本發(fā)明涉及一種復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物，特別涉及一種治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物，以及該組合物的制備方法和用途。該組合物由類(lèi)葉牡丹、白芍和麻黃組成，屬于中藥新藥技術(shù)領(lǐng)域。本復(fù)方制劑在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎上有很好的療效。

背景技術(shù)：

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一個(gè)以累及周?chē)P(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥性自身免疫病。主要累及關(guān)節(jié)滑膜，以后可波及到關(guān)節(jié)軟骨、骨組織、關(guān)節(jié)韌帶和肌鍵，其次為漿膜、心、肺及眼等結(jié)締組織。病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)滑膜炎癥、細(xì)胞增生、肉芽腫形成、軟骨破壞，通常可導(dǎo)致不可逆的關(guān)節(jié)破壞、畸形，甚至致殘。主要表現(xiàn)為全身性病變，除關(guān)節(jié)病變外，還有發(fā)熱、疲乏無(wú)力、心包炎、皮下結(jié)節(jié)、胸膜炎、動(dòng)脈炎、周?chē)窠?jīng)病變等，被稱(chēng)為―不死的癌癥。在我國(guó)的患病率為0.32％～0.36％，是造成我國(guó)人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要病因之一。由于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理至今尚未闡明，因此，對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎尚未有特效的治療藥物。目前，抗炎和免疫療法是治療RA的主要手段。免疫療法中以免疫抑制劑為主，常用免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素、抗代謝藥、烷化劑等，使得尋找出高效、低毒且能提高患者順應(yīng)性的治療藥物已成為藥學(xué)工作者研究的著眼點(diǎn)。

類(lèi)葉牡丹(Caulophyllum robustum Maxim.)為小檗科(Berberidaceae)紅毛七屬植物，又稱(chēng)紅毛七、葳嚴(yán)仙?！吨兴幋笤~典》記載其性溫，味苦辛，具有理氣止痛、祛風(fēng)活血的功效，民間常用于風(fēng)濕、類(lèi)風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎、扁桃體炎等癥，療效顯著。主要含有三萜皂苷和生物堿等成分，現(xiàn)代藥理研究表明，上述成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性，有較大的藥用價(jià)值。

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。是常用的傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽(yáng)的功效。用于血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗，脅痛，腹痛，四肢攣痛，頭痛眩暈。主要有效成分為芍藥苷、白芍苷、氧化芍藥苷和苯甲酰芍藥苷等單萜苷類(lèi)化合物，還含有部分三萜化合物以及鞣質(zhì)等。

麻黃本品為麻黃植物草麻黃(Ephedra sinica Stapf)、中麻黃(Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.)或木賊麻(Ephedra equisetina B)的干燥全草。本品發(fā)汗解表和利水消腫力強(qiáng)，多用于風(fēng)寒表實(shí)證，胸悶喘咳，風(fēng)水浮腫，風(fēng)濕痹痛，陰疽，痰核。

本發(fā)明以類(lèi)葉牡丹、白芍、麻黃為基礎(chǔ)研究開(kāi)發(fā)，是臨床效驗(yàn)方，方中以類(lèi)葉牡丹為主藥，但類(lèi)葉牡丹味苦，性寒，長(zhǎng)期服用易產(chǎn)生副作用，而類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為一種慢性疾病，需要長(zhǎng)時(shí)間服用藥物，本復(fù)方以中醫(yī)理論與現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果為指導(dǎo)，結(jié)合臨床實(shí)踐，以類(lèi)葉牡丹、白芍和麻黃配伍，可以很好的降低副作用并發(fā)揮協(xié)同作用提高類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果，藥理學(xué)研究顯示配伍后類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用優(yōu)于單方。

本專(zhuān)利所涉及的復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物包括類(lèi)葉牡丹、白芍和麻黃三味藥的有效成分提取物，三者配伍用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物。該組合物由類(lèi)葉牡丹有效成分提取物、白芍和麻黃有效成分混合提取物組成。該組合物中類(lèi)葉牡丹有效成分提取物、白芍和麻黃有效成分混合提取物的重量配比為0.25～2:2～0.25，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，上述重量配比優(yōu)選為1:2。

本發(fā)明還提供了上述復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物的制備方法，包括以下步驟：

將類(lèi)葉牡丹粉碎成粗粉，用水、低分子醇、含水低分子醇或其他有機(jī)溶劑回流提取2～4次，每次加6～12倍量水、低分子醇、含水低分子醇或其他有機(jī)溶劑，每次2～4小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至稠膏狀，即可得到類(lèi)葉牡丹提取物，將類(lèi)葉牡丹提取物經(jīng)水混懸再進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂柱色譜，先用蒸餾水洗脫，再用20％～70％乙醇梯度洗脫，收集20％乙醇洗脫液4～8倍柱體積，收集30％乙醇洗脫液4～10倍柱體積，收集70％乙醇洗脫液4～8倍柱體積，合并洗脫液，減壓濃縮至稠膏狀，減壓回收后得到白芍和麻黃有效成分混合提取物；類(lèi)葉牡丹有效成分提取物中類(lèi)葉牡丹標(biāo)志性有效成分葳嚴(yán)仙皂苷C和葳嚴(yán)仙皂苷G的含量可達(dá)該提取物重量百分比的20％以上。

將白芍和麻黃混合后粉碎成粗粉，加水、低分子醇、含水低分子醇或其他有機(jī)溶劑回流提取2～5次，每次加6～12倍量水、低分子醇、含水低分子醇或其他有機(jī)溶劑，每次2～4小時(shí)，過(guò)濾，合并提取液，減壓濃縮至稠膏狀，減壓回收后得到白芍和麻黃有效成分混合提取物。

將類(lèi)葉牡丹有效成分提取物、白芍和麻黃有效成分混合提取物按重量配比組合即得到治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物。

本發(fā)明復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物具有治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，用于治療和預(yù)防各種疼痛、炎性損傷、關(guān)節(jié)損傷等。加入藥學(xué)上可接受的輔料可進(jìn)一步制成酒劑、酊劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、口服液等口服制劑。

本發(fā)明的有益效果為：類(lèi)葉牡丹具有清熱燥濕，利膽退黃的作用，以此為君藥，配伍白芍和麻黃，發(fā)揮協(xié)同作用，三藥合用較之單味藥物的使用作用更佳，可以發(fā)揮中醫(yī)藥的配伍優(yōu)勢(shì)，降低副作用并提高療效。本發(fā)明是發(fā)掘祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)寶庫(kù)，在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療基礎(chǔ)上，選用純中藥，按照中醫(yī)基礎(chǔ)理論組方，經(jīng)嚴(yán)格篩選，結(jié)合現(xiàn)代先進(jìn)工藝制法組合而成。該組合物可達(dá)到治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物的制備

類(lèi)葉牡丹藥材，粉碎，60％乙醇回流3次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，得到類(lèi)葉牡丹提取物，經(jīng)水混懸再進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂柱色譜，先用蒸餾水洗脫，再用50％乙醇梯度洗脫，收集20％乙醇洗脫液8倍柱體積，收集0％乙醇洗脫液6倍柱體積，收集70％乙醇洗脫液6倍柱體積，合并洗脫液，減壓回收后得到類(lèi)葉牡丹提取物。該提取物經(jīng)水混懸再進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂柱色譜，先用蒸餾水洗脫，再用50％乙醇梯度洗脫，收集50％乙醇洗脫液8倍柱體積，收集60％乙醇洗脫液8倍柱體積，收集70％乙醇洗脫液10倍柱體積，合并洗脫液，減壓回收后得到類(lèi)葉牡丹有效成分提取物。

白芍和麻黃藥材(1：1等量混合)，粉碎，浸泡6h，用水煮2次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑，減壓回收后得到白芍和麻黃有效成分混合提取物。

將上述制備方法得到的類(lèi)葉牡丹有效成分提取物、麻黃和白芍有效成分混合提取物按1：1.5的比例組合記得復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物。

實(shí)施例二：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物片劑的制備

上述組分混合均勻，加滑石粉適量，壓片。

實(shí)施例三：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物膠囊劑的制備

上述組分混合均勻，80目篩制顆粒，60目篩整粒，填充膠囊。

實(shí)驗(yàn)例一：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)弗氏佐劑致大鼠足腫脹的影響

樣品：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組(雷公藤多苷片TG組)、甲氨蝶呤片MT組、復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物(LYMD)高、中、低劑量組。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠。

實(shí)驗(yàn)方法：雌性每組8只，共7組。于各組大鼠左后足墊皮下注射完全弗氏佐劑(CFA)0.1mL，大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型被復(fù)制。模型復(fù)制第8天開(kāi)始給藥，分別給予復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物高、中、低組(69.23，34.61，17.31mg·kg^-1)，MT組(0.68mg·kg^-1)，TG組(7.88mg·kg^-1)，模型組及正常對(duì)照組給予等容積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥15d。模型復(fù)制當(dāng)天為第1天，分別于第0、1、8、12、18，22天用排水法測(cè)量大鼠腳踝關(guān)節(jié)以下的容積。計(jì)算大鼠足腫脹度和抑制率。

腫脹度＝(致炎后足體積－致炎前足體積)/致炎前足體積×100％。

抑制率(％)＝(模型對(duì)照組腫脹度－給藥組腫脹度)/模型對(duì)照組腫脹度×100％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。結(jié)果表明：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物高組對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的致療作用明顯，且優(yōu)于TG和MT。而復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物高、中、低組對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹的致療作用呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，即復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物治療大鼠類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有量效關(guān)系。

表1:復(fù)方類(lèi)葉牡丹對(duì)大鼠足腫脹度數(shù)值表(％,n＝8)。

注：與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01；與復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物低劑量組相比，^ΔP＜0.05

表2:類(lèi)葉牡丹抗RA有效部位對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹度抑制率結(jié)果(±S，n＝8)。

實(shí)驗(yàn)例二：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)AA大鼠血清中IL-17、IFN-γ、G-CSF及TGF-β水平的影響

樣品：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組(雷公藤多苷片TG組)、甲氨蝶呤片MT組、復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物(LYMD)高、中、低劑量組。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠。

實(shí)驗(yàn)方法：雌性每組8只，共7組。于各組大鼠左后足墊皮下注射完全弗氏佐劑(CFA)0.1mL，大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型被復(fù)制。模型復(fù)制第8天開(kāi)始給藥，分別給予復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物高、中、低組(69.23，34.61，17.31mg·kg^-1)，MT組(0.68mg·kg^-1)，TG組(7.88mg·kg^-1)，模型組及正常對(duì)照組給予等容積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥15d。末次給藥2h后頸動(dòng)脈采血，每只大鼠采血2.5mL，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)其IL-17、IFN-γ、G-CSF及TGF-β水平。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。類(lèi)葉牡丹總提物治療組與模型組小鼠相比，血清中的IL-17、IFN-γ、G-CSF及TGF-β水平均下降，說(shuō)明類(lèi)葉牡丹總提物可能是通過(guò)下調(diào)IL-17、IFN-γ、G-CSF及TGF-β的含量達(dá)到平衡T細(xì)胞，減輕炎癥反應(yīng)。

表3:復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)AA大鼠血清中IL-17、IFN-γ、G-CSF及TGF-β水平的影響

注：與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01

實(shí)驗(yàn)例三：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)KM小鼠碳粒廓清的影響

樣品：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組(環(huán)磷酰胺CY組)、復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物(LYMD)高、中、低劑量組。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠(KM)。

實(shí)驗(yàn)方法：取小鼠50只，雌雄各半，將小鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CY組、復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物高、中、低組(100，50，25mg·kg^-1)，每組10只。CY組分別于實(shí)驗(yàn)第1，3，5d皮下注射給藥CY 30mg·kg^-1。正常對(duì)照組用等體積的0.9％生理鹽水灌胃；復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物各組每天灌胃給藥1次；連續(xù)7d。禁食24小時(shí)后，按0.1mL每10g體質(zhì)量尾靜脈注射25％印度墨汁。立即計(jì)時(shí)，并分別于第2、10分鐘時(shí)眼眶取血20μL，于9mmol·L^-1 2mL碳酸鈉溶液中，立即搖勻，于600nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。采血后將小鼠處死。計(jì)算廓清指數(shù)(K)、吞噬指數(shù)(α)。

表4：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)KM小鼠碳粒廓清的影響(n＝10)

注：與空白組對(duì)比：*P<0.05，**P<0.01

表4表明類(lèi)葉牡丹提取物能降低碳粒廓清指數(shù)K和吞噬系數(shù)α，抑制單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

實(shí)驗(yàn)例四：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)KM小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的影響

樣品：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性藥對(duì)照組(雷公藤多苷片TG組)、甲氨蝶呤片MT組、復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物(LYMD)高、中、低劑量組。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明種小鼠(KM)。

實(shí)驗(yàn)方法：將小鼠60只，雌雄各半，將小鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組、復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物高、中、低組(100，50，25mg·kg^-1)，每組10只。每天灌胃給藥1次，正常對(duì)照組、模型組用等體積的0.9％生理鹽水灌胃，DXM組注射給藥，連續(xù)7d。建立DTH模型，于末次給藥后2h，眼眶取血，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T細(xì)胞亞群的變化。取血后，將小鼠脫頸致死，用打孔鉗取下小鼠的左右耳，稱(chēng)重，計(jì)算炎癥腫脹率。

炎癥腫脹率(％)＝[(右耳重量－左耳重量)/左耳重量]×100％。

表5結(jié)果表明復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)二硝基氟苯誘導(dǎo)所致的小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)具有一定的抑制作用。

表5：復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)KM小鼠DTH的影響

注：與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01

表6：對(duì)DNFB誘導(dǎo)的DTH小鼠血液中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)和CD4+CD8+細(xì)胞比例的影響(`x±s,n＝10)

注：與模型對(duì)照組比較**P<0.01，*P<0.05；與空白組比較^##P<0.01，^#P<0.05

表6可知，與空白組比較，模型對(duì)照組CD4+淋巴細(xì)胞相對(duì)含量增高，CD8+淋巴細(xì)胞相對(duì)含量降低，CD4+/CD8+比值明顯增大(P<0.01)。地塞米松組與模型對(duì)照組相比，CD4+及CD4+/CD8+均具有極顯著性差異(P<0.01)，CD3+、CD8+具有顯著性差異(P<0.05)；與模型對(duì)照相比，復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物高劑量組可使體內(nèi)CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞在一定程度上減少，而CD8+細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，CD4+/CD8+比值顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群具有調(diào)節(jié)作用，且高、中劑量組作用更加明顯。

類(lèi)葉牡丹有效成分提取物、白芍和麻黃有效成分混合提取物按比例混合后所得復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物急性毒性實(shí)驗(yàn)證明，口服最大耐受劑量為50.5g/kg。長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)證明，按2.0、1.0、0.5/kg口服給藥，連續(xù)給藥三個(gè)月，對(duì)大鼠的體重、血常規(guī)、肝功、腎功及臟器病理組織學(xué)檢查均未見(jiàn)明顯影響。

因此，復(fù)方類(lèi)葉牡丹組合物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗風(fēng)濕、抗腫瘤等多種藥理作用，可達(dá)到治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效。