技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥科技領(lǐng)域，具體涉及從毛郁金的根莖中提取得到的用于治療冠心病、高脂血癥的中藥有效部位、其制備方法和從中分離有效成分的方法。

背景技術(shù)：

心臟病、惡性腫瘤、腦血管病變是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命3種疾病，上世紀(jì)90年代以來(lái)冠心病已排名我國(guó)健康殺手榜第一名，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人民生活水平不斷提高及生活方式、飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生的巨大改變，冠心病在我國(guó)的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。冠心病是一種最常見(jiàn)的心臟病，是指因冠狀動(dòng)脈狹窄、供血不足而引起的心肌機(jī)能障礙和器質(zhì)性病變，故又稱(chēng)缺血性心臟病(IHD)。誘發(fā)了冠心病的主要病因有：高脂血癥、高血壓、糖尿病、肥胖癥及吸煙等不良生活習(xí)慣。體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂是冠心病最重要的起因，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明氧化低密度脂蛋白膽固醇和載脂蛋白的水平和冠心病事件的危險(xiǎn)性之間存在著密切的關(guān)系，高脂血癥與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)，是冠心病的重要誘因。冠心病患者除了有可能因冠脈阻塞引起心肌梗塞導(dǎo)致死亡外，心絞痛的頻繁發(fā)作也將使其學(xué)習(xí)、工作能力大大受限，嚴(yán)重時(shí)個(gè)人生活不能自理，對(duì)家庭和社會(huì)都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，發(fā)現(xiàn)開(kāi)發(fā)有效治療冠心病、心絞痛的藥物，以減少心血管疾病對(duì)人類(lèi)健康的威脅是一項(xiàng)十分有意義的工作。

毛郁金為雙子葉植物姜科姜黃屬植物毛郁金(Curcuma aromatica salisb.)的根莖，分布在我國(guó)廣西、貴州等地，為地方野生藥用植物資源。毛郁金具有多種藥用功效，臨床上被習(xí)慣用于主治胸肋刺痛、經(jīng)閉、風(fēng)濕肩臂疼痛、跌撲腫痛等，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎及免疫抑制作用。但其用于治療心肌缺血、冠心病和高脂血癥的作用研究未見(jiàn)報(bào)道。

我們?cè)谑占耖g驗(yàn)方時(shí)，發(fā)現(xiàn)廣西南寧地區(qū)有將其與其它藥材配伍治療胸痹的臨床應(yīng)用實(shí)踐，方法簡(jiǎn)潔且療效顯著，收載的病例中不乏多名長(zhǎng)年臥床不能行走、頭暈、全身無(wú)力、胸悶氣急、失眠的重癥患者及多年服用心血管常用藥物病情沒(méi)有明顯改善的久病患者。為了充分挖掘該藥材的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)該藥材進(jìn)行了深入的研究，通過(guò)對(duì)臨床經(jīng)驗(yàn)方進(jìn)行拆方研究，對(duì)方中藥材的不同有效部位進(jìn)行藥效篩選，應(yīng)用大量的公認(rèn)動(dòng)物模型進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證，篩選出目標(biāo)有效部位和有效成分，藥理研究證實(shí)毛郁金倍半萜類(lèi)化合物能明顯降低受損心肌細(xì)胞中LDH和CK的水平、減少心肌梗死范圍，保護(hù)受損心肌，能有效治療冠心病，降低血液中的血脂水平，改善預(yù)后，有可預(yù)見(jiàn)的臨床獲益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過(guò)對(duì)毛郁金的不同有效部位進(jìn)行藥效篩選，發(fā)現(xiàn)了其用于治療目標(biāo)冠心病和高脂血癥有效部位，通過(guò)對(duì)有效部位中倍半萜類(lèi)成分進(jìn)行全面深入地分析研究，從中分離出莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、zedoarondiol等四個(gè)倍半萜單體有效成分，經(jīng)理化常數(shù)及波譜分析，它們的結(jié)構(gòu)式分別如下：

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于治療冠心病、高脂血癥的中藥有效部位，其特征在于：以姜黃科植物毛郁金(Curcuma aromatica salisb.)的干燥根莖為藥用部位，藥用部位經(jīng)有機(jī)溶劑提取，提取物經(jīng)分離、純化得到的含有倍半萜類(lèi)成分的有效部位，有效部位中倍半萜類(lèi)成分的含量(質(zhì)量百分比)大于50％。

具體的，倍半萜類(lèi)成分中的主要化合物為莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮和zedoarondio，其中莪術(shù)二醇在有效部位中的含量為10～40％，原莪術(shù)醇在有效部位中的含量為15～35％，莪術(shù)二酮在有效部位中的含量為10～30％，zedoarondiol在有效部位中的含量為5～30％。

本發(fā)明的第二方面提供了一種中藥有效部位的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)毛郁金藥用部位加2～12倍(重量比)濃度為50～95％的乙醇、甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或乙酸乙酯中的一種或任意幾種混合溶劑進(jìn)行回流提取，提取液回收溶劑，濃縮得毛郁金粗提物；或?qū)⒚艚鹚幱貌课环鬯檫^(guò)篩后，以乙醇為夾帶劑，置超臨界CO₂萃取，萃取物即為毛郁金粗提物；

(2)毛郁金粗提物用2～18倍量的水飽和正丁醇、乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯萃取，萃取液回收溶劑，濃縮得毛郁金有效部位。

本發(fā)明還提供了另一種中藥有效部位的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)毛郁金藥用部位加2～12倍(重量比)濃度為50～95％的乙醇，或甲醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯中的一種或任意幾種混合溶劑進(jìn)行回流提取，提取液回收溶劑，濃縮得毛郁金粗提物；或?qū)⒚艚鹚幱貌课环鬯檫^(guò)篩后，以乙醇為夾帶劑，置超臨界CO₂萃取，萃取物即為毛郁金粗提物；

(2)將毛郁金粗提物經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附，分別用1～3倍柱體積的水、1～3倍柱體積的濃度為10～30％的乙醇沖洗樹(shù)脂柱，棄去水及稀醇洗脫液，再用80～95％的乙醇解析樹(shù)脂吸附的有效成分，分段收集80～95％的乙醇洗脫液，回收乙醇，濃縮得毛郁金有效部位。

優(yōu)選的，大孔樹(shù)脂為苯乙烯型多孔性吸附樹(shù)脂，極性為弱極性或中等極性；例如可以選用D101、HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-5000或H103型大孔樹(shù)脂。

本發(fā)明的第三方面提供了一種從毛郁金有效部位中分離有效成分的方法，包含以下步驟：

(1)制備得到毛郁金有效部位；

(2)將毛郁金有效部位經(jīng)硅膠柱層析，洗脫液為8-20:1的石油醚-乙酸乙酯體系，收集洗脫液得莪術(shù)二酮粗品；莪術(shù)二酮粗品用制備型高效液相色譜法純化得莪術(shù)二酮精制品；

(3)將洗脫液更換為4-7:1的石油醚-乙酸乙酯體系，收集洗脫液得到zedoarondiol粗品，zedoarondiol粗品用制備型高效液相色譜法純化得zedoarondiol精制品；

(4)將洗脫液更換為3-2:1的石油醚-乙酸乙酯體系，收集洗脫液得到第三流分，收集所述第三流分通過(guò)制備型高效液相色譜分離純化可得莪術(shù)二醇和原莪術(shù)醇。

有益效果：

首次發(fā)現(xiàn)莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮和zedoarondiol及毛郁金有效部位均有顯著治療心肌缺血作用，可明顯減小缺血所致大鼠心肌損傷心肌梗塞區(qū)范圍，對(duì)冠脈結(jié)扎大鼠心肌缺血損傷具有明顯的保護(hù)作用，對(duì)冠心病和高脂血癥也有很好的療效。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：

⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；

⑵、取毛郁金根莖飲片1800g，加6倍量80％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過(guò)，濾過(guò)液回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用2倍量的水飽和正丁醇萃取6次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，濃縮，真空干燥得有效部位121g。

實(shí)施例2：

⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；

⑵、取毛郁金根莖飲片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過(guò)，濾過(guò)液回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用3倍量的乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯，濃縮，真空干燥得有效部位116g。

實(shí)施例3：

⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；

⑵、取毛郁金根莖飲片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過(guò)，濾過(guò)液回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.05～1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用3倍量的由石油醚：乙酸乙酯(體積比為3～20：1)組成的混合溶劑萃取，萃取6次，合并由石油醚：乙酸乙酯萃取液，減壓回收溶劑，濃縮，真空干燥得有效部位105g。

實(shí)施例4

⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；

⑵、取毛郁金根莖飲片2000g，加6倍量75％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過(guò)，濾過(guò)液回收乙醇，減壓濃縮乙醇至盡，得毛郁金醇提液；

⑶、毛郁金醇提液經(jīng)D101型大孔樹(shù)脂吸附，樹(shù)脂柱子徑高比為1：8，上樣量為藥材：樹(shù)脂＝3：1，樹(shù)脂柱子先分別用2倍柱體積的水、2倍柱體積的濃度為30％的乙醇沖洗樹(shù)脂柱，棄去水及稀醇洗脫液；

⑷、樹(shù)脂柱子再用4倍柱體積90％的乙醇解析樹(shù)脂吸附的有效成分，分段收集乙醇洗脫液，洗脫液回收乙醇，濃縮，真空干燥得有效部位102g。

實(shí)施例5：

⑴、毛郁金根莖去須根、泥沙，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；

⑵、取毛郁金根莖飲片粉碎，過(guò)10目篩，稱(chēng)取5Kg置超臨界CO₂萃取裝置的萃取釜中；

⑵、以乙醇為夾帶劑(500g)，萃取壓力和超臨界CO₂流體溫度為35MPa和50℃，分離釜Ⅰ壓力和溫度為8MPa和50℃，分離II壓力和溫度為5MPa和35℃，進(jìn)行超臨界萃取，循環(huán)萃取1.5～2小時(shí)，從分離釜Ⅰ、分離釜II出料口放出萃取物。

⑶、超臨界CO₂萃取物60℃、-0.09MPa減壓除去乙醇至盡，用2倍量的由石油醚：乙酸乙酯(體積比為3～20：1)組成的混合溶劑萃取4次，合并萃取液，減壓回收溶劑，濃縮得有效部位415g。

實(shí)施例6：毛郁金倍半萜單體化合物的工藝制法：

⑴、毛郁金根莖去泥沙、須根，洗凈，切片，曬干，制成藥用部位；

⑵、取毛郁金根莖飲片3000g，加6倍量80％的乙醇回流得取兩次，合并兩次提取液，濾過(guò)，濾過(guò)液回收乙醇，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.10(45℃)左右，得毛郁金粗提物；

⑶、粗提物用2倍量的水飽和正丁醇萃取6次，合并正丁醇萃取液，減壓回收正丁醇，濃縮，真空干燥得有效部位204g。

⑷、取有效部位204g，與適量硅膠拌勻，干法上柱，經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯體系洗脫，先用石油醚-乙酸乙酯(按20:1)洗脫，得莪術(shù)二酮粗品洗脫液，洗脫液回收溶劑至盡，再用制備液相(流動(dòng)相為50％的乙腈-水溶液)制備得莪術(shù)二酮精制品5.7g，純度99.8％。硅膠柱層析再用石油醚-乙酸乙酯(按7:1)洗脫，得zedoarondiol粗品洗脫液，洗脫液回收溶劑至盡，再用制備液相(流動(dòng)相10％-15％的乙腈-水溶液)制備得zedoarondiol精制品2.3g，純度98.5％。硅膠柱層析再用石油醚-乙酸乙酯(按2:1)洗脫，得莪術(shù)二醇及原莪術(shù)醇粗品洗脫液，洗脫液回收溶劑至盡，用制備液相(流動(dòng)相15％-50％的乙腈-水溶液)制備得莪術(shù)二醇精制品2.5g，純度97.8％，經(jīng)HPLC制備分離莪術(shù)二醇后的母液合并，回收溶劑后，再用制備液相(流動(dòng)相30％的乙腈-水溶液)制備可得原莪術(shù)醇精制品6.1g，純度98.9％。

實(shí)施例7

對(duì)四種化合物進(jìn)行理化常數(shù)及波譜學(xué)分析：對(duì)化合物莪術(shù)二酮采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H COSY、¹³C-¹H COSY鑒定手段，得分子式C₁₅H₂₄O₂，如化學(xué)結(jié)構(gòu)式所示。對(duì)化合物zedoarondiol采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H COSY、¹³C-¹H COSY鑒定手段，得分子式C₁₅H₂₄O₃，如化學(xué)結(jié)構(gòu)式所示。對(duì)化合物莪術(shù)二醇采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H COSY、¹³C-¹H COSY鑒定手段，得分子式C₁₅H₂₂O₃，結(jié)構(gòu)式如化學(xué)結(jié)構(gòu)式所示。對(duì)化合物原莪術(shù)醇采用LC-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、Dept、¹H-¹H COSY、¹³C-¹H COSY鑒定手段，得分子式C₁₅H₂₂O₂，如化學(xué)結(jié)構(gòu)式所示。其中莪術(shù)二酮的¹³C-NMR為¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ16.57,18.54,19.86,21.12,26.41,30.00,34.05,44.24,46.81,53.61,55.92,129.90,131.59,211.14,214.37；zedoarondiol的¹³C-NMR為¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ20.17,21.16,22.06,22.21,22.38,28.47,39.67,51.83,56.15,60.61,71.28,78.49,135.57,139.18,202.55；莪術(shù)二醇的¹³C-NMR為¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ21.93；22.00；22.71；24.09；27.19；36.98；37.16；60.94；83.19；86.44；127.97；132.89；143.30；151.03；194.09；原莪術(shù)醇的¹³C-NMR為¹³C NMR(400MHz,CDCl₃)δ20.35；21.52；22.49；23.39；26.02；27.75；39.04；49.62；53.01；79.39；128.27；135.40；135.88；154.22；198.26。碳譜數(shù)據(jù)與核磁共振碳譜數(shù)據(jù)庫(kù)(上海微譜信息技術(shù)有限公司)中收錄的化合物碳譜一致。

實(shí)施例8：有效部位中倍半萜類(lèi)成分的含量檢測(cè)分析

(一)、儀器與試劑

Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀，LPG-3400SD高壓泵，WPS-3000(RS)自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC-3x00(RS)柱溫箱，VWD-3x00(RS)紫外檢測(cè)器，Chromeleon 6.8工作站。

乙腈，TEDIA公司，色譜純；水為Hi-Tech水純化系統(tǒng)自制的去離子水(18.2MΩ)。

對(duì)照品：莪術(shù)二酮、zedoarondiol、莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇

(二)、溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取莪術(shù)二酮、zedoarondiol、莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇自制對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每lmL含莪術(shù)二酮、zedoarondiol、莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇約100μg的對(duì)照品溶液。

(三)、供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取制備的有效部位適量，加甲醇溶解制成每lmL含約2mg的供試品溶液。

(四)、色譜條件：

采用反相高效液相色譜SymmetryC₁₈(5μm，250×4.6mm)，以水為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，流速1.0mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，柱溫25℃。

表1梯度洗脫程序

(五)、測(cè)定法：精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μ1，注入液相色譜儀，測(cè)定，分別計(jì)算四種倍半萜類(lèi)化合物的含量，四種倍半萜類(lèi)化合物的含量的和為有效部位的含量。

(六)、含量測(cè)定結(jié)果：見(jiàn)下表2

表2不同制備方法得到的有效部位中倍半萜類(lèi)成分的含量

注：以上有效部位中倍半萜類(lèi)成分主要為莪術(shù)二酮、zedoarondiol、莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇四種。

結(jié)論：以上檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明工藝具有實(shí)際意義。

藥效實(shí)施例：

在本發(fā)明還提供了用5種方法制備的毛郁金有效部位、莪術(shù)二酮、zedoarondiol、莪術(shù)二醇和原莪術(shù)醇在制備防治心肌缺血、冠心病和高脂血癥中的應(yīng)用。

藥理實(shí)驗(yàn)表明：莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、zedoarondiol及毛郁金有效部位對(duì)SD大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎所致的實(shí)驗(yàn)性心肌缺血模型有顯著的治療作用，通過(guò)測(cè)定模型動(dòng)物的心肌梗塞范圍及CK和LDH證實(shí)，藥物可明顯減小缺血所致大鼠心肌損傷心肌梗塞區(qū)范圍，對(duì)冠脈結(jié)扎大鼠心肌缺血損傷具有明顯的保護(hù)作用。

灌胃給予毛郁金有效部位能明顯降低高脂血癥家兔肝臟和血清TG、TC值，降低HDL-C、LDL-C，升高H/L，可改善其肝臟脂肪變性程度，各試驗(yàn)組動(dòng)物的肝臟脂肪變性程度明顯減輕，其降脂作用與辛伐他汀基本相當(dāng)。

(一)、降脂實(shí)驗(yàn)：

1、供試品：毛郁金有效部位(來(lái)源于上海捌加壹醫(yī)藥科技有限公司)

2、陽(yáng)性對(duì)照品Ⅰ：復(fù)方益肝靈片(來(lái)源于江蘇中興藥業(yè)有限公司)

批號(hào)：130303161；規(guī)格：0.32g/片，每片含水飛薊素21mg

3、陽(yáng)性對(duì)照品II：辛伐他汀片(來(lái)源于杭州默沙東制藥有限公司)

批號(hào)：120333；規(guī)格：20mg/片×7片/盒

4、陰性對(duì)照：CMC-Na(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

批號(hào)：F20091021(用試驗(yàn)用水配制成0.5％溶液使用)

5、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

種系：新西蘭兔(上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司)

許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0007；合格證號(hào)：200700071847

6、實(shí)驗(yàn)方法

雄性新西蘭大白兔100只，初始體重：2,188.4±227.9g，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，除正常對(duì)照組飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料外，其余動(dòng)物每日上午定量給予高脂飼料150g。連續(xù)飼喂至33天后，隔夜禁食，耳緣靜脈采血分離血清測(cè)定TG、TC、HDL-C、LDL-C，以確認(rèn)造模成功與否。

確認(rèn)模型成功后，剔除血脂水平不合格的動(dòng)物，根據(jù)上述指標(biāo)和體重將模型動(dòng)物均衡分至模型對(duì)照組，方法1～5制得的有效部位給藥組(相當(dāng)10g生藥/kg)，復(fù)方益肝靈片組(30mg/kg)，辛伐他汀組(3mg/kg)，于分組后開(kāi)始給藥，空白對(duì)照組和模型組灌胃給予4mL/kg空白溶劑，其余組灌胃給予相應(yīng)的樣品，每天一次，連續(xù)給藥至陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)明顯降脂作用。給藥期間不停高脂飼料。

試驗(yàn)期間每周稱(chēng)一次體重，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。給藥2周后，動(dòng)物隔夜禁食不禁水12h，耳靜脈采血，離心分離血清，檢測(cè)TG、TC、HDL-C、LDL-C值，并計(jì)算HDL-C/LDL-C比值；給藥3周后，再次隔夜禁食采血測(cè)定上述指標(biāo)，采血后第二天家兔用3％戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔麻醉，解剖取肝臟400mg，加脂質(zhì)提取液(正庚烷：異丙醇＝2：3.5)4mL勻漿，振蕩提取脂質(zhì)，離心沉淀后取上清液測(cè)定肝臟TG和TC。

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以表示，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用t檢驗(yàn)；

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組家兔肝脂質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，模型組肝組織TG、TC含量均明顯高于正常對(duì)照組(p<0.01)，說(shuō)明造模成功。毛郁金有效部位各組可明顯降低肝組織TG和TC含量。

各實(shí)驗(yàn)組家兔血清TG、TC實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，給藥前，各給藥組和模型組的血清TG、TC值非常顯著高于正常對(duì)照組(p<0.01)；而各給藥組的血清TG、TC值與模型組基本一致，提示造模成功，分組均勻。

各實(shí)驗(yàn)組家兔HDL-C、LDL-C含量和比值(H/L)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，給藥前，各實(shí)驗(yàn)組血清HDL-C和LDL-C含量均非常顯著高于正常對(duì)照組(p<0.01)；H/L比值非常顯著低于正常對(duì)照組(p<0.01)；各給藥組的血清HDL-C、LDL-C和H/L比值與模型組基本一致，提示模型成功動(dòng)物分組較為均勻。給藥后第2周和第3周，模型組的HDL-C、LDL-C非常顯著高于正常組(p<0.01)，H/L非常顯著低于正常組(p<0.01)。

9、結(jié)論

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，給藥3周結(jié)束后，五種方法制備的毛郁金有效部位(相當(dāng)10g生藥/kg)和復(fù)方益肝靈片30mg/kg灌胃給藥能明顯降低高脂血癥家兔肝臟和血清TG、TC值，降低HDL-C、LDL-C，升高H/L，可改善肝臟脂肪變性程度，且毛郁金有效部位各試驗(yàn)組動(dòng)物的肝臟脂肪變性程度均減輕。辛伐他汀組3mg/kg灌胃給藥可明顯降低高血脂家兔血清TG、TC、HDL-C、LDL-C值，升高H/L，對(duì)肝臟TG、TC亦有明顯降低作用。結(jié)果提示在本模型上，毛郁金有效部位可降低動(dòng)物血脂水平，其降脂作用與辛伐他汀基本相當(dāng)。

表3.各實(shí)驗(yàn)組家兔肝臟組織脂質(zhì)含量結(jié)果

^*p<0.05；^**p<0.01，與模型組比較；^#p<0.05；^##p<0.01，與復(fù)方益肝靈片組比較；^△p<0.05；^△△p<0.01，與辛伐他汀組比較

表4.各實(shí)驗(yàn)組家兔血脂含量結(jié)果

^*p<0.05；^**p<0.01，與模型組比較；^#p<0.05；^##p<0.01，與復(fù)方益肝靈片組比較；^△p<0.05；^△△p<0.01，與辛伐他汀組比較。

表5.各實(shí)驗(yàn)組家兔血清高低密度脂蛋白膽固醇含量和比值結(jié)果

^*p<0.05；^**p<0.01，與模型組比較；^#p<0.05；^##p<0.01，與復(fù)方益肝靈片組比較；^△p<0.05；^△△p<0.01，與辛伐他汀組比較。

(二)、對(duì)心肌缺血再灌注大鼠的治療作用

1、受試物

用本發(fā)明方法一、方法二、方法三、方法四、方法五制備的毛郁金有效部位(以下簡(jiǎn)稱(chēng)方法一制、方法二制、方法三制、方法四制、方法五制)及用本發(fā)明方法六制備的四個(gè)倍半萜單體化合物莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、zedoarondiol，臨用時(shí)以CMC-Na溶液配制成所需濃度的藥液，供動(dòng)物給藥用。

2、陽(yáng)性藥

地奧心血康膠囊(以下簡(jiǎn)稱(chēng)心血康)：成都地奧制集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格100mg/粒，批號(hào)1306022。臨用時(shí)以CMC-Na溶液配制成所需濃度的藥液供動(dòng)物給藥。

單硝酸異山梨酯片(以下簡(jiǎn)稱(chēng)單硝酯)，商品名欣康，魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格20mg，批號(hào)07130313。臨用時(shí)研碎，以CMC-Na溶液配制成相應(yīng)濃度的藥液供大鼠灌胃給藥用。

3、藥盒與試劑

乳酸脫氫酶(LDH)分析試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130521。

大鼠肌酸激酶同工酶(CK-MB)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，Bio-Swamp公司產(chǎn)品，批號(hào)201310。

大鼠乳酸脫氫酶(LDH)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，Bio-Swamp公司產(chǎn)品，批號(hào)201310。

水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20120110。

4、動(dòng)物

SD大鼠，SPF級(jí)，雄性，253.9±10.4(230～276)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。

5、模型制備

大鼠，在腹腔注射12％水合氯醛360mg/kg全麻的條件下，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。胸部前外側(cè)手術(shù)野去毛，常規(guī)消毒。切開(kāi)皮膚、肌層，肌層行荷包縫合，左側(cè)第四肋間隙開(kāi)胸，以環(huán)形鉤拉出心臟。在左心耳下方3～4mm處的冠脈前降支位置，以6/0無(wú)損傷絲線(xiàn)穿線(xiàn)，并置直徑1.6mm尼龍線(xiàn)，連同冠狀動(dòng)脈前降支一起結(jié)扎，另一端留于體外備用。將心臟放回胸腔，排空胸腔內(nèi)空氣，關(guān)閉胸腔(假手術(shù)組動(dòng)物僅在相應(yīng)冠脈位置穿線(xiàn)，不進(jìn)行結(jié)扎,其它手術(shù)過(guò)程與結(jié)扎動(dòng)物相同)。結(jié)扎30min后小心移除尼龍線(xiàn)進(jìn)行再灌注?？p合肌層及皮膚，肌注青霉素，每天一次，連續(xù)3天。

與正常II導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG-II)比較，冠脈結(jié)扎后10min，ECG-II的ST段抬高0.2mV以上者作為缺血成功；再灌注后10min，ECG-II中抬高的ST段下降30％以上者作為再灌注成功。不滿(mǎn)足上述缺血或缺血再灌注標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物表明造型不成功，從實(shí)驗(yàn)中剔除。

6、分組及給藥

選取造型成功的動(dòng)物隨機(jī)分為13組，每組10只。分別為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、受試藥物組，以及中藥陽(yáng)性藥組、西藥陽(yáng)性藥組。

造型成功后30min開(kāi)始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天；每次給藥體積為10ml/kg。假手術(shù)組和模型對(duì)照組給予溶劑對(duì)照液(CMC-Na溶液)；受試藥組分別給予用本發(fā)明方法一、方法二、方法三、方法四、方法五制備的毛郁金有效部位及用本發(fā)明方法六制備的四個(gè)倍半萜單體化合物莪術(shù)二醇、原莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、zedoarondiol，劑量(按有效部位及單體有效成分的收率折算成相當(dāng)?shù)纳幜?為9g生藥/kg及西藥單硝酸異山梨酯片，劑量為0.0062g(片重)/kg(相當(dāng)于臨床等效量)；心血康0.144g/kg(相當(dāng)于臨床等效量)。

7、梗死范圍測(cè)量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠心臟，以生理鹽水沖洗，-20℃進(jìn)行冷凍處理。在結(jié)扎線(xiàn)下將心臟均勻切成2mm厚的切片，置2％TTC 37℃染色10min，經(jīng)病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定梗死區(qū)占左心室的百分比。

8、血清心肌酶檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，4℃，3000rpm×10min離心，取上層血清，Elisa法測(cè)定LDH、CK-MB。

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，給藥前后配對(duì)或兩組間比較用student’s t-test，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌梗死范圍的影響(n＝10)

注：1.與假手術(shù)組比較：^△△△P<0.001；2.與模型組比較：^*P<0.05；3.與陽(yáng)性藥組比較：P>0.05.

10、對(duì)血清心肌酶的影響

模型組缺血再灌注后7天，血清LDH活性均明顯升高。5種方法制備的毛郁金有效部位及分離的四個(gè)單體倍半萜類(lèi)化合物(相當(dāng)于9g生藥/kg)治療7d后，與模型組相比，均能顯著降低LDH(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌酶的影響(n＝10)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：藥物可明顯減小缺血所致大鼠心肌損傷心肌梗塞區(qū)范圍，對(duì)冠脈結(jié)扎大鼠心肌缺血損傷具有明顯的保護(hù)作用。