案中，組合物包含pdgf和緩沖液，優(yōu)選藥學(xué)上可接受的緩沖液。適用于本發(fā)明的pdgf溶液的緩沖液可包括但不限于碳酸鹽、磷酸鹽(例如磷酸緩沖鹽溶液)、鹽水、組氨酸、乙酸鹽(例如乙酸鈉或乙酸銨)、酸性緩沖液(例如乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉和hcl)和有機(jī)緩沖液例如賴氨酸、tris緩沖液(例如三(羥甲基)氨基乙烷)、n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes)、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)、n-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(“ada”)、哌嗪-n,n'-雙(2-乙磺酸)(pipes)和n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(aces)。

可根據(jù)與pdgf的生物相容性及緩沖液阻止不良蛋白質(zhì)修飾的能力來選擇緩沖液。另外，可根據(jù)與宿主組織的相容性和藥學(xué)上的可接受性來選擇緩沖液。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含乙酸鈉緩沖液中的pdgf。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉緩沖液中的pdgf選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉緩沖液中的pdgf是rhpdgf-bb。

可以不同的摩爾濃度使用緩沖液，例如約0.1mm-約100mm、約1mm-約100mm、約10mm-約100mm、約1mm-約50mm、約5mm-約40mm、約10mm-約30mm或約15mm-約25mm或這些范圍內(nèi)的任何摩爾濃度。在一些實(shí)施方案中，以約20mm的摩爾濃度使用乙酸鹽緩沖液?？梢圆煌臐舛仁褂镁彌_液，例如約0.01mg/ml-約10mg/ml、0.05mg/ml-約5mg/ml、約0.5mg/ml-約5mg/ml、0.1mg/ml-約1mg/ml和約0.5mg/ml-約1mg/ml或這些范圍內(nèi)的任何濃度。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含pdgf的溶液可通過將凍干的pdgf溶于水中制備，其中在溶解前，將pdgf從合適的緩沖液中凍干。

按照本發(fā)明的一些實(shí)施方案，包含pdgf和緩沖液的組合物的ph的范圍可為約3.0-約8.0或約4.0-約7.0。在一些實(shí)施方案中，包含pdgf和緩沖液的組合物的ph的范圍為約5.0-約8.0，更優(yōu)選約5.5-約7.0，最優(yōu)選約5.5-約6.5或這些范圍內(nèi)的任何值。在本文描述的一些實(shí)施方案中，pdgf組合物的ph介于約4.0和約7.0之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，pdgf組合物的ph介于約5.0和約7.0之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，pdgf組合物的ph為約4.0、約5.0、約6.0或約7.0。在一些實(shí)施方案中，包含pdgf和緩沖液的組合物的ph可與pdgf或任何其它所需要的生物活性劑的持久穩(wěn)定性和功效相容。pdgf一般在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定。因此，按照一些實(shí)施方案，本文提供pdgf組合物的酸性貯存制劑。按照一些實(shí)施方案，包含pdgf和緩沖液的組合物的ph優(yōu)選為約3.0-約7.0，更優(yōu)選約4.0-約6.5。然而，在具有中性ph范圍的溶液中可使pdgf的生物活性最佳。因此，在一些實(shí)施方案中，本文提供包含pdgf和緩沖液的組合物的中性ph制劑。按照該實(shí)施方案，組合物的ph優(yōu)選為約5.0-約8.0，更優(yōu)選約5.5-約7.0，最優(yōu)選約5.5-約6.5。

在一些實(shí)施方案中，可通過本文所述緩沖液控制包含pdgf的溶液的ph。不同的蛋白質(zhì)顯示不同的ph范圍，在此范圍內(nèi)蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性主要受蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和電荷影響。ph范圍可影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)對(duì)蛋白水解降解、水解、氧化和可引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或生物活性改變的其它過程的敏感性。

在一些實(shí)施方案中，本文提供的pdgf組合物包含選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-cc、pdgf-dd和pdgf-ab的pdgf和選自pbs、乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、三(羥甲基)氨基乙烷、hepes、mops、mes、ada、pipes和aces的緩沖液。在一些實(shí)施方案中，本文提供的pdgf組合物包含rhpdgf-bb和選自pbs、乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、三(羥甲基)氨基乙烷、hepes、mops、mes、ada、pipes和aces的緩沖液。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和pbs。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和乙酸銨。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和乙酸。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和檸檬酸。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和檸檬酸鈉。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和三(羥甲基)氨基乙烷。在一些實(shí)施方案中，rhpdgf組合物包含pdgf-bb和hepes。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和mops。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和mes。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和ada。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和pipes。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和aces。

在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度介于1mm和1000mm之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度介于10mm和1000mm之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度介于100mm和1000mm之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度介于5mm和500mm之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度介于50mm和500mm之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度介于10mm和100mm之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度介于20mm和200mm之間。在本文描述的一些實(shí)施方案中，緩沖液的濃度為10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm。

在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-aa和約ph=6.0的20mm乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-ab和約ph=6.0的20mm乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-bb和約ph=6.0的20mm乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-cc和約ph=6.0的20mm乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，pdgf組合物包含rhpdgf-dd和約ph=6.0的20mm乙酸鈉。

劑量和給藥方案

可根據(jù)肌腱治療面積的相對(duì)大小，由在大鼠肌腱模型中鑒定的pdgf的有效劑量推算用于其它個(gè)體(例如人)的有效量。例如，人跟腱的治療面積約為大鼠跟腱治療面積的69倍，因此用于人患者的pdgf的有效量或劑量可約為在大鼠肌腱模型中確定的pdgf的有效量或劑量的69倍。

通過給予本文提供的pdgf組合物遞送的示例性有效量或劑量包括但不限于約450μg-約3,000μg/劑量、約1μg-約10,000μg/劑量，包括例如以下的任一種：約1μg-約7,500μg/劑量、約1μg-約5,000μg/劑量、約1μg-約2,500μg/劑量、約1μg-約1,000μg/劑量、約1μg-約500μg/劑量、約1μg-約250μg/劑量、約1μg-約100μg/劑量、約10μg-約10,000μg/劑量、約10μg-約7,500μg/劑量、約10μg-約5,000μg/劑量、約10μg-約2,500μg/劑量、約10μg-約1,000μg/劑量、約10μg-約500μg/劑量、約10μg-約250μg/劑量、約10μg-約100μg/劑量、約25μg-約10,000μg/劑量、約25μg-約7,500μ/劑量、約25μg-約5,000μg/劑量、約25μg-約2,500μg/劑量、約25μg-約1,000μg/劑量、約25μg-約500μg/劑量、約25μg-約250μg/劑量、約25μg-約100μg/劑量、約50μg-約10,000μg/劑量、約50μg-約7,500μg/劑量、約50μg-約5,000μg/劑量、約50μg-約2,500μg/劑量、約50μg-約1,000μg/劑量、約50μg-約500μg/劑量、約50μg-約250μg/劑量、約50μg-約100μg/劑量、約50μg-約100μg/劑量、約75μg-約10,000μg/劑量、約75μg-約7,500μg/劑量、約75μg-約5,000μg/劑量、約75μg-約2,500μg/劑量、約75μg-約1,000μg/劑量、約75μg-約500μg/劑量、約75μg-約250μg/劑量、約75μg-約125μg/劑量、約100μg-約200μg/劑量、約200μg-約300μg/劑量、約300μg-約500μg/劑量、約500μg-約1,000μg/劑量、約1,000μg-約2,500μg/劑量、約1,000μg-約5,000μg/劑量、約1,000μg-約7,500μg/劑量、約1,000μg-約10,000μg/劑量、約2,500μg-約5,000μg/劑量、約2,500μg-約7,500μg/劑量、約5,000μg-約7,500μg/劑量、約10,000μg-約50,000μg/劑量、約50,000μg-約100,000μg/劑量、約100,000μg-約200,000μg/劑量、約200,000μg-約300,000μg/劑量、約300,000μg-約400,000μg/劑量或約400,000μg-約500,000μg/劑量。

在一些實(shí)施方案中，以約400μg-約1000μg/劑量、約500μg-約900μg/劑量、約600μg-約800μg、約650μg-約750μg/劑量、約700μg/劑量給予pdgf。

在一些實(shí)施方案中，以50μl、100μl、150μl、200μl、250μl、300μl、350μl、400μl、450μl、500μl、550μl、600μl、650μl、700μl、750μl、800μl、850μl、900μl、950μl、1000μl或更大的體積給予本文提供的劑量。在一些實(shí)施方案中，以100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl、1000μl、1100μl、1200μl、1300μl、1400μl、1500μl、1600μl、1700μl、1800μl、1900μl、2000μl或更大的體積給予本文提供的劑量。在一些實(shí)施方案中，以約1000μl-約2000μl、約1250-約1750μl、約1300μl-約1600μl或約1500μl的體積給予本文提供的劑量。

本文提供的pdgf組合物可以單次日劑量給予，或者總?cè)談┝靠梢苑珠_的劑量給予，例如每日2次、3次或4次。在一些實(shí)施方案中，本文提供的pdgf組合物的單次日劑量可一天一次給予達(dá)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多天。pdgf組合物還可以低于每日的頻率給予，例如一周6次、一周5次、一周4次、一周3次、一周2次、一周1次、每?jī)芍芤淮巍⒚?周一次、每月一次、每?jī)稍乱淮?、?月一次、每4月一次、每5月一次或每6月一次。

在一些實(shí)施方案中，在一定時(shí)間內(nèi)間隔給予pdgf組合物。在一些實(shí)施方案中，一周一次給予pdgf組合物達(dá)1、2、3、4、5、6或更多個(gè)月。在一些實(shí)施方案中，一月兩次給予pdgf組合物達(dá)1、2、3、4、5、6或更多個(gè)月。在一些實(shí)施方案中，每月一次給予pdgf組合物達(dá)1、2、3、4、5、6或更多個(gè)月。

治療腱病的方法

本文所用術(shù)語“腱病”是指慢性肌腱損傷，例如腱退變、腱炎和腱鞘炎。示例性腱病包括但不限于跟腱病、髕腱病、外上髁炎即“網(wǎng)球肘”、內(nèi)上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。

本文所用術(shù)語“腱退變”是指肌腱的非炎性損傷，其特征在于因過度使用引起的通常呈在肌腱中和肌腱周圍的組織微撕裂形式的肌腱的肌腱內(nèi)變性，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域周圍肌腱修復(fù)細(xì)胞數(shù)目增加。肌腱的變性由肌腱的膠原纖維、細(xì)胞和血管成分的損傷或結(jié)構(gòu)破壞引起，其可降低肌腱的抗張強(qiáng)度，如果不治療的話，可導(dǎo)致肌腱破裂。在一些情況下，腱退變伴發(fā)肌腱的局灶性壞死或鈣化。

本文所用術(shù)語“腱炎”是指肌腱的炎性損傷，其特征在于像在腱退變觀察到的變性，但還伴有肌腱炎癥、血管破壞和炎性修復(fù)反應(yīng)。腱炎常常與成纖維細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞增殖以及出血和組織化肉芽組織有關(guān)。一般腱炎通過所涉及的身體部位來命名，例如跟腱炎(影響跟腱)或髕腱炎(亦稱為“跳躍膝”，影響髕腱)，但是有某些例外，例如外上髁炎(亦稱為“網(wǎng)球肘”，影響橈側(cè)腕短伸肌腱)。

可通過本發(fā)明的方法治療的腱病包括人體或哺乳動(dòng)物體中任何肌腱的腱病。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱病是腱鞘炎。

可通過本發(fā)明的方法治療的肌腱包括人體或哺乳動(dòng)物體的任何肌腱。肌腱的非限制性實(shí)例包括髕腱、脛骨前肌腱、跟腱、腘繩肌腱、半腱肌腱、股薄肌腱、外展肌腱、內(nèi)收肌腱、岡上肌腱、岡下肌腱、肩胛下肌腱、小圓肌腱、屈肌腱、股直肌腱、脛骨后肌腱和股四頭肌腱。

在一些實(shí)施方案中，肌腱是足或踝的肌腱。在一些實(shí)施方案中，足或踝的肌腱選自長(zhǎng)伸肌、長(zhǎng)屈肌、趾長(zhǎng)伸肌、趾短伸肌、腓骨長(zhǎng)肌、腓骨短肌、短屈肌、趾長(zhǎng)屈肌、脛骨后肌、跟腱和跖腱膜。

在一些實(shí)施方案中，肌腱是腿部肌腱。在一些實(shí)施方案中，腿部肌腱選自髕腱、脛骨前肌腱、跟腱、腘繩肌腱、半腱肌腱、股薄肌腱、外展肌腱和內(nèi)收肌腱。在一些實(shí)施方案中，肌腱選自屈肌腱、股直肌腱、脛骨后肌腱和股四頭肌腱。

在一些實(shí)施方案中，肌腱是肩部肌腱。在一些實(shí)施方案中，肩部肌腱選自岡上肌腱、岡下肌腱、肩胛下肌腱和小圓肌腱(肌腱套復(fù)合體)。

在一些實(shí)施方案中，肌腱是肘部肌腱。在一些實(shí)施方案中，肘部肌腱選自二頭肌腱、三頭肌腱、橈側(cè)腕短伸肌腱、伸肌總腱、指伸肌腱、小指伸肌腱、尺側(cè)腕伸肌腱、旋后肌腱、屈肌總腱、旋前圓肌腱、橈側(cè)腕屈肌腱、掌長(zhǎng)肌腱、尺側(cè)腕屈肌腱和屈指淺肌腱。在一些實(shí)施方案中，肌腱是腕部肌腱。在一些實(shí)施方案中，腕部肌腱選自二頭肌腱、三頭肌腱、橈側(cè)腕短伸肌腱、伸肌腱總腱、指伸肌腱、小指伸肌腱、尺側(cè)腕伸肌腱、旋后肌腱、屈肌腱總腱、旋前圓肌腱、橈側(cè)腕屈肌腱、掌長(zhǎng)肌腱、尺側(cè)腕屈肌腱、屈指淺肌腱、拇短屈肌腱、拇長(zhǎng)屈肌腱、拇短展肌腱、拇長(zhǎng)展肌腱、指深屈肌腱、指淺屈肌腱、拇短伸肌腱和拇長(zhǎng)伸肌腱。在一些實(shí)施方案中，肌腱是手部肌腱。在一些實(shí)施方案中，手部肌腱選自拇短屈肌腱、拇長(zhǎng)屈肌腱、拇短展肌腱、拇長(zhǎng)展肌腱、指深屈肌腱、指淺屈肌腱、拇短伸肌腱和拇長(zhǎng)伸肌腱。

在一些實(shí)施方案中，腱病是肌腱套腱病。在一些實(shí)施方案中，肌腱套腱病選自岡上肌腱病、岡下肌腱病、肩胛下肌腱病和小圓肌腱病。

在一些實(shí)施方案中，腱病是在肱骨外髁附著部的伸肌肌群起點(diǎn)、主要在橈側(cè)腕短伸肌(ecrb)肌腱中的外上髁炎即“網(wǎng)球肘”。在一些實(shí)施方案中，患有外上髁炎的受試者患有相關(guān)疼痛(例如持續(xù)至少約6個(gè)月)，如經(jīng)視覺模擬評(píng)分法(visualanalogscore,vas)報(bào)告為=50的疼痛所證明。在一些實(shí)施方案中，患有外上髁炎的受試者患有相關(guān)疼痛例如持續(xù)至少約6個(gè)月，該疼痛隨外上髁上的壓力和/或腕伸展受阻而加重。在一些實(shí)施方案中，腱病是位于旋前圓肌和肱骨內(nèi)髁的橈側(cè)腕屈肌起點(diǎn)之間界面上的內(nèi)上髁炎即“高爾夫球員肘”。

在一些實(shí)施方案中，腱病是髕腱病。在一些實(shí)施方案中，腱病是跟腱病。在一些實(shí)施方案中，腱病是足底筋膜炎。在一些實(shí)施方案中，腱病是足底內(nèi)側(cè)筋膜炎。在一些實(shí)施方案中，腱病是足底外側(cè)筋膜炎。

另一方面，本文提供治療腱病的方法，所述方法包括將有效量的包含pdgf和緩沖液的組合物給予受累部位。在一些實(shí)施方案中，pdgf選自pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab、pdgf-cc和pdgf-dd。在一些實(shí)施方案中，pdgf是pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約75μg和約7,500μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約500μg-約1,000μg之間的pdgf-bb。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約450μg至約3,000μg之間的pdgf。在一些實(shí)施方案中，有效量的組合物包含介于每劑量約5,000μg至約7,500μg之間的pdgf-bb。

在一些實(shí)施方案中，緩沖液選自磷酸緩沖鹽溶液(“pbs”)、乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、三(羥甲基)氨基乙烷(“tris”)、n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(“hepes”)、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(“mops”)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(“mes”)、n-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(“ada”)、哌嗪-n,n'-雙(2-乙磺酸)(“pipes”)和n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“aces”)。在一些實(shí)施方案中，緩沖液是乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度介于約10mm和約100mm之間。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度約為20mm。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的ph介于約4.0和約7.0之間。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉處于約ph6。

在一些實(shí)施方案中，通過直接注射至受累部位來給藥。在一些實(shí)施方案中，采用在有或沒有超聲引導(dǎo)的“密擊技術(shù)(pepperingtechnique)”完成直接注射?！懊軗艏夹g(shù)”是在把針插入觸痛區(qū)域后，在不使針露出皮膚的情況下，通過抽拉、重新定向針并將針重新插入來進(jìn)行多次少量注射的注射方法。

在一些實(shí)施方案中，受累部位是骨-肌腱連接處。在一些實(shí)施方案中，受累部位是肌腱。在一些實(shí)施方案中，腱病選自跟腱病、髕腱病、外上髁炎、內(nèi)上髁炎、足底筋膜炎和肌腱套腱病。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射給予組合物。在一些實(shí)施方案中，通過單次注射一周一次給予組合物達(dá)4周。

在一些實(shí)施方案中，腱病是腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱退變選自長(zhǎng)伸肌腱退變、長(zhǎng)屈肌腱退變、趾長(zhǎng)伸肌腱退變、趾短伸肌腱退變、腓骨長(zhǎng)肌腱退變、腓骨短肌腱退變、短屈肌腱退變、趾長(zhǎng)屈肌腱退變、脛骨后肌腱退變、跟腱腱退變和跖腱膜腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱退變選自髕骨腱退變、脛腓前腱退變、腘繩肌腱退變、半腱肌腱退變、股薄肌腱退變、展肌腱退變和收肌腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱退變選自屈肌腱退變、股直肌腱退變、脛骨后肌腱退變和股四頭肌腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱退變選自岡上肌腱退變、岡下肌腱退變、肩胛下肌腱退變和小圓肌腱退變。

在一些實(shí)施方案中，腱退變選自二頭肌腱退變、三頭肌腱退變、橈側(cè)腕短伸肌腱退變、伸肌總腱腱退變、指伸肌腱退變、小指伸肌腱退變、尺側(cè)腕伸肌腱退變、旋后肌腱退變、屈肌總腱腱退變、旋前圓肌腱退變、橈側(cè)腕屈肌腱退變、掌長(zhǎng)肌腱退變、尺側(cè)腕屈肌腱退變和屈指淺肌腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱退變選自二頭肌腱退變、三頭肌腱退變、橈側(cè)腕短伸肌腱退變、伸肌總腱腱退變、指伸肌腱退變、小指伸肌腱退變、尺側(cè)腕伸肌腱退變、旋后肌腱退變、屈肌總腱腱退變、旋前圓肌腱退變、橈側(cè)腕屈肌腱退變、掌長(zhǎng)肌腱退變、尺側(cè)腕屈肌腱退變、屈指淺肌腱退變、拇短屈肌腱退變、拇長(zhǎng)屈肌腱退變、拇短展肌腱退變、拇長(zhǎng)展肌腱退變、指深屈肌腱退變、指淺屈肌腱退變、拇短伸肌腱退變和拇長(zhǎng)伸肌腱退變。在一些實(shí)施方案中，腱退變選自拇短屈肌腱退變、拇長(zhǎng)屈肌腱退變、拇短展肌腱退變、拇長(zhǎng)展肌腱退變、指深屈肌腱退變、指淺屈肌腱退變、拇短伸肌腱退變和拇長(zhǎng)伸肌腱退變。

在一些實(shí)施方案中，腱病是腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱炎選自長(zhǎng)伸肌腱炎、長(zhǎng)屈肌腱炎、趾長(zhǎng)伸肌腱炎、趾短伸肌腱炎、腓骨長(zhǎng)肌腱炎、腓骨短肌腱炎、短屈肌腱炎、趾長(zhǎng)屈肌腱炎、脛骨后肌腱炎、跟腱腱炎和跖腱膜腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱炎選自髕腱炎、脛腓前腱炎、腘繩肌腱腱炎、半腱肌腱炎、股薄肌腱炎、展肌腱炎和收肌腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱炎選自屈肌腱炎、股直肌腱炎、脛骨后肌腱炎和股四頭肌腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱炎選自岡上肌腱炎、岡下肌腱炎、肩胛下肌腱炎和小圓肌腱炎。

在一些實(shí)施方案中，腱炎選自二頭肌腱炎、三頭肌腱炎、橈側(cè)腕短伸肌腱炎、伸肌總腱腱炎、指伸肌腱炎、小指伸肌腱炎、尺側(cè)腕伸肌腱炎、旋后肌腱炎、屈肌總腱炎、旋前圓肌腱炎、橈側(cè)腕屈肌腱炎、掌長(zhǎng)肌腱炎、尺側(cè)腕屈肌腱炎和屈指淺肌腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱炎選自二頭肌腱炎、三頭肌腱炎、橈側(cè)腕短伸肌腱炎、伸肌總腱腱炎、指伸肌腱炎、小指伸肌腱炎、尺側(cè)腕伸肌腱炎、旋后肌腱炎、屈肌總腱炎、旋前圓肌腱炎、橈側(cè)腕屈肌腱炎、掌長(zhǎng)肌腱炎、尺側(cè)腕屈肌腱炎、屈指淺肌腱炎、拇短屈肌腱炎、拇長(zhǎng)屈肌腱炎、拇短展肌腱炎、拇長(zhǎng)展肌腱炎、指深屈肌腱炎、指淺屈肌腱炎、拇短伸肌腱炎和拇長(zhǎng)伸肌腱炎。在一些實(shí)施方案中，腱炎選自拇短屈肌腱炎、拇長(zhǎng)屈肌腱炎、拇短展肌腱炎、拇長(zhǎng)展肌腱炎、指深屈肌腱炎、指淺屈肌腱炎、拇短伸肌腱炎和拇長(zhǎng)伸肌腱炎。

本發(fā)明的方法可導(dǎo)致以下一種或多種的改善：減輕受累關(guān)節(jié)或肢體的疼痛、減少受累關(guān)節(jié)或肢體的僵硬、增加受累關(guān)節(jié)或肢體的活動(dòng)性、提高受累關(guān)節(jié)或肢體的強(qiáng)度、降低腱病進(jìn)展的速率、減輕炎癥、提高肌腱強(qiáng)度或提高肌腱強(qiáng)度恢復(fù)的速率。用于測(cè)量治療的療效的各種方法包括但不限于：臂肩手失能評(píng)分(arm,shoulderandhandscore,dash)、視覺模擬評(píng)分法(vas)和握力測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致dash的治療前評(píng)分降低至少25%。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致vas的治療前評(píng)分降低至少25%。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致隨施加壓力和/或關(guān)節(jié)屈曲的疼痛減輕。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致隨施加壓力和/或關(guān)節(jié)屈曲的疼痛減輕且關(guān)節(jié)活動(dòng)性增加。在一些實(shí)施方案中，治療不會(huì)導(dǎo)致任何異常的骨生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，治療不會(huì)導(dǎo)致任何異常的肌腱生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，治療是安全的，且為受試者所耐受。在一些實(shí)施方案中，通過由以下的一種或多種方法鑒定的不良事件或異常情況的缺乏來評(píng)價(jià)組合物的安全性和耐受性：身體檢查、生命體征測(cè)定、實(shí)驗(yàn)室測(cè)試、x射線和/或mri成像。

在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致肌腱的強(qiáng)度提高。在一些實(shí)施方案中，治療導(dǎo)致更快速的肌腱強(qiáng)度恢復(fù)速率。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給予本發(fā)明的組合物約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天內(nèi)，肌腱強(qiáng)度提高至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給予本發(fā)明的組合物約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給予本發(fā)明的組合物約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約60%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給予本發(fā)明的組合物約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約65%。在一些實(shí)施方案中，與基線相比，治療導(dǎo)致在給予本發(fā)明的組合物約7天內(nèi)肌腱強(qiáng)度提高至少約70%。在一些實(shí)施方案中，在給予本發(fā)明的組合物約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天內(nèi)，肌腱達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%，其中在治療后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，肌腱在給予本發(fā)明的組合物約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約80%，其中在治療后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，肌腱在給予本發(fā)明的組合物約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約85%，其中在治療后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。在一些實(shí)施方案中，肌腱在給予本發(fā)明的組合物約7天內(nèi)達(dá)到其最終強(qiáng)度的至少約90%，其中在治療后約21天測(cè)量最終強(qiáng)度。可在例如動(dòng)物模型中，例如在大鼠膠原酶模型中測(cè)量肌腱強(qiáng)度，其中肌腱強(qiáng)度為測(cè)定的破裂載荷。實(shí)施例3中更詳細(xì)地描述了測(cè)量肌腱強(qiáng)度的實(shí)例。

藥盒

另一方面，本文提供包括裝有包含pdgf和緩沖液的組合物的藥盒。在一些實(shí)施方案中，藥盒包括裝有凍干pdgf的第一容器和裝有用于溶解凍干pdgf的緩沖液的第二容器。在一些實(shí)施方案中，藥盒包括裝有凍干pdgf和緩沖液的第一容器，和裝有用于溶解凍干pdgf和緩沖液的水的第二容器。在一些實(shí)施方案中，緩沖液選自磷酸緩沖鹽溶液(“pbs”)、乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、三(羥甲基)氨基乙烷(“tris”)、n-2-羥乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(“hepes”)、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(“mops”)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(“mes”)、n-(2-乙酰氨基)亞氨基二乙酸(“ada”)、哌嗪-n,n'-雙(2-乙磺酸)(“pipes”)和n-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸(“aces”)。在一些實(shí)施方案中，緩沖液是乙酸鈉。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度介于約10mm和約100mm之間。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的濃度約為20mm。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉的ph介于約4.0和約7.0之間。在一些實(shí)施方案中，乙酸鈉約處于ph6。

在一些實(shí)施方案中，藥盒還包括從商業(yè)、治療和用戶角度而言是需要的其它材料，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針、注射器和有使用說明的包裝說明書。本文所用術(shù)語“包裝說明書”是指通常包括在藥物商品包裝中的用法說明，內(nèi)有有關(guān)適應(yīng)癥、用法、劑量、給藥、禁忌、與包裝產(chǎn)品組合的其它藥物和/或有關(guān)使用這種藥物的警告事項(xiàng)的信息。

縫線

還提供pdgf涂覆的縫線和制作這種縫線的方法?？p線可用于例如治療個(gè)體的肌腱(例如治療肌腱撕裂)。合適的縫線包括例如由丙交酯和乙交酯共聚物制成的縫線(例如vicryl縫線(例如4-0vicryl縫線))。合適的涂覆方法包括例如浸漬涂布方法，例如描述于dinesj,weberl,razzanop等.theeffectofgrowthdifferentiationfactor-5-coatedsuturesontendonrepairinaratmodel(生長(zhǎng)分化因子-5涂覆的縫線對(duì)大鼠模型的肌腱修復(fù)的作用).jshoulderelbowsurg2007;16:215s-221s的浸漬涂布方法，其可任選改變以清除明膠。本申請(qǐng)人出人意料地發(fā)現(xiàn)，在缺乏明膠時(shí)可將高劑量的pdgf涂覆到某些類型的縫線上。在一些實(shí)施方案中，縫線不含明膠。在一些實(shí)施方案中，縫線涂層不含明膠。在一些實(shí)施方案中，縫線涂層不含聚乳酸、聚乙醇酸或乳酸-乙醇酸共聚物。在一些實(shí)施方案中，涂覆縫線的方法不包括利用明膠。在一些實(shí)施方案中，縫線涂層基本由pdgf組成。在一些實(shí)施方案中，縫線涂層由pdgf和緩沖液組成。在一些實(shí)施方案中，縫線涂層由pdgf組成。還可使用縫線治療個(gè)體，例如哺乳動(dòng)物。可使用本發(fā)明的縫線治療的哺乳動(dòng)物的非限制性實(shí)例包括人、寵物(例如狗、貓、兔、倉(cāng)鼠等)、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(例如小鼠、大鼠)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(例如馬、牛、綿羊、山羊等)。

在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為至少約10ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為至少約100ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為至少約1000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為至少約5000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為至少約6000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為約10-約20,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為約100-約10,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為約500-約8,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為約1000-約8,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為約4000-約8,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，加載到縫線上的pdgf的量為約6000-約7,000ngpdgf/cm縫線。

在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為至少約10ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為至少約100ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為至少約1000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為至少約5000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為至少約6000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為約10-約20,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為約100-約10,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為約500-約8,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為約1000-約8,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為約4000-約8,000ngpdgf/cm縫線。在一些實(shí)施方案中，體外測(cè)量的48小時(shí)內(nèi)從縫線釋放的pdgf的累積量為約6000-約7,000ngpdgf/cm縫線。測(cè)量pdgf體外累積釋放的合適方法包括例如實(shí)施例7中描述的方法。本發(fā)明的涂覆縫線可有利地提供體內(nèi)連續(xù)給藥。

提供下面的實(shí)施例僅用于說明目的，而不以任何方式意圖限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1：正常的和患病的原代人肌腱細(xì)胞因響應(yīng)rhpdgf-bb而增殖

本項(xiàng)研究測(cè)定了rhpdgf-bb是否直接激活來源于腱病患者的原代肌腱細(xì)胞的增殖和/或趨化性。該結(jié)論可支持rhpdgf-bb在腱病中的治療潛力的構(gòu)想。

患者與方法

患者

10名腱病患者參與了該項(xiàng)研究，包括5名跟腱腱病患者和5名脛后肌腱(ptt)的腱病患者。還包括進(jìn)行了全膝關(guān)節(jié)置換的另外5名患者。

肌腱細(xì)胞的原代培養(yǎng)

本應(yīng)棄去的肌腱組織獲自在對(duì)臨床適應(yīng)癥進(jìn)行的重建手術(shù)期間的正常和受損肌腱。這些組織包括跟腱或ptt的腱病部分，以及屈趾長(zhǎng)肌(fdl)肌腱組織、跟腱組織和髕腱組織的健康(無腱病)部分。原代肌腱細(xì)胞外植體培養(yǎng)完獲自這些組織并在傳代3-5次時(shí)進(jìn)行了試驗(yàn)。通過在實(shí)時(shí)pcr測(cè)定法中用特異性引物，評(píng)價(jià)肌腱細(xì)胞特異性基因scleraxis和膠原a1(i)、a2(i)和a1(iii)基因的表達(dá)，來證實(shí)肌腱細(xì)胞身份。

細(xì)胞增殖

將肌腱細(xì)胞單層培養(yǎng)物用胰蛋白酶消化，重新懸浮于含有0.5%透析胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基中，使之貼壁過夜，然后與已滴定濃度的rhpdgf-bb溫育24小時(shí)。采用市售可得的測(cè)定法(rocheappliedscience，indianapolis，in)，根據(jù)在細(xì)胞dna合成期間摻入的brdu，評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖速率的改變。對(duì)于每種劑量的rhpdgf-bb，對(duì)各培養(yǎng)物進(jìn)行一式三份的測(cè)定。

細(xì)胞遷移

肌腱細(xì)胞單層培養(yǎng)物用胰蛋白酶消化，重新懸浮于含有0.5%透析胎牛血清的dmem/f12培養(yǎng)基中，并接種到96孔chemotx?一次性細(xì)胞遷移系統(tǒng)(neuroprobe，gaithersburg，md)的上室。下室裝有已滴定濃度的rhpdgf-bb。使肌腱細(xì)胞跨分隔各室的膜遷移48小時(shí)。然后將96孔板離心，凍融三次以裂解遷移的細(xì)胞。采用市售可獲自promega(madison，wi)的試劑盒，根據(jù)胞質(zhì)的乳酸脫氫酶(ldh)，測(cè)量有活力的遷移細(xì)胞的量。

統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用單因素方差分析確定用rhpdgf-bb刺激是否以劑量依賴性方式刺激影響肌腱細(xì)胞增殖。

結(jié)果

僅肌腱細(xì)胞培養(yǎng)物而非對(duì)照肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)φ赵鷗淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)scleraxismrna，而肌腱細(xì)胞和成纖維細(xì)胞而非淋巴細(xì)胞表達(dá)膠原基因mrna。

在所有情況下，參與或不參與疾病進(jìn)程的肌腱組織的肌腱細(xì)胞通過加快brdu摻入而對(duì)rhpdgf-bb刺激起反應(yīng)(p<0.05，單因素方差分析)。該反應(yīng)是劑量依賴性的，并在10、50和150ng/ml的rhpdgf-bb下觀察到。即使所有細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)rhpdgf-bb刺激起反應(yīng)，但患者中在rhpdgf-bb刺激后摻入brdu的量仍有顯著差異。與對(duì)照無刺激的培養(yǎng)物相比，brdu的摻入增加至最小2.1±0.2倍到最大10.7±0.5倍。5名患者的肌腱細(xì)胞的反應(yīng)自相矛盾，其中較低rhpdgf-bb濃度(10ng/ml)而非較高rhpdgf-bb濃度(50和150ng/ml)在brdu摻入方面的增加較大。在來源于這些患者的腱病組織和正常組織兩者的肌腱細(xì)胞中觀察到這種自相矛盾的反應(yīng)。在響應(yīng)rhpdgf-bb刺激時(shí)，來源于4名患者的健康肌腱的肌腱細(xì)胞摻入的brdu是來源于患病組織的肌腱細(xì)胞摻入的brdu的2倍。在響應(yīng)rhpdgf刺激時(shí)，一名患者中，來自患病組織的肌腱細(xì)胞摻入的brdu是未參與疾病過程的組織的肌腱細(xì)胞摻入的brdu的4倍。圖2表示對(duì)于健康和患病肌腱細(xì)胞在第1天、第4天和第8天加入培養(yǎng)基的0、10、50和150ng/mlpdgf的brdu摻入(y軸，吸光度)。吸光度的增加與增殖增加一致，其中健康和患病肌腱細(xì)胞兩者在第1天響應(yīng)于pdgf。

在所有情況下，肌腱細(xì)胞對(duì)50ng/ml和150ng/ml的rhpdgf-bb都有趨化反應(yīng)。未將肌腱細(xì)胞暴露于10ng/mlrhpdgf-bb中進(jìn)行趨化性實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)低下。此外，反應(yīng)是劑量依賴性的，對(duì)150ng/mlrhpdgf-bb的趨化性大于對(duì)50ng/mlrhpdgf-bb的趨化性。然而，與對(duì)150ng/mlrhpdgf-bb作出的反應(yīng)相比，5名患者的肌腱細(xì)胞以更大的趨化性對(duì)50ng/mlrhpdgf-bb作出反應(yīng)，150ng/mlrhpdgf-bb中遷移細(xì)胞的數(shù)目顯著下降(p<0.05，雙側(cè)斯氏t檢驗(yàn))。與無刺激對(duì)照相比，患者中對(duì)rhpdgf-bb的最大趨化應(yīng)答有變化，增加至1.4±0.1倍到4.0±0.5倍。在來源于腱病或健康肌腱組織的匹配肌腱細(xì)胞培養(yǎng)物中，肌腱細(xì)胞對(duì)rhpdgf-bb的趨化性沒有統(tǒng)計(jì)顯著性差異(p>0.05)。圖1表示培養(yǎng)在濃度為0、50或150ng/ml的pdgf中的細(xì)胞的趨化性(y軸表示光密度增加)。用1250、2500、5000和10000個(gè)初始細(xì)胞評(píng)價(jià)遷移。

結(jié)論

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，來源于健康和腱病組織的肌腱細(xì)胞通過提高增殖速率和趨化率(chemotaxisrate)而對(duì)rhpdgf-bb起反應(yīng)。重要的是，一些患者的肌腱細(xì)胞顯示對(duì)pdgf的自相矛盾的反應(yīng)，其中比起較低的劑量，較高劑量引起較少作用。同樣重要的是，在某些情況下，相對(duì)于來自健康肌腱的肌腱細(xì)胞，來自患病肌腱的肌腱細(xì)胞對(duì)pdgf的反應(yīng)有差別，這就表明在臨床背景中適當(dāng)給藥可能是最重要的。

實(shí)施例2：rhpdgf-bb的安全性研究

局部注射試驗(yàn)。

本項(xiàng)研究的目的是確定在跟腱內(nèi)遞送給大鼠后rhpdgf-bb的局部毒性。跟腱內(nèi)給藥模擬臨床中用于治療外上髁炎的rhpdgf-bb的給藥途徑。在跟腱-跟骨連接處的注射部位模擬橈側(cè)腕短伸肌腱和外上髁骨的附著部位。

本項(xiàng)研究使用spraguedawley大鼠。在研究期間將動(dòng)物關(guān)養(yǎng)在相同的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施中。所有的關(guān)養(yǎng)和飼養(yǎng)管理都符合動(dòng)物福利法(animalwelfareact)和“實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)”。按照標(biāo)準(zhǔn)方案給大鼠供食和供水。因適當(dāng)?shù)难芯肯嚓P(guān)事件(例如麻醉)而撤除食物和水。在研究前使動(dòng)物適應(yīng)設(shè)施最少5天。該適應(yīng)期允許動(dòng)物適應(yīng)研究室環(huán)境。

三批不同濃度的無菌重組人pdgf-bb用于研究：(1)10.3mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中；(2)5.2mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中；和(3)1.7mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中。溶媒對(duì)照樣品為無菌20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)，其按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備。

采用用于處理試驗(yàn)品和對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程。準(zhǔn)確地講，在制備和給予劑量時(shí)戴上手套、面罩、實(shí)驗(yàn)服(即實(shí)驗(yàn)工作服)和護(hù)目用具。

將動(dòng)物隨機(jī)分成4組，每組n=60，每組有30只雄性和30只雌性。每組每只在四頭肌的骨腱連接處接受單次肌腱內(nèi)注射下列化合物：(1)20mm乙酸鈉；(2)20mm乙酸鈉中的51μgrhpdgf-bb；(3)20mm乙酸鈉中的156μgrhpdgf-bb；或(4)20mm乙酸鈉中的515μgrhpdgf-bb。用配置了28.5g針的胰島素注射器進(jìn)行注射。所有動(dòng)物在第1天通過單次跟腱內(nèi)注射接受試驗(yàn)品。第1組動(dòng)物接受乙酸鈉(naoac)，而第2-4組動(dòng)物接受劑量水平分別為36.69、112.23和370.50μg/mm²的rhpdgf-bb。

在rhpdgf-bb注射后1天、2周和6周處死每組的三分之一。在完成生命期治療組后，按照美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物福利法及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(usdaanimalwelfareact,theguideforcareanduseoflaboratoryanimals)(ilar出版，1996，nationalacademypress)和hss獸醫(yī)規(guī)程(hssveterinaryprocedures)，使動(dòng)物安樂死后，收獲組織。通過過量給予co2使動(dòng)物安樂死。通過缺乏反射(眨眼、回縮等)來證實(shí)死亡。

評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括臨床觀察、身體評(píng)價(jià)、體重和食物消耗測(cè)量、臨床病理、尸體剖檢、器官重量及注射和未注射后腿踝的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，包括檢查肌腱毒性和骨毒性。

對(duì)動(dòng)物進(jìn)行血液學(xué)評(píng)價(jià)、凝血研究和各種臨床化學(xué)研究。血液學(xué)評(píng)價(jià)包括下列測(cè)量：白細(xì)胞計(jì)數(shù)(wbc)；紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(rbc)；測(cè)定血紅蛋白(hb)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(mch)水平、血細(xì)胞比容(hct)和平均紅細(xì)胞hb濃度(mchc)；血小板計(jì)數(shù)；測(cè)定紅細(xì)胞平均體積(mcv)和評(píng)價(jià)白細(xì)胞差異，包括嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、%嗜中性粒細(xì)胞、%淋巴細(xì)胞、%單核細(xì)胞和%嗜酸性粒細(xì)胞)。凝血研究測(cè)量活化部分凝血活酶時(shí)間(aptt)和凝血酶原時(shí)間(pt)。臨床化學(xué)研究包括下列分析：堿性磷酸酶(alp)、葡萄糖(glu)、白蛋白(alb)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)、總膽紅素(tbil)、球蛋白(glob)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酸(ast)、膽固醇(chol)、鉀(k)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)、甘油三酯(trig)、氯離子(cl)、肌酸酐(creat)、血液尿素氮(bun)、鈉(na)、無機(jī)磷(phos)、鈣(ca)、a/g比和總蛋白質(zhì)(tprot)。

結(jié)果

以36.69μg/mm²、112.23μg/mm²、370.50μg/mm²的劑量水平給大鼠單次跟腱內(nèi)注射rhpdgf-bb對(duì)死亡率或?yàn)l死率無影響。此外，在臨床觀察、對(duì)體重或食物消耗的作用方面沒有與試驗(yàn)品相關(guān)的生物學(xué)顯著差異。

第2天，與對(duì)照(第1組)相比時(shí)，在對(duì)治療大鼠任何組進(jìn)行分析的血液學(xué)或尿液分析參數(shù)的任一個(gè)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)或生物學(xué)上的顯著差異。在白細(xì)胞和凝血參數(shù)方面觀察到變化，但這些變化與注射外源蛋白質(zhì)的最低急性炎癥反應(yīng)一致。此外，在幾個(gè)血清化學(xué)參數(shù)中還觀察到最小變化。然而，這些變化被視為個(gè)體動(dòng)物變異的結(jié)果，不被視為是生物學(xué)上顯著的，并且不與任何器官特異性毒性有關(guān)。

在第16和43天，與對(duì)照(第1組)相比時(shí)，對(duì)治療大鼠任何組進(jìn)行分析的血液學(xué)、白細(xì)胞、凝血或尿液分析參數(shù)的任一個(gè)，都無生物學(xué)上顯著的差異。

沒有試驗(yàn)品相關(guān)的宏觀觀察；所有宏觀觀察均被視為是偶然發(fā)生的。

在第2天，在大鼠的對(duì)照和治療組中觀察到急性出血和亞急性炎癥，雖然似乎頻率和嚴(yán)重程度在大鼠治療組中較大。在第16天，急性出血消退，且亞急性炎癥很少發(fā)生。大鼠治療組顯示，除淺屈肌腱和跟腱的肌腱細(xì)胞肥大和增生以外，上述肌腱的腱旁組織(paratendon)有纖維組織形成和新血管形成。到第43天，纖維組織形成和新血管形成的嚴(yán)重性得到改善；在大多數(shù)治療大鼠中，肌腱細(xì)胞仍顯示肥大和增生。

第二物種局部注射試驗(yàn)。

本項(xiàng)研究的目的在于確定在跟腱內(nèi)遞送給狗后，重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子(rhpdgf-bb)的局部毒性。

本研究使用比格犬(beagledog)。在研究期間將動(dòng)物關(guān)養(yǎng)在相同的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施中。所有的關(guān)養(yǎng)和飼養(yǎng)管理都符合動(dòng)物福利法和“實(shí)驗(yàn)室動(dòng)護(hù)管理和使用指南”。按照標(biāo)準(zhǔn)方案給狗供食和供水。因適當(dāng)?shù)难芯肯嚓P(guān)事件(例如麻醉)而撤除食物和水。在研究前使動(dòng)物適應(yīng)設(shè)施最少5天。該適應(yīng)期允許動(dòng)物適應(yīng)研究室環(huán)境。

三批不同濃度的無菌重組人pdgf-bb用于研究：(1)10mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中；(2)3mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中；和(3)1mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中。溶媒對(duì)照樣品是無菌20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)，其按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備。

采用用于處理試驗(yàn)品和對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程。準(zhǔn)確地講，在制備和給予劑量時(shí)戴上手套、面罩、實(shí)驗(yàn)服(即實(shí)驗(yàn)工作服)和護(hù)目用具。

將動(dòng)物隨機(jī)分成4組，每組n=24，每組有12只雄性和12只雌性。每組各個(gè)在四頭肌的骨腱連接處接受單次肌腱內(nèi)注射下列組合物：(1)20mm乙酸鈉；(2)20mm乙酸鈉中的1.5mgrhpdgf-bb；(3)20mm乙酸鈉中的4.5mgrhpdgf-bb；或(4)20mm乙酸鈉中的15mgrhpdgf-bb。用配置28.5g針的具有1.5ml固定劑量體積的胰島素注射器進(jìn)行注射。

在rhpdgf-bb注射后1天、2周和6周處死每組的三分之一。在完成生命期治療組后，按照美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物福利法及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(ilar出版，1996，nationalacademypress)和hss獸醫(yī)規(guī)程，使動(dòng)物安樂死后，收獲組織。在用戊巴比妥鈉(fatal-plus^?或合適的替代品)誘導(dǎo)的深度麻醉下通過放血使動(dòng)物安樂死。

對(duì)動(dòng)物進(jìn)行血液學(xué)評(píng)價(jià)、凝血研究和各種臨床化學(xué)研究。

血液學(xué)評(píng)價(jià)包括下列測(cè)量：白細(xì)胞計(jì)數(shù)(wbc)；紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(rbc)；測(cè)定血紅蛋白(hb)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(mch)水平、血細(xì)胞比容(hct)和平均紅細(xì)胞hb濃度(mchc)；血小板計(jì)數(shù)；測(cè)定紅細(xì)胞平均體積(mcv)和評(píng)價(jià)白細(xì)胞差異，包括嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、%嗜中性粒細(xì)胞、%淋巴細(xì)胞、%單核細(xì)胞和%嗜酸性粒細(xì)胞)。凝血研究測(cè)量活化部分凝血活酶時(shí)間(aptt)和凝血酶原時(shí)間(pt)。臨床化學(xué)研究包括下列分析：堿性磷酸酶(alp)、葡萄糖(glu)、白蛋白(alb)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)、總膽紅素(tbil)、球蛋白(glob)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酸(ast)、膽固醇(chol)、鉀(k)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)、甘油三酯(trig)、氯離子(cl)、肌酸酐(creat)、血液尿素氮(bun)、鈉(na)、無機(jī)磷(phos)、鈣(ca)、a/g比和總蛋白質(zhì)(tprot)。

還評(píng)價(jià)了局部組織的組織病理學(xué)，包括檢查肌腱毒性和骨毒性。

rhpdgf-bb對(duì)狗無毒性。

急性全身性毒性。本項(xiàng)研究的目的是確定通過靜脈內(nèi)注射給予的rhpdgf-bb的全身毒性。

本研究使用sprague-dawley大鼠。在研究期間將動(dòng)物關(guān)養(yǎng)在相同的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施中。所有的關(guān)養(yǎng)和飼養(yǎng)管理都符合動(dòng)物福利法和“實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南”。按照標(biāo)準(zhǔn)方案給動(dòng)物供食和供水。因適當(dāng)?shù)难芯肯嚓P(guān)事件(例如麻醉)而撤除食物和水。在研究前使動(dòng)物適應(yīng)設(shè)施最少5天。該適應(yīng)期允許動(dòng)物適應(yīng)研究室環(huán)境。

在本研究中使用在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中的3.0mg/ml和0.3mg/ml的無菌重組人pdgf-bb。給藥當(dāng)天，將部分0.3mg/ml溶液1:10稀釋于20mm乙酸鈉緩沖液中以產(chǎn)生同樣用于研究的0.03mg/ml溶液。對(duì)照樣品是無菌20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)，其按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備。

采用用于處理試驗(yàn)品和對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程。準(zhǔn)確地講，在制備和給予劑量時(shí)戴上手套、面罩、實(shí)驗(yàn)服(即實(shí)驗(yàn)工作服)和護(hù)目用具。

將動(dòng)物隨機(jī)分成4組，每組n=40(20只雄性和20只雌性/組)。劑量組1接受體積為1.4ml/kg的20mm乙酸鈉(ph6.0±0.5)的單次靜脈內(nèi)注射；劑量組2接受體積為1.4ml/kg的20mm乙酸鈉(ph6.0±0.5)中的3.0mg/mlrhpdgf-bb的單次靜脈內(nèi)注射；劑量組3接受體積為1.4ml/kg的20mm乙酸鈉(ph6.0±0.5)中的0.3mg/mlrhpdgf-bb的單次靜脈內(nèi)注射；劑量組4接受體積為1.4ml/kg的20mm乙酸鈉(ph6.0±0.5)中的0.03mg/mlrhpdgf-bb的單次靜脈內(nèi)注射。

評(píng)價(jià)動(dòng)物的死亡和嚴(yán)重毒性的其它體征。在研究期間，觀察動(dòng)物的成活率、臨床檢查、體重、食物消耗、眼科檢查和臨床病理。在第2天和第14天的尸體剖檢(10只雄性和10只雌性/組/時(shí)間點(diǎn))時(shí)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行臨床病理評(píng)價(jià)，包括血液學(xué)、凝血、血清化學(xué)和尿液分析以及完整的尸體剖檢。

實(shí)施例3：膠原酶誘導(dǎo)的大鼠跟腱損傷模型中肌腱內(nèi)(it)施用rhpdgf-bb的劑量反應(yīng)

本項(xiàng)研究的目的是測(cè)定大鼠肌腱膠原酶模型中肌腱內(nèi)施用rhpdgf-bb的劑量反應(yīng)，以證實(shí)rhpdgf-bb對(duì)跟腱損傷和重建的修復(fù)作用。我們假設(shè)肌腱內(nèi)遞送rhpdgf-bb可通過增量調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和恢復(fù)肌腱的生物力學(xué)強(qiáng)度引起肌腱修復(fù)。

對(duì)于間充質(zhì)源的細(xì)胞例如成骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子bb(rhpdgf-bb)是促有絲分裂的和趨化性的。因此，當(dāng)引入損傷的肌骨骼部位時(shí)，rhpdgf-bb將結(jié)締組織細(xì)胞和祖細(xì)胞吸引至治療部位，刺激其增殖，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目增加，所述細(xì)胞隨后沉積基質(zhì)以使受損組織再生。此外，如上述實(shí)施例1所述，暴露于pdgf-bb的肌腱細(xì)胞顯示dna合成和趨化增加。

膠原酶誘導(dǎo)的大鼠跟腱損傷模型

沒有單獨(dú)的充分確立的模型用于評(píng)價(jià)腱病。然而，膠原酶誘導(dǎo)的大鼠跟腱損傷模型被廣泛用于跟腱損傷。該模型引起被視為等同于腱炎的變性肌腱反應(yīng)，并且與上坡踏車(uphilltreadmill)過度使用模型(4個(gè)月)相比，快速形成腱炎損傷(3天內(nèi))。因此，它是篩選rhpdgf-bb對(duì)肌腱損傷的作用的快速模型。因此，該模型享有相對(duì)快的誘導(dǎo)期，而且作為rhpdgf-bb的治療作用的篩選，該模型是非常合適的，是臨床腱炎的代表。

總共一百六十五(165)只雄性spraguedawley大鼠用于該研究。給大鼠在其右跟腱注射膠原酶，接著在膠原酶注射后7天，在損傷部位進(jìn)行rhpdgf-bb或?qū)φ?僅緩沖液)的單次注射治療。使用帶有28.5g針的胰島素注射器，將膠原酶和rhpdgf-bb或?qū)φ?僅緩沖液)注射到大鼠右跟腱的骨-肌腱連接處附近。

將動(dòng)物分成11組，每組n=15，如表1所示。在利用該模型的文獻(xiàn)中所報(bào)道的研究，歷史上使用每治療組8-9只動(dòng)物用于生物力學(xué)測(cè)試，3-6只動(dòng)物用于組織學(xué)分析。

試驗(yàn)品和對(duì)照品

本研究對(duì)照組利用在無rhpdgf-bb的膠原酶處理的大鼠跟腱中大鼠肌腱的自然修復(fù)反應(yīng)作為對(duì)照以接近受損肌腱的自然愈合反應(yīng)。研究試驗(yàn)品使用rhpdgf-bb作為注射藥物以輔助肌腱的再生。對(duì)于間充質(zhì)源細(xì)胞，例如成骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子bb(rhpdgf-bb)是促有絲分裂的和趨化性的。因此，當(dāng)引入損傷的肌骨骼部位時(shí)，rhpdgf-bb將結(jié)締組織細(xì)胞和祖細(xì)胞吸引至治療部位，刺激其增殖，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目增加，所述細(xì)胞隨后沉積基質(zhì)以使受損組織再生。此外，如上述實(shí)施例1所示，暴露于pdgf-bb的肌腱細(xì)胞顯示dna合成和趨化性增加。

兩批不同濃度的無菌重組人pdgf-bb用于研究：(1)3.4mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中；和(2)0.34mg/mlrhpdgf-bb，在20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)中。溶媒對(duì)照樣品是無菌20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0±0.5)，其按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備。劑量包括：1.02μg、10.2μg和102μgrhpdgf-bb。制備兩種濃度的naoac緩沖液中的rhpdgf-bb：3.4mg/ml和0.34mg/ml。當(dāng)以30μl肌腱內(nèi)遞送時(shí)，達(dá)到102μg和10.2μg劑量水平。對(duì)于1.02μg劑量，0.34mg/ml溶液用20mmnaoac緩沖液1:10稀釋。膠原酶以粉末形式購(gòu)自sigma-aldrich(目錄號(hào)c-6885；st.louis,mo)，在含有50mmnah2po4和150mmnacl的pbs(ph7.4±0.5)中復(fù)溶至所需濃度(10mg/ml)。

在開始研究時(shí)，將3.4mg/mlrhpdgf-bb、0.34mg/mlrhpdgf-bb和20mm乙酸鈉緩沖液試驗(yàn)品的至少兩個(gè)未開啟、未使用的小瓶保持在相同的貯存條件(4℃)下作為用于給藥、穩(wěn)定性和濃度分析的小瓶。采用uv/vis分光光度測(cè)定法和反相hplc分析進(jìn)行穩(wěn)定性和劑量驗(yàn)證分析。

采用用于處理試驗(yàn)品和溶媒對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程。準(zhǔn)確地講，在制備和給予劑量時(shí)戴上手套、面罩、實(shí)驗(yàn)服(即實(shí)驗(yàn)工作服)和護(hù)目用具。

試驗(yàn)系統(tǒng)(動(dòng)物和動(dòng)物護(hù)理)

一百六十五(165)只雄性spraguedawley大鼠(charlesriverlaboratories，int'l，wilmington，ma)用于該研究。在研究選擇之前，通過肉眼檢查篩選所有動(dòng)物以確保健康和正常步態(tài)。根據(jù)其體重(在膠原酶注射時(shí)約315克)，選擇用于研究的所有動(dòng)物。以寫在大鼠尾部的獨(dú)特編號(hào)識(shí)別每只大鼠。根據(jù)大鼠體重將其隨機(jī)分配到每組。

在研究期間，將大鼠關(guān)養(yǎng)在同一實(shí)驗(yàn)室設(shè)施中。所有的關(guān)養(yǎng)和飼養(yǎng)管理符合動(dòng)物福利法和“實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南”。因適當(dāng)?shù)难芯肯嚓P(guān)事件(例如麻醉)而撤除食物和水，除此之外任意提供。在研究前使動(dòng)物適應(yīng)設(shè)施最少5天。該適應(yīng)期允許動(dòng)物適應(yīng)研究室環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

動(dòng)物(15只/組)，每籠關(guān)養(yǎng)4只，用異氟烷麻醉，夾住后踝區(qū)域，清潔用于注射。使用帶有28.5g針的胰島素注射器，將膠原酶(50μl，10mg/ml溶于含有50mmnah2po4和150mmnacl的pbs(ph7.4)中)注射到所有大鼠右跟腱的骨-肌腱連接處附近(圖3)。膠原酶注射后7天，使用帶有28.5g針的胰島素注射器，以30μl總體積給予溶媒或1.02μg、10.2μg或102μg的rhpdgf-bb治療。在7天(基線)、14天和28天將動(dòng)物處死用于肌腱損傷的組織病理學(xué)評(píng)價(jià)和生物力學(xué)評(píng)價(jià)。在每組15只動(dòng)物中，6只動(dòng)物用于組織病理學(xué)，取9只動(dòng)物的后腿(經(jīng)治療和未治療的后肢兩者)，切開，冷凍用于后續(xù)生物力學(xué)評(píng)價(jià)。下面提供生物力學(xué)評(píng)價(jià)的描述。

表1.治療組

生命期觀察和測(cè)量

至少每日觀察動(dòng)物直到處死。動(dòng)物治療符合美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物福利法(9cfr，第1、2和3部分)概述的規(guī)程及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(ilar出版，1996，nationalacademypress)和hss獸醫(yī)規(guī)程規(guī)定的條件。

在膠原酶注射前和處死后記錄體重。食物消耗是定性的。

在合適的研究終點(diǎn)將全部動(dòng)物處死。未觀察到不按時(shí)間表的動(dòng)物死亡。在生命期治療組完成后，按照美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物福利法及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(ilar出版，1996，nationalacademypress)以及hss獸醫(yī)規(guī)程，使動(dòng)物安樂死，并收獲組織。通過過量給予co2使動(dòng)物安樂死。通過缺乏反射(眨眼、回縮等)證實(shí)死亡。

總體肌腱大小

臨尸體剖檢前，按照以下體系對(duì)踝的厚度進(jìn)行評(píng)分：0=無生長(zhǎng)；1=輕微生長(zhǎng)；2=中等生長(zhǎng)；3=強(qiáng)烈生長(zhǎng)。

組織學(xué)

在尸體剖檢時(shí)，在整個(gè)足浸于10%中性緩沖福爾馬林(nbf)的情況下，小心地將皮膚從后踝區(qū)域上剝離，并彎曲固定。在10%nbf中最少12小時(shí)，并在10%甲酸中最少4-5天已脫鈣后，在中間和側(cè)面兩邊修整踝(其特別重點(diǎn)在肌腱-骨連接處)，以得到約?英寸厚的組織塊(具有肌腱附著的踝的中央部分)，并置于標(biāo)記的組織盒中。將經(jīng)修整的踝組織塊以矢狀方向加工用于石蠟包埋。使用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)，以200微米逐層切片切取代表性的4-6微米厚的切片，直到得到適宜觀察的骨-肌腱連接處，然后將這類切片用蘇木精和伊紅(h&e)、masson三色染液染色，并用于增殖細(xì)胞核抗原(pcna)的免疫組織化學(xué)(ihc)檢測(cè)。

在異氟烷麻醉期間，通過降主動(dòng)脈vacutainer給所有動(dòng)物采血用于最終的血清(采集10ml血液)。在室溫下將血液以l,800g離心10分鐘以得到血清。在2mleppendorf?管中提供多達(dá)1ml血清。分析前將血清保存在-70℃下。

如下所述進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。采用光學(xué)顯微鏡術(shù)，通過評(píng)價(jià)各組織學(xué)樣本(載玻片)的3個(gè)等距視野列(fieldcolumn)，來進(jìn)行不同參數(shù)的測(cè)量。

所測(cè)量的組織病理學(xué)參數(shù)包括：

(1)炎癥。通過h&e染色測(cè)定炎性細(xì)胞類型(嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。如下為炎癥評(píng)分：(a)0=無炎癥；(b)1=極少炎癥(100%單核細(xì)胞；無嗜中性粒細(xì)胞)；(c)2=中度炎癥(嗜中性粒細(xì)胞=19%；其余細(xì)胞為單核細(xì)胞)；和(d)3=明顯炎癥(嗜中性粒細(xì)胞=20%；其余細(xì)胞為單核細(xì)胞)。

(2)膠原組構(gòu)。通過h&e和三色染色，對(duì)膠原原纖維的組構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。如下為膠原組構(gòu)評(píng)分：(a)0=膠原原纖維完全無序；(b)1=一些膠原原纖維排列成行，但膠原束大部分高度無序；(c)2=膠原原纖維高度排列成行，然而膠原束仍有些無序；和(d)3=存在于組織中的膠原原纖維完全排列成行，沒有膠原束結(jié)構(gòu)被破壞。

(3)膠原纖維密度。通過h&e和三色染色，對(duì)修復(fù)組織中的膠原纖維密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。如下為膠原纖維密度評(píng)分：(a)0=低密度膠原束；(b)1=中等密度膠原束；和(c)2=極致密膠原束。

(4)修復(fù)部位的肌腱血管形成。通過h&e和三色染色，測(cè)定修復(fù)組織中的血管形成。如下為血管形成評(píng)分：(a)0=無(無血管形成存在)；(b)1=中度；和(c)2=大量。

(5)細(xì)胞增殖。采用pcna(增殖細(xì)胞核抗原)的免疫組織化學(xué)(ihc)，對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用目鏡測(cè)微計(jì)，在測(cè)微計(jì)上勾畫出39.4x197μm(7762μm2)或10x50單位的面積。對(duì)各樣本具有這種尺寸的3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)這3個(gè)等距視野中的增殖細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(6)肌腱寬度測(cè)量。在顯微鏡下并使用目鏡測(cè)微計(jì)，測(cè)定2個(gè)不同位置的肌腱尺寸。測(cè)定跟骨附著點(diǎn)(被認(rèn)為最能代表附著部位的厚度的不相切面(non-tangentialarea))和肌腱自身(遠(yuǎn)離具有相關(guān)增殖反應(yīng)的附著部位的肌腱體的最厚不相切面)的尺寸。

應(yīng)用mann-whitneyu檢驗(yàn)或kruskal-wallis檢驗(yàn)(非參數(shù)的)，分析半定量組織病理學(xué)數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析(1-wayanova)以及適當(dāng)?shù)亩嘀乇容^事后檢驗(yàn)，分析所有組間的可適用數(shù)據(jù)。

生物力學(xué)測(cè)試

99只動(dòng)物用于本項(xiàng)研究的這個(gè)部分。除對(duì)側(cè)無膠原酶處理肌腱以外，還對(duì)損傷誘導(dǎo)的肌腱進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)了總共123個(gè)生物力學(xué)樣本。上表1中概述了治療分配額。

在股骨處剝離腿，并剝離外皮(de-sleeved)至足中段。使用解剖刀，將跟腱-腓腸肌復(fù)合體從脛骨上剝離。簡(jiǎn)單地說，自跟骨附著部開始，將解剖刀沿脛骨移動(dòng)以分離復(fù)合體，留下大部分肌肉與肌腱連接以允許握住用于生物力學(xué)測(cè)試。在分離肌腱后，在與跖的連接處取出脛骨，保留附著的足用于遠(yuǎn)端握住以進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試(圖4)。將整個(gè)跖-跟腱-腓腸肌樣本包裹在浸泡鹽水的紗布中，在進(jìn)行生物力學(xué)分析前在-20℃下冷凍保存。

在機(jī)械測(cè)試前，使樣品在含有蛋白酶抑制劑的pbs中于4℃融化長(zhǎng)達(dá)4小時(shí)。將肌腱樣品拍干(patteddry)，除去過多的肌肉以利于將樣品固定在夾具上。用剪刀修整骨以利于固定。

所有機(jī)械測(cè)試在instron測(cè)試架(模型5566)上進(jìn)行，在測(cè)試架上在樣品浸入裝有pbs的浴液槽中的同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試。精確位移控制(displacementcontrol)用于各樣本，使用具±0.5%載荷準(zhǔn)確度的100n測(cè)壓元件測(cè)量所得載荷。所有數(shù)據(jù)采集和裝置控制用個(gè)人電腦進(jìn)行，其中可在10hz下獲取數(shù)據(jù)。

將樣本安裝在兩個(gè)粗糙表面板和砂紙之間的液壓夾具上，以防止在拉力測(cè)試期間樣品滑動(dòng)。將0.1n的預(yù)載荷施于樣本上，記錄樣本的長(zhǎng)度，接著在載荷0.1n和1n之間預(yù)循環(huán)10個(gè)循環(huán)。以0.1%/秒的應(yīng)變速率將單軸拉力位移施于構(gòu)件上，記錄所得載荷。測(cè)試樣品到拉伸損壞，直到達(dá)到骨折，觀察所測(cè)量的載荷<0.05n。測(cè)試前，測(cè)量了樣本的橫切面積。所有樣本經(jīng)盲測(cè)，無可辨認(rèn)的組別分類的指示。

測(cè)試后，分析所采集的數(shù)據(jù)以分別確定：(1)線性勁度，和(2)載荷-位移或應(yīng)力-應(yīng)變曲線的線性部分的彈性模量。還從載荷數(shù)據(jù)確定最大載荷和極限抗張強(qiáng)度?？蓱?yīng)用reimann求和法，用數(shù)字計(jì)算彈性韌度(elastictoughness)，其定義為直到峰值負(fù)荷的力位移曲線下面積。

采用相互作用雙因素方差分析和fisherlsd事后檢驗(yàn)(p<0.05)分析生物力學(xué)數(shù)據(jù)。應(yīng)用單因素方差分析(1-wayanova)，以及合適的多重比較事后檢驗(yàn)，分析所有組間的可適用數(shù)據(jù)。

應(yīng)力是歸一化至樣品的橫切面積的樣本上的載荷。應(yīng)變代表歸一化至樣品的起始長(zhǎng)度的樣本長(zhǎng)度的變化。因此，應(yīng)力與應(yīng)變曲線是載荷與位移曲線的歸一化形式(消除樣本尺寸方面的變異效應(yīng))。例如，較長(zhǎng)的肌腱將具有較大的總位移。另一方面，較寬的肌腱可比較窄的肌腱承受更大的載荷。樣本與樣本間尺寸的這些微小變異顯著影響它們可承載的載荷和位移的大小。當(dāng)這些變量通過它們尺寸歸一化為應(yīng)力和應(yīng)變時(shí)，分析不再依賴于樣本的尺寸。直接從載荷與位移曲線得出的所有性質(zhì)稱為結(jié)構(gòu)性質(zhì)。從歸一化應(yīng)力與應(yīng)變曲線得到的所有性質(zhì)稱為材料性質(zhì)。

線性勁度是從載荷與位移曲線的線性部分的最小二乘擬合求出的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。它代表了樣本的抗拉剛度。

彈性模量是從應(yīng)力與應(yīng)變曲線的線性部分的最小二乘擬合求出的材料性質(zhì)。它代表了肌腱材料的抗拉剛度。

最大載荷是在牽引期間樣本可以承受的最大載荷。

極限抗拉應(yīng)力是通過樣本的橫切面積歸一化的最大載荷。

韌性是材料對(duì)折斷或斷裂的抗性。其通常以能量單位來衡量，計(jì)算為直到失效的載荷-位移曲線下面積。

結(jié)果

rhpdgf-bb對(duì)總體踝厚度的作用

單次肌腱內(nèi)注射rhpdgf-bb后7天觀察到總體踝厚度的劑量依賴性增加(圖6a和圖7，在tx后第7天)，在注射后7天，中等(10.2μg)和高(102μg)劑量引起肌腱大小顯著增加。在tx后第21天，溶媒對(duì)照組(乙酸鈉緩沖液)以外的所有組顯示總體踝厚度減少，這就表明在治療后21天組織進(jìn)行重建(圖6b和圖7，在tx后第21天)。圖6a、圖6b和圖7中的數(shù)據(jù)以rhpdgf-bb治療后7天和21天的模擬量表(analogscale)為基礎(chǔ)(0=無生長(zhǎng)至3=強(qiáng)烈生長(zhǎng))。所報(bào)告的數(shù)據(jù)是每組n=6只動(dòng)物的踝厚度的平均值(±sem)。

rhpdgf-bb對(duì)體重的作用

在治療時(shí)，動(dòng)物的平均體重為314.48克。在治療后7天和21天，平均體重分別為396.4和467.0克。在任一時(shí)間點(diǎn)上，體重方面無治療相關(guān)性變化。

rhpdgf-bb對(duì)骨的作用

既未鑒定出異常的骨生長(zhǎng)，也未鑒定出再吸收。

rhpdgf-bb對(duì)跟骨附著處的肌腱寬度的作用

圖8顯示在治療后第7和21天在跟骨附著部測(cè)量的肌腱寬度(μm±sem)。所報(bào)告的數(shù)據(jù)為每組n=6只動(dòng)物跟骨附著部肌腱寬度的平均值(±sem)；*相對(duì)于溶媒對(duì)照組的p=0.01。使用目鏡測(cè)微計(jì)通過顯微鏡術(shù)測(cè)量肌腱寬度。

觀察到與溶媒相比，治療后7天(在tx后第7天)，用32.4μg/kgrhpdgf-bb劑量組的跟骨附著部肌腱寬度顯著增加(約137%增加)(圖8，在tx后第7天)。用3.24和324μg/kgrhpdgf-bb治療的動(dòng)物未顯示肌腱寬度顯著增加，但與溶媒對(duì)照相比時(shí)趨于較高。在治療后21天測(cè)出用或不用rhpdgf-bb治療的動(dòng)物的肌腱寬度之間無顯著差異(圖8，在tx后第21天)。與治療后第7天相比，到治療后第21天(圖8，在tx后第21天)，32.4μg/kgrhpdgf-bb劑量組顯示肌腱寬度減少40%，這就表明肌腱重建(圖8)。

rhpdgf-bb對(duì)肌腱中部處肌腱寬度的作用

圖9表示在治療后第7和21天所測(cè)量的肌腱中部(tendonmid-body)的肌腱寬度(μm±sem)。所報(bào)告的數(shù)據(jù)是每組n=6只動(dòng)物肌腱體處肌腱寬度的平均值(±sem)；*相對(duì)于溶媒組的p<0.05。使用目鏡測(cè)微計(jì)通過顯微鏡術(shù)測(cè)量肌腱寬度。

在治療后第7天，觀察到相對(duì)于溶媒對(duì)照組，用32.4μg/kgrhpdgf-bb劑量的肌腱寬度增加約97%(圖9，在tx后第7天)。相對(duì)于溶媒和非治療(tx)組，在3.24和324μg/kg劑量組中觀察到非顯著的劑量依賴性增加。到第21天，未觀察到組間肌腱寬度的顯著差異(圖9，在tx后第21天)。然而，與治療后第7天相比，在第21天，32.4μg/kgrhpdgf-bb劑量組顯示肌腱寬度減少116%，這就表明肌腱重建。

rhpdgf-bb對(duì)細(xì)胞增殖的作用

通過陽(yáng)性pcna免疫染色的細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞增殖的定量(圖10)。所報(bào)告的數(shù)據(jù)是每組n=6只動(dòng)物的細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值(±sem)；*相對(duì)于溶媒的p<0.05。對(duì)每個(gè)樣本具有相同尺寸的3個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

在rhpdgf-bb組中觀察到細(xì)胞密度劑量依賴性地增加。在治療后第7天，觀察到細(xì)胞增殖rhpdgf-bb劑量依賴性地增加(圖10，在tx后第7天)；相對(duì)于溶媒對(duì)照，在32.4和324μg/kg劑量組中觀察到細(xì)胞增殖顯著增加(圖10，在tx后第7天)，表明分別增加約60%和約72%。然而，到第21天，未觀察到細(xì)胞增殖的顯著差異(圖10，在tx后第21天)。對(duì)于32.4和324μg/kgrhpdgf-bb劑量組，觀察到回復(fù)到溶媒對(duì)照增殖水平，表明rhpdgf-bb的增殖反應(yīng)是可逆的(圖10，在tx后第21天)。

rhpdgf-bb對(duì)炎癥的作用

在所有時(shí)間點(diǎn)上，所有組間都觀察到由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞組成的輕微至中度炎癥(表2)。

表2：在治療后7和21天采用模擬量表(0=無炎癥至3=重度炎癥)的rhpdgf-bb對(duì)炎癥的作用。

rhpdgf-bb對(duì)血管形成的作用

在所有組間和時(shí)間點(diǎn)間未觀察到血管形成的顯著變化(表3)。

表3：在治療后7和21天采用模擬量表(0=無至2=重度)的rhpdgf-bb對(duì)血管形成的作用。

rhpdgf-bb對(duì)膠原密度的作用

在所有組間和時(shí)間點(diǎn)間未觀察到膠原密度的顯著變化(表4)。

表4：在治療后7和21天采用模擬量表(0=無至2=重度)的rhpdgf-bb對(duì)膠原密度的作用。

rhpdgf-bb對(duì)膠原組構(gòu)的作用

所有組間和時(shí)間點(diǎn)間未觀察到膠原組構(gòu)的顯著變化(表5)。

表5：在治療后7和21天采用模擬量表(0=無至3=高度有序)的rhpdgf-bb對(duì)膠原組構(gòu)的作用。

生物力學(xué)：rhpdgf-bb對(duì)最大破裂載荷的作用

在該模型中，未治療組根據(jù)最大破裂載荷值隨時(shí)間而自發(fā)修復(fù)(圖11)。在治療后第7天，在32.4μg/kg劑量組相對(duì)于溶媒對(duì)照和未治療組，破裂的平均最大載荷值顯著增加(分別增加約43%和27%)(圖11，在tx后第7天)。到治療后第21天，與溶媒對(duì)照相比，最大破裂載荷仍顯著提高(圖11，在tx后第21天)。在治療后的第21天，32.4μg/kg劑量組和未治療組的平均最大載荷相似，表明rhpdgf-bb治療相對(duì)于未治療提高修復(fù)速率。然而，在給藥后第21天，與32.4μg/kg劑量組和未治療組相比，溶媒和324μg/kgrhpdgf-bb組具有顯著較低的最大破裂載荷值。所報(bào)告的數(shù)據(jù)是每組n=9只動(dòng)物的最大破裂載荷的平均值(±sem)；+相對(duì)于“溶媒”組的p<0.05，**相對(duì)于“未治療”組的p<0.05。

表6表示未受損對(duì)側(cè)肌腱和rhpdgf-bb治療和未治療的肌腱的機(jī)械強(qiáng)度。

表6：在膠原酶注射后7、14和28天跟腱的最大破裂載荷值(n±sem)。

所報(bào)告的數(shù)據(jù)是每組n=9只動(dòng)物的最大破裂載荷的平均值(±sem)。

在膠原酶注射后第14天32.4μg/kgrhpdgf-bb組的平均最大破裂載荷值(26.8n)相對(duì)于膠原酶注射后第14天的未受損肌腱(19.03n)增加41%。這就表明在32.4μg/kgrhpdgf-bb組中，生物力學(xué)性質(zhì)比正常發(fā)育中的肌腱成熟得快。此外，32.4μg/kgrhpdgf-bb組在膠原酶注射后第14天的平均最大破裂載荷(26.8n)接近膠原酶注射后第28天的未受損肌腱(27.98n)。未受損和未治療(已注射膠原酶)組在第7、14和28天的最大破裂載荷值相似。在第14天(在tx后第7天)，32.4μg/kgrhpdgf-bb組的最大破裂載荷值比溶媒、未受損和未治療組的高，分別增加43%、41%和27%。然而，在第28天(在tx后第21天)，在未受損、未治療和32.4μg/kgrhpdgf-bb組中的最大破裂載荷相似(表6)。

結(jié)論

生命期參數(shù)

踝厚度結(jié)果表明，rhpdgf-bb治療后7天肌腱大小方面有劑量依賴性增加，但到21天，生長(zhǎng)受阻，且組織重建成減小的尺寸。

跨組間和時(shí)間點(diǎn)間體重?zé)o顯著差異。

微觀評(píng)價(jià)

rhpdgf-bb在性質(zhì)上增加細(xì)胞增殖，尤其是成纖維細(xì)胞的增殖。細(xì)胞增殖和顯微鏡下的肌腱寬度的增加是可逆的，表明可能的適應(yīng)期以重建組織。

在本研究條件下，在一次肌腱內(nèi)遞送后的3周時(shí)間內(nèi)未觀察到來自rhpdgf-bb的局部不良作用。沒有異常的骨或肌腱生長(zhǎng)，且未鑒定出骨再吸收。炎癥是單核細(xì)胞性質(zhì)的。細(xì)胞的形態(tài)學(xué)是成纖維細(xì)胞性質(zhì)的。

生物力學(xué)

生物力學(xué)破裂載荷數(shù)據(jù)表明，與無rhpdgf-bb治療的組群相比，在肌腱的機(jī)械強(qiáng)度方面，rhpdgf-bb開始較快的修復(fù)反應(yīng)。雖然到治療后第21天，細(xì)胞增殖和肌腱寬度回復(fù)到基線，但是這并不導(dǎo)致肌腱強(qiáng)度的生物力學(xué)損失。

總結(jié)

該項(xiàng)研究中的生物學(xué)和生物力學(xué)結(jié)果證實(shí)了注射至肌腱的rhpdgf-bb的局部安全性。在一次rhpdgf-bb注射后，存在肌腱生長(zhǎng)的初始階段，肌腱生長(zhǎng)在21天時(shí)間內(nèi)減弱。該研究在顯微鏡下使用目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量了肌腱寬度，并使用pcna免疫染色測(cè)量細(xì)胞增殖。得自這些測(cè)量的結(jié)果表明，在治療后7天，用32.4μg/kgrhpdgf-bb治療的動(dòng)物在顯微鏡下的肌腱寬度和細(xì)胞增殖增加。然而，到治療后第21天，肌腱寬度和增殖回復(fù)至對(duì)照水平。在rhpdgf-bb注射至肌腱中后，在21天時(shí)間內(nèi)既未觀察到異位骨或骨異常，也未觀察到肌腱生長(zhǎng)異常。

顯微鏡下肌腱寬度和細(xì)胞增殖的早期增加對(duì)應(yīng)的是肌腱的機(jī)械強(qiáng)度的增強(qiáng)。雖然到治療后第21天細(xì)胞增殖和肌腱寬度回復(fù)到基線，但是這并不導(dǎo)致肌腱強(qiáng)度的生物力學(xué)損失，而是使肌腱生物力學(xué)改進(jìn)持續(xù)。

該項(xiàng)研究的結(jié)果在臨床上對(duì)于治療外上髁炎患者可能尤其引人注目。在外上髁炎中，存在橈側(cè)腕短伸肌(ecrb)肌腱的退行性病變，表現(xiàn)為疼痛和受累臂和手耐受載荷的功能性減退。預(yù)期作為在該研究中描述的大鼠跟腱病模型所顯示的rhpdgf-bb治療的結(jié)果，肌腱的增加的生物力學(xué)強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)改變將在臨床上轉(zhuǎn)化成給患有外上髁炎的患者止痛并恢復(fù)該患者的功能。

實(shí)施例4.靜脈內(nèi)給予rhpdgf-bb后在sprague-dawley大鼠中重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子-bb(rhpdgf-bb)的藥代動(dòng)力學(xué)

本項(xiàng)研究的目的是評(píng)價(jià)作為單次靜脈內(nèi)劑量給予雄性sprague-dawley大鼠的rhpdgf-bb的藥代動(dòng)力學(xué)。設(shè)計(jì)該研究以評(píng)價(jià)在靜脈內(nèi)給藥后新鮮rhpdgf-bb自體液(血清)的清除率。為了更好地理解rhpdgf-bb的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，測(cè)定了靜脈內(nèi)暴露之后的全身清除率。

我們假設(shè)rhpdgf-bb在靜脈內(nèi)給藥后可具有快速的清除率。

研究設(shè)計(jì)

大鼠模型

大鼠是用于評(píng)價(jià)各類化學(xué)藥品的藥代動(dòng)力學(xué)和毒性的常用嚙齒動(dòng)物模型，對(duì)于大鼠存在大量的歷史數(shù)據(jù)庫(kù)?？偣菜氖?48)只雄性spraguedawley大鼠用于該研究。動(dòng)物被分成2組，為6只動(dòng)物/組/時(shí)間點(diǎn)(表7)。按照研究目的、本發(fā)明人的學(xué)術(shù)需要和同期學(xué)術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)該研究以使用可接受的最少數(shù)目的動(dòng)物。該設(shè)計(jì)提供足夠的組大小可供進(jìn)行有意義的數(shù)據(jù)分析。用胰島素注射器(28.5g)通過靜脈內(nèi)遞送將rhpdgf-bb給予外側(cè)尾靜脈。

試驗(yàn)品和對(duì)照品

試驗(yàn)品是0.4mg/ml在20mm乙酸鈉緩沖液(ph:6.0+/-0.5)中的rhpdgf-bb。對(duì)照品是20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0+/-0.5)。

在開始研究時(shí)，將0.4mg/mlrhpdgf-bb和20mm乙酸鈉(乙酸鹽)緩沖液試驗(yàn)品的至少兩個(gè)未開啟、未使用的小瓶保持在相同的貯存條件(4℃)下作為用于給藥、穩(wěn)定性和濃度分析的小瓶。進(jìn)行了穩(wěn)定性和劑量驗(yàn)證分析，其由uv/vis分光光度測(cè)定法和反相hplc分析(附錄ii)構(gòu)成。

采用用于處理試驗(yàn)品和對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程。準(zhǔn)確地講，在制備和給予劑量時(shí)戴上手套、面罩、實(shí)驗(yàn)服(即實(shí)驗(yàn)工作服)和護(hù)目用具。

測(cè)試系統(tǒng)

四十八(48)只雄性spraguedawley大鼠用于該研究。根據(jù)其體重選擇用于該研究的大鼠。在治療時(shí)，平均體重約為227克。通過用不褪色記號(hào)筆寫上的唯一尾部數(shù)字來辨別每只大鼠。因適當(dāng)?shù)难芯肯嚓P(guān)事件(例如麻醉)而撤除食物和水，除此之外任意提供。在研究選擇之前，通過肉眼檢查篩選所有動(dòng)物。

給予試驗(yàn)品

選擇靜脈內(nèi)遞送以實(shí)現(xiàn)100%生物利用度和血清中rhpdgf-bb的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。根據(jù)之前的大鼠肌腱膠原酶模型(參見實(shí)施例3)中肌腱內(nèi)施用rhpdgf-bb的劑量反應(yīng)功效研究來選擇劑量水平。根據(jù)大鼠稱重為0.227kg，用于該研究的最大劑量濃度為100μg或0.44mg/kg。

給四十八只大鼠稱重，并隨機(jī)分配到2個(gè)組，每組二十四只大鼠。按大鼠體重將其隨機(jī)分配到每組。

在給藥前記錄體重。第1組動(dòng)物按1.1ml/kg的目標(biāo)劑量體積，接受0.44mg/kg(440μg/kg)的rhpdgf-bb的單次靜脈內(nèi)劑量。第2組動(dòng)物按1.1ml/kg的目標(biāo)劑量體積，接受溶媒對(duì)照(naoac緩沖液)。使用胰島素注射器(28.5g)通過外側(cè)尾靜脈法實(shí)現(xiàn)靜脈內(nèi)注射。采集約300μl血清。

表7.治療組

*采血時(shí)間：

所有組的動(dòng)物1-6=基線、1分鐘、l小時(shí)、48小時(shí)

所有組的動(dòng)物7-12=基線、5分鐘、4小時(shí)、72小時(shí)

所有組的動(dòng)物13-18=基線、10分鐘、8小時(shí)、96小時(shí)

所有組的動(dòng)物19-24=基線、20分鐘、24小時(shí)、168小時(shí)

臨床觀察

至少每日觀察動(dòng)物直到處死。在rhpdgf-bb注射之前和處死之前記錄體重。食物消耗是定性的。

在合適的研究終點(diǎn)將全部動(dòng)物處死。在生命期治療組完成后，通過過量給予co2使動(dòng)物安樂死。通過缺乏反射(眨眼、回縮等)證實(shí)死亡。在該研究中未進(jìn)行肉眼檢查(gross)或組織病理學(xué)。未記錄到不按時(shí)間表的動(dòng)物死亡。

采集血清

在血清管中采集約600μl血液，在室溫下以1,800g離心10分鐘得到血清。在2mleppendorf管中提供約300μl血清。在分析前將血清保存在-70℃下。

血清分析

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量rhpdgf-bb血清濃度。利用得自r&dsystems的quantikineelisa試劑盒定量測(cè)量rhpdgf-bb。

藥代動(dòng)力學(xué)分析

利用winnonlin的非區(qū)室模塊計(jì)算下列參數(shù)：終末半衰期(t1/2)、tmax、cmax、auc0-最后和cl。如采用quantikineelisa試劑盒測(cè)定法在血清中所測(cè)定的，利用不同時(shí)間點(diǎn)上存在的rhpdgf-bb的量進(jìn)行分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)

統(tǒng)計(jì)分析限于說明性參數(shù)，例如平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變差系數(shù)(適當(dāng)時(shí))。

結(jié)果

所有動(dòng)物在治療時(shí)的平均體重為227克。動(dòng)物接受440.53μg/kgrhpdgf-bb的平均劑量。

平均血清rhpdgf-bb濃度-時(shí)間值見圖12。給藥后1分鐘達(dá)到cmax(6161.2ng/ml)。之后在5分鐘和1小時(shí)之間rhpdgf-bb濃度下降。自1小時(shí)至168小時(shí)，rhpdgf-bb濃度低于定量測(cè)定的水平(<0.156ng/ml)。

表8表示雄性sprague-dawley大鼠中iv給予rhpdgf-bb的藥代動(dòng)力學(xué)分布。遞送的平均劑量為440μg/kg。在0.0167小時(shí)(1分鐘)時(shí)觀察到tmax，其cmax為6161.2ng/ml。auc0-最后為375.64小時(shí)*ng/ml，清除率(cl)為17.5ml/分鐘/kg。

表8：iv給藥的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析

結(jié)論

靜脈內(nèi)(iv)給予rhpdgf-bb導(dǎo)致高的初始全身暴露。它是立即清除型分子，其在給藥后頭10分鐘內(nèi)快速?gòu)难褐星宄?/p>

實(shí)施例5.在肌腱內(nèi)給予rhpdgf-bb后spraguedawley大鼠中rhpdgf-bb的藥代動(dòng)力學(xué)。

本項(xiàng)研究的目的是評(píng)價(jià)作為單次肌腱內(nèi)劑量給予雄性sprague-dawley大鼠的rhpdgf-bb的藥代動(dòng)力學(xué)。設(shè)計(jì)該研究以評(píng)價(jià)在肌腱內(nèi)遞送后rhpdgf-bb全身性暴露和清除率。

研究設(shè)計(jì)

大鼠模型

大鼠是用于評(píng)價(jià)各類化學(xué)藥品的藥代動(dòng)力學(xué)和毒性的常用嚙齒動(dòng)物模型，對(duì)于大鼠存在大量歷史數(shù)據(jù)庫(kù)?？偣踩?32)只雄性spraguedawley大鼠用于該研究。將動(dòng)物隨機(jī)分配到4組，每組8只動(dòng)物(表9)。按照研究目的、本發(fā)明人的學(xué)術(shù)需要和同期學(xué)術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)該研究以使用可接受的最少數(shù)目的動(dòng)物。該設(shè)計(jì)提供足夠的組大小可供進(jìn)行有意義的數(shù)據(jù)分析。

試驗(yàn)品和對(duì)照品

試驗(yàn)品如下：(1)20mm乙酸鈉緩沖液(ph:6.0+/-0.5)中的3.4mg/mlrhpdgf-bb；和(2)20mm乙酸鈉緩沖液(ph:6.0+/-0.5)中的0.34mg/mlrhpdgf-bb。對(duì)照品是20mm乙酸鈉緩沖液(ph6.0+/-0.5)。

在開始研究時(shí)，將3.4和0.34mg/mlrhpdgf-bb和20mm乙酸鈉(乙酸鹽)緩沖液試驗(yàn)品和對(duì)照品的至少兩個(gè)未開啟、未使用的小瓶保持在相同的貯存條件(4℃)下作為用于給藥、穩(wěn)定性和濃度分析的小瓶。進(jìn)行了穩(wěn)定性和劑量驗(yàn)證分析，其由uv/vis分光光度測(cè)定法和反相hplc分析構(gòu)成。

包括在該研究中的劑量為1.02、10.2和102μgrhpdgf-bb。通過分別注射30μl3.4mg/ml和0.34mg/ml來實(shí)現(xiàn)102和10.2μg劑量。對(duì)于1.02μg劑量，0.34mg/ml以1:10用naoac緩沖液稀釋。

采用用于處理試驗(yàn)品和對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)程。準(zhǔn)確地講，在制備和給予劑量時(shí)戴上手套、面罩、實(shí)驗(yàn)服(即實(shí)驗(yàn)工作服)和護(hù)目用具。

測(cè)試系統(tǒng)

三十二(32)只雄性spraguedawley大鼠用于該研究，根據(jù)其體重(注射時(shí)約294克)進(jìn)行選擇。按大鼠體重將其隨機(jī)分配到每組。

通過在其尾部寫上的唯一號(hào)碼辨認(rèn)每只大鼠。因適當(dāng)?shù)难芯肯嚓P(guān)事件(例如麻醉)而撤除食物和水，除此之外任意提供。在研究選擇之前，通過肉眼檢查篩選所有動(dòng)物。

動(dòng)物的治療符合fimr的ccp標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，該規(guī)程遵循美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物福利法(9cfr，第1、2和3部分)概述的規(guī)程和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南(ilar出版，1996，nationalacademypress)規(guī)定的條件。

給予試驗(yàn)品

跟腱內(nèi)給藥模擬臨床上給予rhpdgf-bb。肌腱-跟骨連接處的注射部位模擬肌腱和骨的附著部位。

根據(jù)之前在大鼠肌腱膠原酶模型(參見實(shí)施例3)中肌腱內(nèi)施用rhpdgf-bb的劑量反應(yīng)功效研究，選擇劑量水平。根據(jù)大鼠稱重為0.294kg，用于該研究的最大劑量濃度為102μg或0.347mg/kg。

將平均體重為294克的三十二只雄性sprague-dawley大鼠隨機(jī)分配到4個(gè)組，每組8只動(dòng)物。第1、2和3組以30μl/動(dòng)物(0.102ml/kg)的目標(biāo)遞送體積，在接近骨腱連接處的右跟腱中分別接受347μg/kg、34.7μg/kg和3.47μg/kgrhpdgf-bb的單次肌腱內(nèi)平均推注劑量。第4組以30μl/動(dòng)物的目標(biāo)遞送體積，接受20mm乙酸鈉緩沖液的單次肌腱內(nèi)注射。使用胰島素注射器(28.5g)，將治療藥注射至接近骨腱連接處的右跟腱。在以下所列采血時(shí)間為了血清用空的lcc注射器(26g)通過尾靜脈給動(dòng)物采血(約400μ1全血，約200μ1血清)。采用quantikineelisa測(cè)量血清中的rhpdgf-bb。

表9.治療組

*采血時(shí)間為：

所有組的動(dòng)物1-4=基線、1分鐘、10分鐘、20分鐘、4小時(shí)、24小時(shí)和72小時(shí)

所有組的動(dòng)物5-8=基線、5分鐘、8小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)和168小時(shí)

將約400μl血液采集到血清管中，在室溫下以1,800g離心10分鐘得到血清。在2mleppendorf管中提供約200μl血清。在分析以測(cè)量存貯血清樣品中的rhpdgf-bb的量之前，將血清保存在-70℃下。

臨床觀察

至少每日觀察動(dòng)物直到處死。在rhpdgf-bb注射之前記錄體重。食物消耗是定性的。未記錄到不按時(shí)間表的動(dòng)物死亡。

在合適的研究終點(diǎn)將全部動(dòng)物處死。在生命期治療組完成后，通過過量給予co2使動(dòng)物安樂死。通過缺乏反射(眨眼、回縮等)證實(shí)死亡。在該研究中未進(jìn)行肉眼檢查或組織病理學(xué)。

血清分析

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量rhpdgf-bb血清濃度。如下采用得自r&dsystems(minneapolis，mn)的用于定量測(cè)定人血小板衍生生長(zhǎng)因子-bb濃度elisa試劑盒的quantikine?人pdgf-bb免疫測(cè)定法，定量測(cè)量rhpdgf-bb。

首先，用前將試劑盒中的全部試劑放到室溫下。接下來，采用與用于試驗(yàn)樣品相同批次的rhpdgf-bb，繪制rhpdgf-bb的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用試劑盒所提供的稀釋緩沖液，將rhpdgf-bb稀釋至10ng/ml。然后將該溶液1:2系列稀釋至0.15625ng/ml的濃度。待測(cè)試樣品使用相同的稀釋緩沖液稀釋，使得濃度值正好落入0.15625ng/ml-10ng/ml的rhpdgf-bb標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)。

確定一式兩份測(cè)定所有樣品需要的孔數(shù)，對(duì)微量滴定板上各8孔條帶適當(dāng)編號(hào)。將100μl/孔的assaydiluentrd1x加至各孔中，接著加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。然后將板用粘合蓋(adhesivecover)蓋上，在定軌搖床(設(shè)置在50-70次旋轉(zhuǎn)/分鐘)上于室溫溫育約2小時(shí)。抽吸各孔，用300μl洗滌緩沖液洗滌。重復(fù)4次。接下來，將200μl抗rhpdgf-bb綴合物(隨r&d試劑盒供應(yīng)，無需稀釋)加入各孔。將板用新的粘合蓋蓋上，在設(shè)置在50-70次旋轉(zhuǎn)/分鐘的定軌搖床上于室溫溫育約1.5小時(shí)。重復(fù)抽吸和洗滌步驟，然后將200μl底物溶液(隨r&d試劑盒提供，無需稀釋)加入各孔中。樣品然后在定軌搖床上在室溫下避光溫育約30分鐘。將50μl終止溶液(隨r&d試劑盒提供，無需稀釋)加入各孔中，如果顯色不均，則用8道多道吸液管上下抽吸2-4次將溶液混勻。在加入終止溶液的30分鐘內(nèi)，在設(shè)置為450nm(用540nm的波長(zhǎng)校正)的微板讀數(shù)器中測(cè)定各孔的光密度。將光密度讀數(shù)輸入microsoftexcel以進(jìn)行分析。

計(jì)算各樣品的平均值。利用各板的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各試驗(yàn)樣品的rhpdgf-bb濃度。利用各樣品的rhpdgf-bb濃度和總體積，計(jì)算存在于各樣品中的蛋白質(zhì)總量。

藥代動(dòng)力學(xué)分析

利用winnonlin的非區(qū)室模塊計(jì)算下列參數(shù)：終末半衰期(t1/2)，最大觀測(cè)濃度的時(shí)間(tmax)、出現(xiàn)在tmax時(shí)的最大觀測(cè)濃度(cmax)、從t=0小時(shí)到t=最終觀察時(shí)間的藥物濃度與時(shí)間曲線下面積(auc0-最后)和生物利用度(%f)。如利用quantikineelisa試劑盒測(cè)定法在血清中所測(cè)定的，利用存在于不同時(shí)間點(diǎn)上的rhpdgf-bb的量進(jìn)行分析。

可以計(jì)算其它參數(shù)，例如：根據(jù)最終的觀測(cè)濃度計(jì)算時(shí)間=0外推至無限的藥物濃度與時(shí)間曲線下面積(aucinf)、靜脈內(nèi)給藥的全身清除率(cl)和肌腱內(nèi)給藥的全身清除率(cl/f)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)

統(tǒng)計(jì)分析限于說明性參數(shù)，例如平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變差系數(shù)(適當(dāng)時(shí))。

結(jié)果

所有動(dòng)物在治療時(shí)的平均體重為294克。動(dòng)物接受347μg/kg(102μg)、34.7μg/kg(10.2μg)或3.47μg/kg(1.02g)rhpdgf-bb的平均劑量。

347μg/kg劑量組的平均血清rhpdgf-bb濃度-時(shí)間值見圖13。觀察到在5分鐘和8小時(shí)之間血清中rhpdgf-bb濃度降低。自8小時(shí)至168小時(shí)，血清中rhpdgf-bb的濃度低于elisa定量的水平(<0.156ng/ml)。在所有時(shí)間點(diǎn)上，34.7μg/kg和3.47μg/kg劑量組血清中的rhpdgf-bb濃度低于定量測(cè)定的水平(<0.156ng/ml)。

表10表示在347μg/kg劑量組的雄性sprague-dawley大鼠中肌腱內(nèi)(it)給予rhpdgf-bb和實(shí)施例4中描述的靜脈內(nèi)(iv)給藥的440μg/kg劑量組的參數(shù)的藥代動(dòng)力學(xué)分析。在0.083小時(shí)(4.98分鐘)時(shí)觀察到tmax，其cmax濃度為16.3ng/ml。auc0-最后為12.58ng*小時(shí)/ml，生物利用度為3.34%。對(duì)于34.7μg/kg和3.47μg/kg劑量組，在所有時(shí)間點(diǎn)上，血清中的rhpdgf-bb濃度低于定量測(cè)定的水平(<0.156ng/ml)，因此未計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

表10：it給藥(347μg/kg劑量組)和iv給藥(440μg/kg劑量組)的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析

結(jié)論

肌腱內(nèi)(it)給予rhpdgf-bb導(dǎo)致快速的最初低的全身性暴露。在低于347μg/kgrhpdgf-bb的劑量下，未觀察到可檢出的rhpdgf-bb血清濃度。

在347μg/kgrhpdgf-bbit劑量下，所給予劑量的約3.34%達(dá)到全身循環(huán)，而cmax值僅為在iv給藥后觀察到的值的0.26%。因此，rhpdgf-bb在肌腱內(nèi)給藥后在吸收到血清中后被快速清除?？紤]到在肌腱內(nèi)給藥后rhpdgf-bb的生物利用度低(約3.34%)，這出人意料地預(yù)示著rhpdgf-bb被保留在作用部位。

實(shí)施例6：rhpdgf-bb注射對(duì)外上髁炎的作用的ii期隨機(jī)單次遞增劑量雙盲安慰劑對(duì)照多中心研究。

本項(xiàng)研究的目的是評(píng)價(jià)作為外上髁炎(亦稱為“網(wǎng)球肘”)治療的rhpdgf-bb注射的療效。

研究基地/研究組。該研究在多達(dá)6個(gè)臨床基地進(jìn)行。研究人群為一百(100)名受試者，隨機(jī)分成4組，每組二十五(25)名受試者。各組包括5名安慰劑患者和20名積極治療患者。

研究人群：保守治療失敗三(3)個(gè)月的臨床診斷為外上髁炎的受試者。

研究設(shè)計(jì)。本研究是ii期隨機(jī)單次遞增劑量雙盲安慰劑對(duì)照多中心研究。在取得參加研究知情同意書后，招募符合研究招募入選標(biāo)準(zhǔn)的合格受試者。手術(shù)后24周跟蹤受試者。隨機(jī)化跟蹤研究招募按照1:1:1:1:1方案把受試者分到下列治療組之一：(1)劑量a：僅緩沖液——對(duì)照組；(2)劑量b：緩沖液+0.45mgrhpdgf-bb；(3)劑量c：緩沖液+0.75mgrhpdgf-bb；(4)劑量d：緩沖液+1.5mgrhpdgf-bb；和(5)劑量e：緩沖液+3.0mgrhpdgf-bb。所有劑量的總體積為1.5mlrhpdgf-bb溶液/劑量(分別對(duì)應(yīng)于0.3mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml和2.0mg/ml的rhpdgf-bb治療組，以70kg人為基礎(chǔ)分別對(duì)應(yīng)于6.4、10.7、21.4和42.9μgrhpdgf-bb/kg)。緩沖液為20mm乙酸鈉(ph=6.0)。

采用分層遞增方法進(jìn)行隨機(jī)化。初始隨機(jī)化遵循采用以下方式將受試者分到治療組的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有檢驗(yàn)效能的(statisticallypowered)遞增方案：將預(yù)先確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有檢驗(yàn)效能數(shù)目的受試者隨機(jī)分到劑量a(僅緩沖液——對(duì)照組)或劑量b(緩沖液+0.3mg/mlrhpdgf-bb)。對(duì)于該初始劑量耐受性(劑量b)，一旦達(dá)到預(yù)定數(shù)目，第二層隨機(jī)化將預(yù)先確定的統(tǒng)計(jì)學(xué)上有檢驗(yàn)效能數(shù)目的待隨機(jī)分配的受試者加到劑量a、劑量b或額外選項(xiàng)劑量c(緩沖液+0.5mg/mlrhpdgf-bb)。重復(fù)將統(tǒng)計(jì)學(xué)上有檢驗(yàn)效能數(shù)目的受試者加入隨機(jī)化方案的各層內(nèi)的這種相同方式，直到將劑量d(緩沖液+1.0mg/mlrhpdgf-bb)和劑量e((緩沖液+2.0mg/mlrhpdgf-bb)引入隨機(jī)化方案，且達(dá)到研究招募目標(biāo)。

采用“密擊技術(shù)”，將指定劑量的單次注射給予肌腱?！懊軗艏夹g(shù)”是在把針插入觸痛區(qū)域后，在不使針露出皮膚的情況下，通過抽拉、重新定位針并將針重新插入來進(jìn)行多次少量注射的注射方法。

針對(duì)注射部位的局部反應(yīng)(發(fā)紅、腫脹、搔癢、疼痛)、慢性損傷區(qū)域的疼痛的任何增加和變態(tài)反應(yīng)的任何跡象，對(duì)受試者進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果受試者報(bào)告上述癥狀的發(fā)生，則根據(jù)受試者的評(píng)價(jià)和研究人員的決定，確定嚴(yán)重程度和與研究藥物的相關(guān)性，并記錄在指定的研究ecrf中。如果確定癥狀的嚴(yán)重程度和相關(guān)性與rhpdgf-bb治療有關(guān)，則將該信息立即知會(huì)贊助人以及適當(dāng)?shù)谋O(jiān)管當(dāng)局。然后做出此時(shí)是繼續(xù)招募還是停止受試者招募的決定。

獲得手術(shù)前前后位(ap)和側(cè)位x光片用于基線成像，并在手術(shù)前進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)四(4)周。獲取手術(shù)后二十四(24)周各研究方案的其它ap和側(cè)位x光片。當(dāng)所有受試者完成二十四(24)周隨訪時(shí)，進(jìn)行最后的安全性評(píng)價(jià)。

入選標(biāo)準(zhǔn)。包括在該研究中的受試者是患有受阻旋后(resistedsupination)或腕背屈的其癥狀可重現(xiàn)、臨床診斷為外上髁炎且≥21歲的受試者。

排除標(biāo)準(zhǔn)。不包括在該研究中的受試者是在過去三(3)個(gè)月接受既往皮質(zhì)甾類注射治療或已進(jìn)行治療外上髁炎的手術(shù)干預(yù)的受試者；對(duì)酵母來源的產(chǎn)品有變態(tài)反應(yīng)的受試者；有腕管綜合征史的受試者；有頸椎神經(jīng)根病史的受試者和在治療六(6)個(gè)月內(nèi)受累肘部有創(chuàng)傷的受試者。

研究持續(xù)時(shí)間。招募時(shí)間約為9個(gè)月。隨訪包括手術(shù)后直到二十四(24)周的握力測(cè)試和四肢體檢。監(jiān)測(cè)安全終點(diǎn)直到在二十四(24)周的最后一次視察。

主要結(jié)果測(cè)量。(1)安全性。通過評(píng)價(jià)不良事件的發(fā)生，來評(píng)價(jià)rhpdgf-bb的安全性和耐受性。rhpdgf-bb是安全的，并為受試者所耐受。

次要結(jié)果測(cè)量。研究手術(shù)前視察2次和在四(4)、八(8)、十二(12)和二十四(24)周時(shí)的手術(shù)后研究巡視時(shí)，完成下列評(píng)價(jià)：(1)臂肩手失能評(píng)分(dash)。(2)視覺模擬評(píng)分法(vas)。(3)通過握力測(cè)試測(cè)量的作用真實(shí)性。用rhpdgf-bb的治療導(dǎo)致肌腱的臨床結(jié)局中的一個(gè)或多個(gè)有益變化，例如與治療前評(píng)分(dash和vas)相比的改善變化、隨施加壓力和/或腕屈曲時(shí)的疼痛減輕、受累肢活動(dòng)性增加和/或握力加大。

實(shí)施例7：大鼠模型中rhpdgf-bb涂覆的縫線對(duì)肌腱愈合的作用：組織學(xué)和生物力學(xué)研究。

摘要

引言。跟腱撕裂是常常需要手術(shù)修復(fù)的常見損傷。該研究的目的是雙重的：(1)確定用rhpdgf-bb涂覆的縫線是否可成功地將該因子的合適量遞送到修復(fù)部位，和(2)根據(jù)生物力學(xué)和組織學(xué)，確定用rhpdgf-bb涂覆的縫線是否可改善大鼠跟腱模型的愈合。

方法。采用之前描述的浸漬涂布方法，用不同濃度的rhpdgf(0、0.3、1.0和10.0mg/ml)涂覆4-0vicryl縫線。0rhpdgf組用作對(duì)照。采用elisa以確定在不同浸涂溶液中涂覆后縫線上的所得rhpdgf濃度。

橫切大鼠跟腱，使用4種縫線類型之一急速修復(fù)。在手術(shù)后4周收獲肌腱。針對(duì)膠原組構(gòu)和血管生成，對(duì)各樣本的組織學(xué)切片進(jìn)行評(píng)分。對(duì)各樣本進(jìn)行單軸拉力生物力學(xué)分析，提供載荷和延伸數(shù)據(jù)。針對(duì)各樣本的彈性模量、極限抗張強(qiáng)度和彈性韌度，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

結(jié)果?？p線用rhpdgf成功涂覆，其中較高浸涂濃度在縫線產(chǎn)生較大量的rhpdgf。組織學(xué)分析表明在對(duì)照和pdgf組之間，在膠原評(píng)分或血管生成方面無顯著差異。生物力學(xué)結(jié)果表明在對(duì)照(1.0±0.2mpa)和高劑量pdgf組(1.9±0.5mpa和2.1±0.5mpa)之間，在極限抗拉應(yīng)力方面有顯著差異。與其它所有組相比，在pdgf10mg/ml組(7.22，sd3.79)中拉力彈性模量顯著較高。這就證實(shí)用pdgf涂覆的縫線有積極的劑量反應(yīng)且強(qiáng)度得到改進(jìn)。

結(jié)論。該研究證實(shí)了我們的設(shè)想，即rhpdgf-涂覆的縫線可以積極的劑量依賴性方式改進(jìn)經(jīng)修復(fù)的肌腱的材料性質(zhì)。

引言

在目前研究中，我們假設(shè)4-0vicryl縫線可用可再現(xiàn)量的rhpdgf-bb成功涂覆，而且用rhpdgf-bb涂覆的縫線對(duì)大鼠跟腱修復(fù)的增加可以劑量依賴性方式提高修復(fù)，正如在生物力學(xué)和組織學(xué)上進(jìn)行的評(píng)價(jià)一樣。

材料與方法

該研究分兩部分進(jìn)行：1)體外縫線涂覆和分析，和2)大鼠模型的體內(nèi)跟腱修復(fù)。手術(shù)經(jīng)iucac批準(zhǔn)。

第1部分：縫線涂覆：采用前述浸漬涂布方法(dinesj,weberl,razzanop等.theeffectofgrowthdifferentiationfactor-5-coatedsuturesontendonrepairinaratmodel(生長(zhǎng)分化因子-5涂覆的縫線對(duì)大鼠模型的肌腱修復(fù)的作用).jshoulderelbowsurg2007;16:215s-221s)，將4組的4-0vicryl縫線(ethicon，somerville，nj)用以下涂覆：(1)20mm乙酸鈉緩沖液(載體對(duì)照)，(2)含0.3mg/mlrhpdgf-bb的緩沖液，(3)含1.0mg/mlrhpdgf-bb的緩沖液，和(4)含10.0mg/mlrhpdgf-bb的緩沖液。簡(jiǎn)單地說，在用70%乙醇處理后，將縫線(帶針)浸入含有或不含rhpdgf-bb(0、0.3、1.0和10.0mg/ml)的乙酸鈉緩沖液中達(dá)30分鐘，然后風(fēng)干。與dines等人描述的方法不一樣，涂覆溶液中不使用明膠。把縫線修整為15cm長(zhǎng)度用于體內(nèi)研究。修整縫線的其余長(zhǎng)度用于體外分析。

體外rhpdgf-bb釋放：將在乙酸鹽緩沖液(第1組)或rhpdgf-bb(第2-4組)的溶液中涂覆的縫線(n=5/組)置于洗脫緩沖液(具有2%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、1%l-谷氨酰胺和1%hepes緩沖液的極限必需培養(yǎng)基)中，在搖床上于37℃溫育。在1、6、24和48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上完全交換洗脫緩沖液。采用pdgf-bbelisa(人pdgf-bbduoset，r&dsystems，minneapolis，mn)，測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上釋放的總rhpdgf-bb。

第ii部分：研究設(shè)計(jì)：48只sprague-dawley大鼠(350-400克)以盲法方式隨機(jī)分到4個(gè)治療組之一(n=12只/組)。各組由上述浸涂溶液中的4個(gè)不同濃度的rhpdgf-bb與對(duì)照組(0mg/mlrhpdgf-bb)和3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(0.3、1.0和10.0mg/mlrhpdgf-bb起始涂覆濃度)組成。

手術(shù)操作：所有手術(shù)在無菌條件下進(jìn)行。在跟腱之上切開1.5cm皮膚切口。采用鈍器解剖法暴露跟腱。此時(shí)，用解剖刀片在其跟骨上的附著部近端橫切肌腱。使用4組之一的縫線，采用一種改良的mason-allen縫合和一種簡(jiǎn)單的間斷縫合，立即修復(fù)肌腱。

由大鼠跟腱的小尺寸所致，在實(shí)施任一種縫合時(shí)都無困難。皮膚用間斷未涂覆的vicryl縫線閉合。在手術(shù)修復(fù)后，允許動(dòng)物正常走動(dòng)。4周后，處死大鼠，收獲肌腱，包括跟骨和近端腓腸-比目魚肌復(fù)合體的骨塊。將樣本隨機(jī)分配到生物力學(xué)分析(n=8/組，新鮮冷凍)或組織學(xué)分析(n=4/組，福爾馬林固定)。

生物力學(xué)：采用配備載荷準(zhǔn)確度為+/-0.5%的100n測(cè)壓元件的instron系統(tǒng)(型號(hào)5566)，對(duì)各樣本進(jìn)行單軸拉力生物力學(xué)分析。在含有蛋白酶抑制劑的磷酸緩沖鹽溶液(pbs)中，在4℃下融化長(zhǎng)達(dá)4小時(shí)后，切開樣品除去過多肌肉，將跟骨和腓腸-比目魚肌端包裹在220粗砂砂紙中。把樣本在氣動(dòng)夾具之間固定，并浸于pbs浴液槽中。對(duì)樣品預(yù)加載張力(1n)后，測(cè)量樣品尺寸。然后，以0.25%/秒的應(yīng)變速率對(duì)肌腱進(jìn)行張力延伸。樣本被拉失效，用個(gè)人電腦采集所得載荷和延伸數(shù)據(jù)，在10hz下獲取數(shù)據(jù)。測(cè)試后，分析所采集的數(shù)據(jù)以分別確定(1)線勁度，和(2)載荷-位移或應(yīng)力-應(yīng)變曲線的線性部分的彈性模量。還自負(fù)荷曲線計(jì)算最大載荷和極限抗張強(qiáng)度。

組織學(xué)：在跟腱附著部位從跟骨上剝離出肌腱樣本，對(duì)經(jīng)修復(fù)的跟腱進(jìn)行加工，并包埋在石蠟中。各樣本的矢狀切片用mallory三色或天狼猩紅染色。利用之前文獻(xiàn)所述的膠原組構(gòu)和血管生成程度的評(píng)分系統(tǒng)(dinesj,weberl,razzanop等.theeffectofgrowthdifferentiationfactor-5-coatedsuturesontendonrepairinaratmodel(生長(zhǎng)分化因子-5涂覆的縫線對(duì)大鼠模型的肌腱修復(fù)的作用).jshoulderelbowsurg2007;16:215s-221s)，由3位不知情觀察人員對(duì)載玻片拍照并評(píng)分。3名對(duì)治療組不知情的獨(dú)立觀察人員對(duì)各載玻片進(jìn)行評(píng)價(jià)。計(jì)算各治療組的總分，并比較統(tǒng)計(jì)顯著性。

統(tǒng)計(jì)分析：利用以時(shí)間作為重復(fù)測(cè)量的重復(fù)測(cè)量方差分析，分析體外釋放的rhpdgf-bb的量。用非線性(重對(duì)數(shù)圖尺)最小二乘法擬合來擬合釋放的rhpdgf-bb的累積量和遞送的總劑量與起始涂覆濃度的關(guān)系曲線。對(duì)于生物力學(xué)參數(shù)，利用單因素方差分析與bonferroni多重比較檢驗(yàn)，來確定組間的差異。對(duì)組織學(xué)分級(jí)評(píng)分的統(tǒng)計(jì)分析利用kruskal-wallis檢驗(yàn)與dunn雙重比較事后檢驗(yàn)進(jìn)行。生物力學(xué)數(shù)據(jù)表示為平均值±sem，組織學(xué)評(píng)分表示為中位值(范圍)。以p<0.05確定顯著性。

結(jié)果

體外rhpdgf-bb釋放：體外釋放數(shù)據(jù)表示為通過縫線長(zhǎng)度歸一化的釋放的rhpdgf-bb的量(ng/cm)(圖14a和14b)。在包括第1組(0mg/ml)的所有組中測(cè)量體外釋放，第1組被視為其它組的基線測(cè)量(累積釋放：1.3±0.1ng/cm)。在溫育的第1小時(shí)后，觀察到從縫線中rhpdgf-bb的快速釋放(bolusrelease)(第2組：6.29±3.0ng/cm；第3組：68.81±9.3ng/cm；第4組：5809.42±541.6ng/cm)(圖14a)。初始快速釋放接下來是在整個(gè)48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)額外rhpdgf-bb的持續(xù)逐漸釋放。48小時(shí)溫育內(nèi)釋放的rhpdgf-bb的累積量是劑量依賴性的，其中浸涂溶液的濃度越高，所釋放的rhpdgf-bb增加；與第2組(0.3mg/ml；14.0±5.7ng/cm)和第3組(1.0mg/ml；126.8±18.8ng/cm)相比，第4組(10mg/ml；6495.9±552.6ng/cm)顯著增加(p<0.001)(圖14b)。釋放的rhpdgf-bb的累積量在第2組和第3組間并無顯著不同(p>0.05)。釋放的rhpdgf-bb的累積量(y，ng/cm)與起始涂覆濃度(x，mg/ml)通過以下等式呈對(duì)數(shù)比例(r²=0.9575)：

y=10^{(1.711*log(x)+2.102)}。

手術(shù)和總體觀察：所有動(dòng)物對(duì)手術(shù)都有良好反應(yīng)，除第3組(分配到組織學(xué))的1只動(dòng)物除外，該動(dòng)物手術(shù)后繼發(fā)于麻醉并發(fā)癥隔夜死亡。用于修復(fù)的縫線長(zhǎng)度在組間一致(第1組：4.8±0.1cm；第2組：4.7±0.2cm；第3組：4.8±0.1cm；第4組：4.8±0.1cm；p=0.94)(圖14d)。根據(jù)體外所釋放的rhpdgf-bb的平均量和縫線長(zhǎng)度，每組的體內(nèi)劑量(平均值±sd)計(jì)算為：第1組：0ng；第2組：66.0±61.2ng；第3組：602.5±190.9ng；第4組：31,342.6±6774.5ng。與所釋放的rhpdgf-bb的累積量類似，所遞送的體內(nèi)劑量(y，ng)藉以下等式與起始涂覆濃度(x，mg/ml)成對(duì)數(shù)比例(r²=0.9859)(圖14c)：

y=10^{(1.732*log(x)+2.757)}。

生物力學(xué)：由于instron試驗(yàn)機(jī)械測(cè)試當(dāng)天的誤差所致，5個(gè)樣本不能夠用于生物力學(xué)分析。所得用于生物力學(xué)分析的樣本數(shù)為：n=7(第1組、第2組和第3組)和n=6(第4組)。

觀察到修復(fù)肌腱的結(jié)構(gòu)性質(zhì)(極限載荷和剛度)無顯著差異(p>0.16)，然而，與對(duì)照組(第1組)相比，極限載荷的平均值(第1組：22.1±1.8n；第2組：31.6±3.5n；第3組：28.0±3.7n；第4組：27.6±1.8n)和剛度(第1組：6.7±0.4n/mm；第2組：8.9±0.8n/mm；第3組：8.0±1.0n/mm；第4組：7.9±0.7n/mm)在接受rhpdgf-bb的組中一致較高。

與第1組(0.21±0.03cm²)和第2組(0.23±0.04cm²)相比，在第4組(0.14±0.05cm²)中觀察到橫截面積(csa)顯著減小(p<0.05)。與第2組相比，第3組(0.17±0.02cm²)中的csa也顯著減小(p<0.05)。csa的減小導(dǎo)致修復(fù)肌腱中材料性質(zhì)(極限抗張強(qiáng)度和彈性模量)的顯著差異。與0mg/ml(1.0±0.1mpa)和0.3mg/ml(1.4±0.1mpa)rhpdgf-bb組相比，10.0mg/mlrhpdgf-bb組(2.1±0.2mpa)的極限抗張強(qiáng)度顯著增加(p<0.05)；與0mg/ml組相比，1.0mg/ml(1.9±0.2mpa)rhpdgf-bb組中的極限抗張強(qiáng)度也顯著增加。與所有其它組(0mg/ml：3.5±0.4mpa；0.3mg/ml：4.4±0.4mpa；1.0mg/mlrhpdgf-bb：4.9±0.7mpa)相比，在10.0mg/ml(7.22±1.5mpa)rhpdgf-bb組中觀察到彈性模量顯著增加(p<0.05)。0、0.3和1.0mg/mlrhpdgf-bb組彼此間無統(tǒng)計(jì)性差異。

組織學(xué)：對(duì)每組的4只動(dòng)物(第3組的n=3)進(jìn)行了組織學(xué)分析。通過3個(gè)級(jí)別對(duì)各個(gè)切片進(jìn)行評(píng)分，測(cè)定平均分值。平均分值表示為中位值(范圍)。組織學(xué)分析表明組間的膠原組構(gòu)或血管生成評(píng)分無顯著差異。然而，與對(duì)照組相比，在rhpdgf-bb組中觀察到更趨于正常外觀的趨勢(shì)，特別是膠原組構(gòu)評(píng)分。

討論

在該研究中，我們證實(shí)可將rhpdgf-bb成功地涂覆在vicryl縫線上，體外從縫線釋放的rhpdgf-bb的量有賴于起始涂覆濃度。在結(jié)構(gòu)機(jī)械性質(zhì)(極限載荷和剛度)方面或通過組織學(xué)未觀察到顯著差異，但在rhpdgf-bb治療組中的這些性質(zhì)有改進(jìn)的趨勢(shì)。對(duì)于材料生物力學(xué)性質(zhì)，觀察到對(duì)rhpdgf-bb涂覆的縫線的劑量依賴性的反應(yīng)，正如材料機(jī)械性質(zhì)(極限抗拉應(yīng)力和彈性模量)提高所顯示的一樣。

在生物力學(xué)上，對(duì)于極限強(qiáng)度和彈性模量，用最高劑量的rhpdgf-bb觀察到顯著差異。極限強(qiáng)度(亦稱為極限抗張強(qiáng)度或極限抗拉應(yīng)力)和彈性模量(亦稱為彈性模數(shù))表示通過肌腱的尺寸性質(zhì)(位移和csa)歸一化的結(jié)構(gòu)性質(zhì)(極限載荷和剛度)，并且是組織質(zhì)量的度量。在該研究中，csa隨rhpdgf-bb的劑量增加而降低說明了材料性質(zhì)提高。csa的減小表示更組織化的肌腱。雖然在組織學(xué)上觀察到膠原組構(gòu)隨rhpdgf-bb趨于改進(jìn)的趨勢(shì)，但是這種評(píng)分未達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著性，正如對(duì)csa所觀察到的一樣，可能是分配給組織學(xué)的樣品數(shù)量小所致。無論如何，改進(jìn)的膠原組構(gòu)的趨勢(shì)，結(jié)合csa減小，表明與對(duì)照縫線相比，最高劑量的rhpdgf-bb促進(jìn)更好質(zhì)量的肌腱組織(極限強(qiáng)度和彈性模量增加)。

定量測(cè)定rhpdgf-bb的使用劑量是評(píng)價(jià)縫線涂覆方法的效率和對(duì)肌腱愈合的劑量依賴性作用所必需的。體外分析表明自最高涂覆濃度(10mg/ml)釋放的rhpdgf-bb的量顯著增加，然而在兩個(gè)較低涂覆濃度(0.3和1.0mg/ml)下，甚至所釋放的rhpdgf-bb的平均累積量(分別為14.0±5.7ng/cm與126.8±18.8ng/cm)有9倍差異，也未注意到有顯著差異。這與極限強(qiáng)度和彈性模量在兩個(gè)較低劑量組中無顯著差異的觀察結(jié)果一致。

該研究表明，遞送rhpdgf-bb能夠提高大鼠跟腱的生物學(xué)修復(fù)。該研究的限制是這些結(jié)果的解讀如何受在該研究所用樣品大小的影響。對(duì)生物力學(xué)用8只動(dòng)物/組，對(duì)于組織學(xué)用4只動(dòng)物/組來設(shè)計(jì)該研究。由于在機(jī)械測(cè)試一天中instron測(cè)試裝置的誤差所致，5個(gè)樣本未包括在該分析中，降低了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)效能。結(jié)果對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，在極限載荷和剛度等性質(zhì)中的較小差異無法視為顯著，即使它們的平均值與對(duì)照組相比，似乎增加。

在生長(zhǎng)因子的應(yīng)用中，如果結(jié)果常常是劑量依賴性的，則當(dāng)動(dòng)物大小增加時(shí)，可能需要遞送較大的劑量。初步研究(數(shù)據(jù)未顯示)顯示，所遞送劑量對(duì)起始涂覆濃度和縫線表面積兩者有依賴性，這就表明對(duì)于較大動(dòng)物按比例增加劑量是能實(shí)現(xiàn)的。

所示結(jié)果表明，在臨床應(yīng)用上使用rhpdgf-bb涂覆的縫線可具有改善患者的肌腱愈合和提高患者功能的潛力。

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