本發(fā)明涉及獸用生物制品領(lǐng)域，具體一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體及其制備方法。

背景技術(shù)：

雞心包積液-肝炎綜合征是由雞I群腺病毒引起的以心包積液和肝臟出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死為主要病變特征的病毒性傳染病，目前研究報(bào)道證實(shí)，引起該病的病原主要是雞I群腺病毒血清4型毒株，近兩年來對(duì)我國(guó)家禽養(yǎng)殖造成不小的經(jīng)濟(jì)損失。

目前針對(duì)上述疾病的防治主要依賴于疫苗和抗生素，以及常規(guī)型的腺病毒卵黃抗體。卵黃抗體雖對(duì)病毒有靶向殺滅作用，但對(duì)腺病毒感染所造成的心肌損傷及心包積液等癥狀沒有對(duì)癥治療的效果；抗生素可以抑制動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的繼發(fā)感染，但使用不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致藥物殘留和產(chǎn)生抗藥性。因此發(fā)明一種既能靶向殺滅腺病毒，又能有效治療腺病毒造成的心包積液及心肌損傷，并且無抗生素殘留的，對(duì)腺病毒心包積液-肝炎綜合征起到標(biāo)本兼治的復(fù)方卵黃抗體具有重要意義。

申請(qǐng)公布號(hào)為CN106075427 A名稱為“1型禽腺病毒疫苗、蛋黃抗體的制備方法”提供了一種雞心包積液-肝炎綜合征卵黃抗體的制備方法，但是并未考慮到對(duì)腺病毒感染所造成的心肌損傷和心包積液等癥狀的對(duì)癥治療的效果，申請(qǐng)公布號(hào)為CN106065030 A名稱為“雞包涵體肝炎的卵黃抗體及其制備方法”也是如此。因此需要一種既能靶向殺滅腺病毒，又能有效治療腺病毒造成的心包積液及心肌損傷，并且無抗生素殘留的，對(duì)腺病毒心包積液-肝炎綜合征標(biāo)本兼治的復(fù)方卵黃抗體具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體的技術(shù)方案，采用本方法制備的復(fù)合卵黃抗體，其特點(diǎn)是所制備的抗體效價(jià)高，可顯著修復(fù)發(fā)病雞心肌損傷，促進(jìn)心包液吸收，并提高機(jī)體免疫力，防止機(jī)體繼發(fā)感染，顯著降低發(fā)病雞群的死亡率。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體，所述復(fù)合卵黃抗體由包括如下原料制備得到：中藥提取物10-50g、腺病毒卵黃抗體400-2000ml和苯甲酸鈉2g-10g。

進(jìn)一步，所述復(fù)合卵黃抗體由包括如下原料制備得到：中藥提取物20-40g、腺病毒卵黃抗體800-1600ml和苯甲酸鈉4g-8g。

進(jìn)一步，所述復(fù)合卵黃抗體由包括如下原料制備得到：中藥提取物30g、腺病毒卵黃抗體1200ml和苯甲酸鈉6g。

進(jìn)一步，所述中藥提取物由包括如下重量份數(shù)的原料制備得到：附子6-30份，黃連6-30份，黃芪8-40份，甘草3-15份，藿香4-20份，佩蘭4-20份，蒼術(shù)4-20份，厚樸6-30份，白豆蔻4-20份。

進(jìn)一步，所述中藥提取物由包括如下步驟的方法制備得到：

(1)稱取中藥原料附子、黃連、黃芪、甘草、藿香、佩蘭、蒼術(shù)、厚樸和白豆蔻，(洗凈后用冷水浸泡60min，再加入原料重量15倍的純化水)然后將附子加入純化水中進(jìn)行煎煮，(快速)加熱至純化水沸騰，沸后繼續(xù)保持煎煮(2小時(shí))，隨后加入黃連、黃芪、甘草、蒼術(shù)、厚樸和白豆蔻，繼續(xù)煎煮(20分鐘)，最后加入藿香和佩蘭煎煮(10分鐘)，煎煮過程中每5分鐘攪拌一次；

(2)棄去所述步驟(1)中得到中藥煎煮液的藥渣，收集藥液，于室溫中冷卻，離心，棄去沉淀，收集上清；

(3)將所述步驟(2)中得到的上清進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥濃縮液；

(4)將所述步驟(3)中得到的中藥濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥提取物。

進(jìn)一步，所述步驟(2)中的離心條件為：4000rpm離心20分鐘。

進(jìn)一步，所述腺病毒卵黃抗體由包括如下步驟的方法制備得到：

(1)選擇未經(jīng)人工免疫的已開產(chǎn)且產(chǎn)蛋正常，經(jīng)檢測(cè)雞新城疫病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒和雞I群腺病毒均為陰性的母雞；

(2)用雞新城疫病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒和雞I群腺病毒的四聯(lián)滅活疫苗對(duì)所述步驟(1)得到的母雞進(jìn)行免疫；其中，免疫包括：首次免疫、二次免疫和強(qiáng)化免疫；

(其中，所述雞新城疫病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒和雞I群腺病毒的四聯(lián)滅活疫苗選用青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品。)

(3)取所述步驟(2)免疫母雞(7日后)所生產(chǎn)的雞蛋，(利用自來水洗去蛋殼表面的污物后浸入體積濃度0.5％的新潔爾滅溶液進(jìn)行消毒30min，取出自然晾干后用酒精棉球擦拭蛋殼進(jìn)行表面消毒，去除蛋殼)無菌條件下分離得到蛋黃；

(4)將所述步驟(3)收集到的蛋黃充分?jǐn)嚢?，使蛋黃呈均勻膏狀；

(5)將所述步驟(4)中得到的蛋黃液與蒸餾水(以1:4的體積比)充分混合均勻，利用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.2-5.4，于4℃條件下溫育(6小時(shí))，離心后取上清液；

(6)在所述步驟(5)得到的上清液中加入正辛酸，使正辛酸在體系中的體積比為0.2％，混勻；

(7)將所述步驟(6)得到的溶液進(jìn)行過濾至澄清，并利用0.45μm濾膜進(jìn)行除菌處理。

進(jìn)一步，所述步驟(2)中，首次免疫為每只雞肌內(nèi)注射所述四聯(lián)滅活苗1ml/只；二次免疫為首次免疫14天后，每只雞按照1ml/只的劑量肌內(nèi)注射所述四聯(lián)滅活苗；強(qiáng)化免疫為加強(qiáng)免疫7天后，每只雞按照1ml/只的劑量肌內(nèi)注射所述四聯(lián)滅活苗。

進(jìn)一步，所述步驟(5)中的離心條件為：4000rpm離心20分鐘。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)取處方量中藥提取物；

(2)取處方量腺病毒卵黃抗體；

(3)取處方量苯甲酸鈉；

(4)將所述步驟(1)中的中藥提取物和步驟(3)中的苯甲酸鈉加入到步驟(2)中的腺病毒卵黃抗體中，并充分?jǐn)嚢柚辆鶆?，靜置、過濾、灌封。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體及其制備方法具有以下優(yōu)勢(shì)：

本發(fā)明制備的復(fù)合卵黃抗體在制備得到腺病毒卵黃抗體的基礎(chǔ)上還添加了包括附子、黃連、黃芪、甘草、藿香、佩蘭、蒼術(shù)、厚樸和白豆蔻等的中藥提取物。其中附子能增強(qiáng)心肌收縮力，加快心率，增加心輸出量和心肌耗氧量，正確的煎煮方法和適量的甘草配伍，能有效減緩附子的毒性，減少損傷；黃連具有正性肌力的作用，能夠興奮心臟、增強(qiáng)心肌收縮力；此兩味中藥對(duì)于強(qiáng)心和修復(fù)心機(jī)損傷具有顯著的效果。藿香、佩蘭、蒼術(shù)、厚樸、白豆蔻等中藥，氣味芳香，性質(zhì)溫燥，具有宣化濕濁、疏暢氣機(jī)、健脾醒胃等作用，適用于濕濁內(nèi)阻、脾為濕困、運(yùn)化失常所致的病癥，能夠顯著促進(jìn)對(duì)心包積液的吸收。黃芪提取物其中的黃芪多糖可大幅度提高了機(jī)體的免疫力，防止繼發(fā)感染，減少乃至杜絕抗生素的使用。因此本發(fā)明對(duì)腺病毒引起的心包積液-肝炎綜合征起到一個(gè)標(biāo)本兼治的作用，可快速降低死亡率，大大提高了出欄雞的出欄質(zhì)量。

具體實(shí)施方式

除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下面結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體，由包括如下原料制備得到：中藥提取物10g、腺病毒卵黃抗體400ml和苯甲酸鈉2g。

所述中藥提取物由包括如下步驟的方法制備得到：

(1)稱取中藥原料附子15份，黃連15份，黃芪20份，甘草8份，藿香10份，佩蘭10份，蒼術(shù)10份，厚樸15份和白豆蔻10份，洗凈后用冷水浸泡60min，再加入原料重量15倍的純化水，然后將附子加入純化水中進(jìn)行煎煮，快速加熱至純化水沸騰，沸后繼續(xù)保持煎煮2小時(shí)，隨后加入黃連、黃芪、甘草、蒼術(shù)、厚樸和白豆蔻，繼續(xù)煎煮20分鐘，最后加入藿香和佩蘭煎煮10分鐘，煎煮過程中每5分鐘攪拌一次；

(2)棄去所述步驟(1)中得到中藥煎煮液的藥渣，收集藥液，于室溫中冷卻，經(jīng)4000rpm離心20分鐘，棄去沉淀，收集上清；

(3)將所述步驟(2)中得到的上清進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥濃縮液；

(4)將所述步驟(3)中得到的中藥濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥提取物。

所述腺病毒卵黃抗體由包括如下步驟的方法制備得到：

(1)選擇未經(jīng)人工免疫的已開產(chǎn)且產(chǎn)蛋正常，經(jīng)檢測(cè)雞新城疫病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒和雞I群腺病毒均為陰性的母雞；

(2)用青島易邦生物工程有限公司生產(chǎn)的雞新城疫病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒和雞I群腺病毒的四聯(lián)滅活疫苗對(duì)所述步驟(1)得到的母雞進(jìn)行免疫；其中，免疫包括：首次免疫、二次免疫和強(qiáng)化免疫；

首次免疫為：每只雞肌內(nèi)注射所述四聯(lián)滅活苗1ml/只；

二次免疫為：首次免疫14天后，每只雞按照1ml/只的劑量肌內(nèi)注射所述四聯(lián)滅活苗；

強(qiáng)化免疫為：加強(qiáng)免疫7天后，每只雞按照1ml/只的劑量肌內(nèi)注射所述四聯(lián)滅活苗；

(3)取所述步驟(2)免疫母雞7日后所生產(chǎn)的雞蛋，利用自來水洗去蛋殼表面的污物后浸入體積濃度0.5％的新潔爾滅溶液進(jìn)行消毒30min，取出自然晾干后用酒精棉球擦拭蛋殼進(jìn)行表面消毒，去除蛋殼，無菌條件下分離得到蛋黃；

(4)將所述步驟(3)收集到的蛋黃充分?jǐn)嚢瑁沟包S呈均勻膏狀；

(5)將所述步驟(4)中得到的蛋黃液與蒸餾水以1:4的體積比充分混合均勻，利用1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.2-5.4，于4℃條件下溫育6小時(shí)，然后4000rpm離心20分鐘，離心后取上清液；

(6)在所述步驟(5)得到的上清液中加入正辛酸，使正辛酸在體系中的體積比為0.2％，混勻；

(7)將所述步驟(6)得到的溶液進(jìn)行過濾至澄清，并利用0.45μm濾膜進(jìn)行除菌處理。

一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體的制備方法，該方法包括如下步驟：

(1)取處方量中藥提取物；

(2)取處方量腺病毒卵黃抗體；

(3)取處方量苯甲酸鈉；

(4)將所述步驟(1)中的中藥提取物和步驟(3)中的苯甲酸鈉加入到步驟(2)中的腺病毒卵黃抗體中，并充分?jǐn)嚢柚辆鶆颍o置、過濾、灌封。

實(shí)施例2

一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體，由包括如下原料制備得到：中藥提取物20g、腺病毒卵黃抗體800ml和苯甲酸鈉4g。

其中，中藥提取物的制備方法、腺病毒卵黃抗體的制備方法以及該復(fù)合卵黃抗體的制備方法均與實(shí)施例1相同，在此不再贅述。

實(shí)施例3

一種用于預(yù)防治療雞心包積液-肝炎綜合征的復(fù)合卵黃抗體，由包括如下原料制備得到：中藥提取物30g、腺病毒卵黃抗體1200ml和苯甲酸鈉6g。

其中，中藥提取物的制備方法、腺病毒卵黃抗體的制備方法以及該復(fù)合卵黃抗體的制備方法均與實(shí)施例1相同，在此不再贅述。

將實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3得到的復(fù)合卵黃抗體分別進(jìn)行如下試驗(yàn)：

取250只25日齡發(fā)病白羽肉雞，病料經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確實(shí)為雞I群腺病毒血清4型導(dǎo)致的雞心包積液-肝炎綜合征，將該250只白羽肉雞隨機(jī)分為空白組、對(duì)照組、試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3，每組50只。其中，空白組不用藥物，對(duì)照組口服腺病毒卵黃抗體，試驗(yàn)組1口服實(shí)施例1制備的復(fù)合卵黃抗體，試驗(yàn)組2口服實(shí)施例2制備的復(fù)合卵黃抗體，試驗(yàn)組3口服實(shí)施例3制備的復(fù)合卵黃抗體，劑量均為1.5ml/只，分別觀察記錄各組的死亡情況以及出欄重，結(jié)果見表1。

表1白羽雞死亡情況以及出欄重情況表

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改等同替換改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。