專利名稱：牡丹規(guī)范化快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物學(xué)領(lǐng)域。更佳的是，本發(fā)明涉及一種規(guī)?；焖俜敝衬档さ姆椒ā?br> 背景技術(shù)：
牡丹(Paeonia suffruticosa)是我國(guó)的候選國(guó)花，素有國(guó)色天香和百花之王的美譽(yù)，起源于我國(guó)，已演變成四大種群。國(guó)內(nèi)利用高新技術(shù)，在牡丹新品種的選育和溫控化控調(diào)節(jié)花期方面也已取得了很大進(jìn)展。但牡丹名特優(yōu)品種因長(zhǎng)期人工栽培，大部分結(jié)實(shí)能力降低，種子發(fā)育不良而只能進(jìn)行無(wú)性繁殖，在用遠(yuǎn)緣雜交培育品種時(shí)也常遇到雜交不育或種子發(fā)育不良不能萌發(fā)等問(wèn)題。這些因素對(duì)牡丹名特優(yōu)品種的繁育及推廣造成影響。因此，本領(lǐng)域迫切需要建立一種新的快速繁殖牡丹的方法。

發(fā)明內(nèi)容
具體而言，針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速繁殖牡丹的方法，該方法包括以下步驟a)取植株腋芽莖尖和嫩葉葉柄置于基本培養(yǎng)基中培育至形成愈傷組織并分化出芽，其中所述基本培養(yǎng)基中添加了一種或多種選自6-芐基氨基嘌呤、激動(dòng)素、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸、赤霉酸、水解乳蛋白、活性炭、蔗糖的物質(zhì)；b)從愈傷組織上切下叢生芽，將其轉(zhuǎn)移到加有芐基氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉酸的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)至單芽長(zhǎng)至3-5cm高；c)切下步驟b)中的所述單芽，用濾紙橋法將其插入含吲哚丁酸的溶液中處理18-24小時(shí)，然后再轉(zhuǎn)入加有吲哚丁酸、芐基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株；d)移栽步驟c)形成的小植株。
本文中所用的術(shù)語(yǔ)“腋芽、莖尖、嫩葉、葉柄”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知曉的含義，因此其對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是清楚。
術(shù)語(yǔ)“基本培養(yǎng)基”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知道的含義，如MS培養(yǎng)基或添加了有機(jī)添加物B5的MS培養(yǎng)基(即MSB培養(yǎng)基)。
在一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，將腋芽莖尖接種到含芐基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激動(dòng)素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基中使其形成愈傷組織并分化成芽。最適宜的培養(yǎng)基配方為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動(dòng)素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基。如果在僅加細(xì)胞分裂素而無(wú)赤霉酸的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則由長(zhǎng)大的腋芽基部葉柄內(nèi)側(cè)處直接形成叢生的芽簇，最多的可分化出具20多個(gè)芽的芽叢。這種芽葉子生長(zhǎng)較快，但莖的抽出速度卻較緩慢。
在另一實(shí)施方案中，將嫩葉葉柄置于含水解乳蛋白300-800毫克/升、芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升和萘乙酸0.1～0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)。在形成愈傷組織后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到有芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升、吲哚乙酸0.2-0.5毫克/升的新鮮的MSB基本培養(yǎng)基上進(jìn)行分化芽培養(yǎng)。最佳的是，誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為含水解乳蛋白500毫克/升、芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、萘乙酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基。最適宜的芽分化培養(yǎng)基為含芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、吲哚乙酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基。
在另一較佳的實(shí)施方案中，在上述步驟(b)之后、步驟(c)之前還包括一個(gè)步驟將從愈傷組織上切下的叢生芽置于培養(yǎng)基中培育至再次形成愈傷組織和叢生芽，并可重復(fù)該步驟以獲得大量叢生芽苗。所述培養(yǎng)基的配方宜為含芐基氨基嘌呤0.5-2.0毫克/升、激動(dòng)素0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基，更佳的為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動(dòng)素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基。
為了便于切取單芽進(jìn)行根的誘導(dǎo)長(zhǎng)成牡丹小植株，可把小芽叢及時(shí)轉(zhuǎn)移到附加芐基氨基嘌呤0.1-0.5毫克/升、吲哚丁酸0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基(更佳為附加芐基氨基嘌呤0.2毫克/升、吲哚丁酸0.2毫克/升、赤霉酸0.2毫克/升的MSB培養(yǎng)基)上，再培養(yǎng)30-40天，使叢芽的芽長(zhǎng)到3-4cm高。
在步驟c)中，可將切下步驟b)中的單芽先插入含吲哚丁酸30-80ppm(較佳為50ppm)的溶液中處理18-24小時(shí)，然后再轉(zhuǎn)入加有吲哚丁酸1.0-3.0毫克/升(較佳為2.0毫克/升)、芐基氨基嘌呤0.05-0.15毫克/升(較佳為0.1毫克/升)、0.4-0.6％活性炭和2-4％蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株。在較佳的實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基中還可添加PVP等抗氧化劑以基本解決牡丹試管苗的褐變。通過(guò)使用較低的激素濃度、增加光強(qiáng)度和及時(shí)進(jìn)行叢生芽分割，可有效地解決了牡丹試管苗的早衰、枯死及玻璃苗的技術(shù)難題。
在步驟d)中，可用常規(guī)手段對(duì)步驟c)獲得的完整小植株進(jìn)行移栽。
本發(fā)明的方法應(yīng)用植物細(xì)胞組織工作技術(shù)，建立了一種牡丹規(guī)模化快速繁殖方法，使之能進(jìn)入工廠化生產(chǎn)的階段，形成年產(chǎn)牡丹試管苗1萬(wàn)株能力的規(guī)?；a(chǎn)程序。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了從腋芽和嫩葉葉柄培育獲得可用于移栽的完整小植株的一個(gè)較佳實(shí)施流程，圖中BA表示6-芐基氨基嘌呤、KT表示激動(dòng)素、IAA表示吲哚乙酸、NAA表示萘乙酸、IBA表示吲哚丁酸、GA3表示赤霉酸、LH表示水解乳蛋白。
具體實(shí)施方案下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。在本申請(qǐng)中，除非另有所述，所有試劑的單位均用毫克/升表示。
材料和方法試驗(yàn)材料牡丹(Paeonia suffruticosa)名貴品種為“青龍臥墨池”；“十八號(hào)(瑞紅)”；“姚黃”；“魏紫”；“百花妒”，常觀品種為“洛陽(yáng)紅”；“胡紅”；“趙粉”；“胭脂紅”；“烏龍捧盛”共十個(gè)品種，由河南先農(nóng)公司提供。
1)腋芽的培養(yǎng)三月上中旬取上述10個(gè)品種的植株的腋芽，從腋芽上剝?nèi)?～6mm長(zhǎng)的莖尖，用75％酒精浸泡30秒鐘，然后在5％的次氯酸鈉溶液中浸泡8～10分鐘進(jìn)行表面滅菌，再用無(wú)菌水沖洗4～5次，用無(wú)菌濾紙吸干后，將外植體接種到含芐基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激動(dòng)素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±1℃，每天照光10小時(shí)，光強(qiáng)為1500～2000勒克斯。接種后2-3周，外植體先膨大并肉質(zhì)化，爾后在其基部周圍逐漸愈傷組織化，經(jīng)5～6周，基部形成一團(tuán)略帶紫紅色的愈傷組織，并由愈傷組織分化出芽。
2)嫩葉葉柄的培養(yǎng)三月中下旬取上述10個(gè)品種的植株嫩葉葉柄作離體培養(yǎng)的材料。將嫩葉葉柄切斷成長(zhǎng)約6～7mm長(zhǎng)的切段，用75％酒精浸泡30秒鐘，然后在5％的次氯酸鈉溶液中浸泡8～10分鐘進(jìn)行表面滅菌，再用無(wú)菌水沖洗4～5次，用無(wú)菌濾紙吸干后，將外植體放在加有水解乳蛋白500、芐基氨基嘌呤2.0和萘乙酸0.1～0.5的MSB培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25±1℃，每天照光10小時(shí)，光強(qiáng)為1500～2000勒克斯。葉柄切段培養(yǎng)15-20天后，從切口處先開(kāi)始形成愈傷組織。隨后形成的愈傷組織生長(zhǎng)迅速，大約1個(gè)半月后，整個(gè)外植體都長(zhǎng)成愈傷組織塊。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到附加芐基氨基嘌呤2.0、吲哚乙酸0.2-0.5的新鮮的MSB基本培養(yǎng)基上進(jìn)行分化芽培養(yǎng)，再經(jīng)6-8周培養(yǎng)，10個(gè)品種的葉柄切段愈傷組織，其分化芽的頻率為40-90％左右，平均每塊愈傷組織可形成8-20個(gè)芽的芽叢。
3)叢生芽的繼代培養(yǎng)將愈傷組織塊上的叢生芽分割，在新鮮的MSB+芐基氨基嘌呤1.0+激動(dòng)素0.3+赤霉酸0.3的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)1.5-2個(gè)月左右的培養(yǎng)，又產(chǎn)生愈傷組織及叢生芽，經(jīng)試驗(yàn)平均每隔二個(gè)月就可繼代培養(yǎng)產(chǎn)生叢生芽一次，有效芽的增殖系數(shù)可達(dá)4-6。這樣，通過(guò)一年的連續(xù)繼代分化程序培養(yǎng)，就可得到4千-1萬(wàn)個(gè)試管芽苗。
4)叢生芽的伸長(zhǎng)及根的誘導(dǎo)把小芽叢及時(shí)轉(zhuǎn)移到附加芐基氨基嘌呤0.2、吲哚丁酸0.2、赤霉酸0.2的MSB培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)30-40天，使叢芽的芽長(zhǎng)到3-4cm高，便于切取單芽進(jìn)行根的誘導(dǎo)長(zhǎng)成牡丹小植株。切取芽叢中長(zhǎng)到3-4cm高的單芽，先使單芽基部切口處陰干收疤1個(gè)小時(shí)左右，然后用濾紙橋法將其插入含50ppm吲哚丁酸的溶液中處理18-24小時(shí)(芽基部插入溶液中的深度為2-3mm)，然后用無(wú)菌濾紙吸干，再轉(zhuǎn)入附加吲哚丁酸2.0、芐基氨基嘌呤0.1、0.5％活性炭、2％蔗糖，而大量元素濃度減半的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)大約7-10天后在芽的基部切口處即開(kāi)始形成鋸齒狀凸起，2-3星期左右由此長(zhǎng)成白嫩粗壯的初生根。再經(jīng)25-35天即可形成具良好的根系的牡丹小植株。在該試驗(yàn)條件下，牡丹試管苗誘導(dǎo)生根率可達(dá)90-95％。
5)由腋芽、嫩葉的葉柄培養(yǎng)年繁殖獲得的牡丹試管苗發(fā)明人在2003-2004年期間對(duì)牡丹的10個(gè)品種繁殖的牡丹試管苗數(shù)如下表所示

6)牡丹試管小植株的移栽當(dāng)牡丹試管小植株誘導(dǎo)出3-4條根，并長(zhǎng)到2-3cm長(zhǎng)時(shí)即可移栽。移栽前，將瓶塞打開(kāi)加入少許無(wú)菌水淹沒(méi)固體培養(yǎng)基，放入陽(yáng)光充足、通風(fēng)處煉苗3-4天。取出小植株后，用溫水沖去瓊脂，將試管小植株直接移栽到盛沙性的中性土壤或用1/2MS大量元素濕潤(rùn)的蛭石的盆中。移栽后，用透明薄膜加以覆蓋，以免過(guò)度蒸騰并保持一定濕度。一周后逐步揭開(kāi)透明薄膜，二周后去掉薄膜，牡丹小植株即可成活正常生長(zhǎng)。結(jié)果表明，牡丹試管小植株的移栽成活率達(dá)到85-90％。
綜上所述，通過(guò)三年多的培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)明人已能從牡丹的10個(gè)品種(包括5個(gè)名貴品種和5個(gè)早、中、晚花期的常規(guī)品種)的腋芽、嫩葉的葉柄培養(yǎng)，分別獲得叢生芽，經(jīng)繼代或伸長(zhǎng)培養(yǎng)，切割單芽誘導(dǎo)生根，基本解決了牡丹試管苗生根難的問(wèn)題。根據(jù)本實(shí)施例所確定的條件，試管苗生根率可達(dá)90-95％。分割叢生芽經(jīng)繼代培養(yǎng)和伸長(zhǎng)培養(yǎng)，在2003-2004年度，發(fā)明人達(dá)到了年繁殖牡丹試管苗5500多株的水平。據(jù)統(tǒng)計(jì)其有效繁殖系數(shù)可達(dá)4-6，每隔2.5-3個(gè)月繼代及伸長(zhǎng)一次，如在開(kāi)始階段能提供200個(gè)以上的腋芽、嫩葉的葉柄外植體，則就能形成一套年產(chǎn)牡丹試管苗1萬(wàn)株能力的規(guī)?；a(chǎn)程序及工藝。
權(quán)利要求
1.一種快速繁殖牡丹的方法，該方法包括以下步驟a)取植株腋芽莖尖或嫩葉葉柄置于基本培養(yǎng)基中培育至形成愈傷組織并分化出芽，其中所述基本培養(yǎng)基中添加了一種或多種選自6-芐基氨基嘌呤、激動(dòng)素、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸、赤霉酸、水解乳蛋白、活性炭、蔗糖的物質(zhì)；b)從愈傷組織上切下叢生芽，將其轉(zhuǎn)移到加有芐基氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉酸的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)至單芽長(zhǎng)至3-5cm高；c)切下步驟b)中的所述單芽，用濾紙橋法將其插入含吲哚丁酸的溶液中處理18-24小時(shí)，然后再轉(zhuǎn)入加有吲哚丁酸、芐基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株；d)移栽步驟c)形成的小植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟a)中，將腋芽莖尖接種到含芐基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激動(dòng)素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基中使其形成愈傷組織并分化成芽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動(dòng)素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟a)中，將嫩葉葉柄置于含水解乳蛋白300-800毫克/升、芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升和萘乙酸0.1～0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基上，進(jìn)行誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)；在形成愈傷組織后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到有芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升、吲哚乙酸0.2-0.5毫克/升的新鮮的MSB基本培養(yǎng)基上進(jìn)行分化芽培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為含水解乳蛋白500毫克/升、芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、萘乙酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基；芽分化培養(yǎng)基為含芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、吲哚乙酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)之后、步驟(c)之前還包括一個(gè)步驟將從愈傷組織上切下的叢生芽置于培養(yǎng)基中培育至再次形成愈傷組織和叢生芽，并可重復(fù)該步驟以獲得大量叢生芽苗，其中所述培養(yǎng)基為含芐基氨基嘌呤0.5-2.0毫克/升、激動(dòng)素0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動(dòng)素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟b)中，使小芽叢轉(zhuǎn)移到附加芐基氨基嘌呤0.1-0.5毫克/升、吲哚丁酸0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養(yǎng)基上再培養(yǎng)30-40天，使叢芽的芽長(zhǎng)到3-4cm高。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟c)中，將切下步驟b)中的單芽先插入含吲哚丁酸30-80ppm的溶液中處理18-24小時(shí)，然后再轉(zhuǎn)入加有吲哚丁酸1.0-3.0毫克/升、芐基氨基嘌呤0.05-0.15毫克/升、0.4-0.6％活性炭和2-4％蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有抗氧化劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種快速繁殖牡丹的方法，該方法包括a)取植株腋芽莖尖或嫩葉葉柄置于培養(yǎng)基中培育至形成愈傷組織并分化出芽，b)從愈傷組織上切下叢生芽，將其培養(yǎng)至單芽長(zhǎng)至3－5cm高；c)將步驟b)的單芽插入含吲哚丁酸的溶液中，再轉(zhuǎn)入加有吲哚丁酸、芐基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成小植株；d)移栽步驟c)形成的小植株。本發(fā)明應(yīng)用植物細(xì)胞組織工作技術(shù)，建立了一種牡丹規(guī)?；焖俜敝撤椒?，形成了年產(chǎn)牡丹試管苗1萬(wàn)株能力的規(guī)?；a(chǎn)程序。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1768576SQ20041006776
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者衛(wèi)志明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院