交叉引用

本申請要求了2015年2月9日提交的美國臨時(shí)專利申請序列號62/113669的優(yōu)先權(quán)，該專利申請以其全部通過引用被并入本文。

背景技術(shù)：

缺陷性代謝能穩(wěn)態(tài)(defectivemetabolicenergyhomeostasis)，即葡萄糖不耐受和胰島素抗性，已經(jīng)在肌萎縮性側(cè)索硬化(als)患者和轉(zhuǎn)基因小鼠模型二者中被觀察到。大約三分之二的als患者發(fā)展為代謝紊亂比如糖尿病。因而，需要用于治療和限制als患者中糖尿病發(fā)展的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一方面，本發(fā)明提供了用于治療和/或用于限制患有肌萎縮性側(cè)索硬化(als)的對象中糖尿病發(fā)展的方法，其包括抑制對象的細(xì)胞中電壓門控鈣通道(vgcc)的igg介導(dǎo)的激活，其中抑制包括下列的一種或多種：

(i)從對象的血液中除去igg；

(ii)阻斷igg激活對象中的vgcc；和

(iii)阻斷對象中的vgcc。

在一個(gè)實(shí)施方式中，抑制包括從對象中除去血清igg持續(xù)足以治療或限制對象中糖尿病發(fā)展的時(shí)間，其中除去包括將從對象獲得的血液與igg吸附劑接觸，持續(xù)適合于促進(jìn)igg吸附至吸附劑上的時(shí)間并且在適合于促進(jìn)igg吸附至吸附劑上的條件下。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，igg吸附劑包括但不限于抗人igg抗體。在另一實(shí)施方式中，抑制包括阻斷igg激活vgcc，其中阻斷包括給對象施用對于治療或限制對象中糖尿病發(fā)展有效量的igg表達(dá)或活性的抑制劑，其中抑制劑可以包括但不限于抗igg抗體、igg阻斷適配體、igg小干擾rna、igg小的內(nèi)部片段化干擾rna(iggsmallinternallysegmentedinterferingrna)、igg短發(fā)夾rna、igg微rna和igg反義寡核苷酸。在仍進(jìn)一步實(shí)施方式中，抑制包括阻斷對象中的vgcc，其中阻斷包括給對象施用對于治療或限制對象中糖尿病發(fā)展有效量的vgcc表達(dá)或活性的抑制劑，其中抑制劑可以包括但不限于ca²⁺通道阻斷劑、vgcc特異性抗體、適配體、小干擾rna、小的內(nèi)部片段化干擾rna、短發(fā)夾rna、微rna和/或反義寡核苷酸。例如，抑制劑可以是vgcc的抑制劑，其包括但不限于苯烷胺類(phenilalkylamines)、苯并硫氮雜類(benzothiazepines)和二氫吡啶類。在其它實(shí)施方式中，vgcc的抑制劑可以包括但不限于尼索地平(sular)、硝苯地平(adalat，procardia)、尼卡地平(cardene)、伊拉地平(dynacirc)、尼莫地平(nimotop)、非洛地平(plendil)、氨氯地平(norvasc)、地爾硫(cardizem)、拉西地平、樂卡地平和異搏定(calan，isoptin)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法治療或限制ii型糖尿病的發(fā)展。在另一實(shí)施方式中，該方法限制i型糖尿病的發(fā)展。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下的als患者的方法，其包括

a)將細(xì)胞與來自患有als的對象的血液樣本接觸；

b)測量[ca²⁺]i振蕩模式(oscillationpattern)和/或全細(xì)胞ca²⁺電流，并將測量的振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流與對照進(jìn)行比較；和

c)鑒定相對于對照具有改變的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的那些對象為處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下的als患者的方法，其包括：

a)測定從患有als的對象獲得的血液樣本中的igg水平；

b)將血液樣本中的igg水平與對照進(jìn)行比較；和

c)鑒定血液樣本中具有升高水平的igg的那些對象為處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下。

在仍進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供了用于鑒定治療和/或限制患有als的對象中糖尿病發(fā)展的候選化合物的方法，其包括

a)將第一細(xì)胞群和第二細(xì)胞群與來自患有als和糖尿病的對象的血液樣本接觸，并進(jìn)一步將第二胰細(xì)胞群與一種或多種測試化合物接觸；

b)測量第一群和第二群中的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流；和

c)鑒定相對于第一群導(dǎo)致第二群中[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的減少改變的那些化合物為用于治療和/或限制患有als的對象中糖尿病發(fā)展的候選化合物。

在任何這些方面的一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞、或第一細(xì)胞群和第二細(xì)胞群包括胰島細(xì)胞、肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和/或神經(jīng)細(xì)胞。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，細(xì)胞、或第一細(xì)胞群和第二細(xì)胞群包括胰細(xì)胞，并且其中胰細(xì)胞包括胰島、胰腺β細(xì)胞和/或胰腺α細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，接觸在存在刺激性葡萄糖濃度、刺激性鉀濃度和/或其中去極化電壓被施加至第一細(xì)胞群和第二細(xì)胞群的情況下進(jìn)行。在進(jìn)一步實(shí)施方式中，血液樣本可以是全血、血清或血漿。

附圖說明

圖1.als-tg小鼠中擾亂的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島細(xì)胞功能的als血清誘導(dǎo)的退化。(a)7-8周齡als-tg(tg)和野生型(wt)小鼠中腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試。(b)來自從野生型和als-tg小鼠分離的并暴露于3.3和11.1mm葡萄糖(glu)的胰島的胰島素分泌。(c)來自wt和als-tg小鼠的胰島中葡萄糖誘導(dǎo)的[ca²⁺]i振蕩模式?？傆?jì)野生型組(上面)中的95個(gè)和als-tg組(下面)中的98個(gè)之中的代表性的[ca²⁺]i追蹤。(d)δfura-2340/380比率，其顯示wt和als-tg胰島中[ca²⁺]i的k⁺去極化誘導(dǎo)的凈增加。(e)用正常胎牛血清(fbs，上面)、來自患有糖尿病但是不患有als的患者的對照血清(ctl，中間)和人als血清(als，下面)孵育10小時(shí)的胰島的形態(tài)學(xué)改變。(f)從5只小鼠分離的胰島獲得的分別在fbs、ctl和als組中總計(jì)33、72和40個(gè)記錄之中的代表性的[ca²⁺]i追蹤。(g)來自用als血清(n＝3)和ctl血清(n＝2)處理10小時(shí)，然后用3.3和11.1mm葡萄糖攻擊30分鐘的胰島的胰島素分泌，其中n表示als和ctl患者的數(shù)目。(h)來自經(jīng)歷用als或ctl患者血清孵育的胰島的凈胰島分泌的總結(jié)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±sem，*p<0.05。

圖2.als血清對小鼠胰島細(xì)胞和分泌葡萄糖的αtc1-6細(xì)胞中[ca²⁺]i處置(handling)以及小鼠胰島細(xì)胞和分泌葡萄糖的αtc1-6細(xì)胞的存活力的影響。(a)暴露于als血清(左邊)和從患有糖尿病但是不患有als的患者獲得的ctl血清(右邊)的小鼠胰島細(xì)胞中的k⁺去極化誘導(dǎo)的[ca²⁺]i應(yīng)答。(b)δfura-2340/380比率，其顯示通過用als血清和ctl血清孵育的小鼠胰島細(xì)胞中k⁺去極化誘導(dǎo)的[ca²⁺]i的平均凈增加。(c)用ctl血清和兩種als血清孵育的胰島細(xì)胞中硝苯地平敏感的ca²⁺通道的平均電流-電壓關(guān)系。插圖圖解了als血清處理的細(xì)胞(下面)和用對照血清孵育的細(xì)胞(上面)中代表性的全細(xì)胞ca²⁺電流。(d)平均wst-1吸光度，其顯示了暴露于als(n＝4)、ctl血清(n＝2)或fbs的解離的胰島細(xì)胞的存活力。(e)對照αtc1-6細(xì)胞(左邊)和用als血清處理的αtc1-6細(xì)胞(右邊)中k⁺去極化誘導(dǎo)的[ca²⁺]i應(yīng)答的代表性的記錄。(f)δfura-2340/380比率，其顯示用對照血清-(n＝2)處理的細(xì)胞和als血清-暴露的αtc1-6細(xì)胞(n＝4)中[ca²⁺]i的平均凈增加，其中n表示ctl和als患者的數(shù)目。(g)平均wst-1吸光度，其顯示在暴露于als血清、ctl血清和fbs之后的αtc1-6細(xì)胞的存活力。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±sem。***p<0.0005，**p<0.005和*p<0.05。

圖3.從人als血清純化的igg干擾胰島細(xì)胞功能和存活。(a)對暴露于ctligg或alsigg過夜的小鼠胰島細(xì)胞中k⁺去極化的平均[ca²⁺]i應(yīng)答。(b)δfura-2340/380比率，其顯示用對照igg、alsigg或煮沸的alsigg(n＝2、3、3)處理的細(xì)胞中[ca²⁺]i的平均凈增加，其中n表示ctl和als患者的數(shù)目。(c)平均wst-1吸光度，其顯示在暴露于從兩個(gè)ctl對象和三個(gè)als患者以及fbs純化的igg24h之后胰島細(xì)胞的存活力。(d)平均wst-1吸光度，其顯示了用患者的igg(n＝3)——煮沸或不煮沸——處理24小時(shí)的胰島細(xì)胞的存活力。(e)在對用ctl-igg或als-igg孵育過夜之后αtc1-6細(xì)胞中k⁺去極化的[ca²⁺]i應(yīng)答的平均改變。(f)δfura-2340/380比率，其顯示經(jīng)歷用ctligg、alsigg或煮沸的als-igg(n＝2、3、2)過夜處理的αtc1-6細(xì)胞中[ca²⁺]i的平均凈增加。(g)平均wst-1吸光度，其顯示了暴露于純化的ctligg、alsigg和煮沸的alsigg24小時(shí)的αtc1-6細(xì)胞的存活力(n＝2、3、2；其中n表示ctl和als患者的數(shù)目)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±sem。***p<0.0005，**p<0.005和*p<0.05。

圖4.als-tg小鼠胰島和als血清處理的小鼠胰島中擾亂的[ca²⁺]i處置。(a)在來自野生型(上面，n＝14)和als-tg小鼠(下面，n＝17)的胰島中在葡萄糖(11.1mm)和kcl(25mm)刺激之前和期間中登記的[ca²⁺]i追蹤。(b)在fbs-(上面，n＝33)、ctl血清-(中間，n＝72)和als血清處理的野生型小鼠胰島(下面，n＝40)中在葡萄糖(11.1mm)之前和期間獲得的[ca²⁺]i追蹤。

圖5.特定的ca²⁺通道阻斷劑agtx和硝苯地平對小鼠胰島細(xì)胞和αtc1-6細(xì)胞中k⁺去極化誘導(dǎo)的[ca²⁺]i應(yīng)答和全細(xì)胞ca²⁺電流的影響。(a)對照小鼠胰島細(xì)胞和用agtx或硝苯地平預(yù)處理的細(xì)胞中k⁺去極化誘導(dǎo)的[ca²⁺]i應(yīng)答(左邊)。δfura-2340/380比率，其顯示通過對照小鼠胰島細(xì)胞和用agtx或硝苯地平預(yù)處理的細(xì)胞中k⁺去極化誘導(dǎo)的[ca²⁺]i的平均凈增加(右邊)。(b)在暴露于硝苯地平之前(紅色)和期間(綠色)以及洗滌之后(藍(lán)色)小鼠胰島細(xì)胞中的代表性的全細(xì)胞ca²⁺電流(上面)。在暴露于硝苯地平之前(紅色)和期間(綠色)以及洗滌之后(藍(lán)色)細(xì)胞中的平均ca²⁺電流密度(n＝3)(下面)。(c)對在對照αtc1-6細(xì)胞和預(yù)暴露于agtx或硝苯地平的細(xì)胞中k⁺去極化的[ca²⁺]i應(yīng)答(左邊)。δfura-2340/380比率，其顯示通過對照αtc1-6細(xì)胞和預(yù)暴露于agtx或硝苯地平的細(xì)胞中k⁺去極化誘導(dǎo)的[ca²⁺]i的平均凈增加(右邊)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±sem，**p<0.005和*p<0.05。

圖6.igg從不同的血清純化，通過sds-page(6-16％)鑒定，并通過考馬斯亮藍(lán)染色。泳道1：分子量標(biāo)記(分子量范圍10-245kda，solgent)，泳道2：來自sigma的人igg，泳道3：ctl-7igg，泳道4：ctl-7igg，泳道5：als-374igg和泳道6：als-374igg。泳道4和6中示出的制劑包含igg和非igg成分。

圖7.ctl-igg和als-igg時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)αtc1-6細(xì)胞死亡。(a)暴露于對照igg或人alsigg分別持續(xù)12、24和48h的細(xì)胞中的總結(jié)圖，其顯示平均wst-1吸光度，反映代謝活躍的活細(xì)胞。在包含正常fbs的培養(yǎng)基中，αtc1-6細(xì)胞數(shù)目隨著孵育時(shí)間增加。相反，在igg存在的情況下，αtc1-6細(xì)胞的數(shù)目隨著孵育時(shí)間減少。當(dāng)用100μgigg孵育αtc1-6細(xì)胞時(shí)，在12小時(shí)之后，在存活力方面，在ctl-igg和als-igg之間沒有發(fā)生區(qū)別。對于細(xì)胞存活力測試，我們因此使用100μg的igg和24小時(shí)的孵育期(n＝2)。(b，c)在不存在或存在細(xì)胞外ca²⁺的情況下對在αtc1-6細(xì)胞中的k⁺去極化的[ca²⁺]i應(yīng)答?？傆?jì)127[ca²⁺]i追蹤在b和c中示出。

發(fā)明的詳細(xì)描述

引用的所有參考文獻(xiàn)在此通過引用以其全部被并入。在本申請內(nèi)，除非另有說明，利用的技術(shù)可以在數(shù)個(gè)公知的參考文獻(xiàn)中的任一個(gè)中發(fā)現(xiàn)，比如molecularcloning:alaboratorymanual(sambrook等，1989,coldspringharborlaboratorypress)、geneexpressiontechnology(methodsinenzymology,185卷，由d.goeddel編輯，1991.academicpress,sandiego,ca)、“guidetoproteinpurification”inmethodsinenzymology(m.p.deutshcer編輯，(1990)academicpress,inc.)；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis等，1990.academicpress,sandiego,ca)、cultureofanimalcells:amanualofbasictechnique,第二版.(r.i.freshney.1987.liss,inc.newyork,ny)、genetransferandexpressionprotocols，第109-128頁，編輯e.j.murray,thehumanapressinc.,clifton,n.j.)和theambion1998catalog(ambion,austin,tx)。

如本文所使用，單數(shù)形式“一個(gè)(a,an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另外明確指示。如本文所使用的“和”與“或”可互換地使用，除非另外明確地規(guī)定。

本發(fā)明的任何方面的所有實(shí)施方式可以組合使用，除非上下文另外明確指示。

在第一方面，本發(fā)明提供了用于治療和/或用于限制患有als的對象中糖尿病發(fā)展的方法，其包括抑制對象的細(xì)胞中電壓門控鈣通道(vgcc)的igg介導(dǎo)的激活，其中抑制包括下列的一種或多種：

(i)從對象的血液中除去igg；

(ii)阻斷igg激活對象中的vgcc；和

(iii)阻斷對象中的vgcc。

如下面的實(shí)施例中所示的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)als損害葡萄糖穩(wěn)態(tài)，這部分地是由于作為β細(xì)胞衰竭(cellfailure)的結(jié)果的減少的胰島素釋放，其通過由als-igg誘導(dǎo)的vgcc的超激活驅(qū)動(dòng)的缺陷性胞質(zhì)游離ca²⁺濃度([ca²⁺]i)處置而誘導(dǎo)。因而，限制igg激活als對象中的vgcc的能力的方法可以被用于治療或限制als對象中糖尿病的發(fā)展。

本發(fā)明的方法對患有als的對象實(shí)施。易受als影響的任何對象可以用本發(fā)明的方法治療，其包括但不限于人。

在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法用于治療糖尿病。在該實(shí)施方式中，als對象已經(jīng)被診斷為患有i型或ii型糖尿病。如本文所使用的，“糖尿病”的特征在于通過胰腺不充分地或不產(chǎn)生胰島素，導(dǎo)致高血糖水平。如本文所使用的，“治療糖尿病”意思是實(shí)現(xiàn)下列的一種或多種：(a)減輕糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的嚴(yán)重性；(b)限制或阻止糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展；(c)抑制糖尿病并發(fā)癥的惡化或糖尿病的癥狀特征的惡化；(d)限制或阻止糖尿病并發(fā)癥的復(fù)發(fā)或糖尿病的癥狀特征的復(fù)發(fā)；(e)限制或阻止先前有癥狀的對象中糖尿病并發(fā)癥的復(fù)發(fā)或糖尿病的癥狀特征的復(fù)發(fā)。

糖尿病的癥狀特征包括但不限于升高的血糖水平、減少的胰島素產(chǎn)生、胰島素抗性、增加的尿頻(多尿)、口渴(煩渴)、饑餓(多食)和原因不明的體重減輕。可以根據(jù)本發(fā)明的方法治療的糖尿病并發(fā)癥包括但不限于神經(jīng)中的并發(fā)癥(比如糖尿病性神經(jīng)病)、蛋白尿、腎小球清除受損(impairedglomerularclearance)和與平滑肌細(xì)胞調(diào)節(jié)異常(dysregulaton)相關(guān)聯(lián)的并發(fā)癥(包括但不限于勃起功能障礙、膀胱功能障礙和血管并發(fā)癥，其包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)和周圍血管疾病)。對這些癥狀/并發(fā)癥的任何量的限制對于患有糖尿病的als對象具有很大的益處。

在另一實(shí)施方式中，該方法用于限制als對象中糖尿病的發(fā)展。在該方面，als對象還沒有患糖尿病。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法限制對象中ii型糖尿病的發(fā)展；在另一實(shí)施方式中，該方法限制對象中i型糖尿病的發(fā)展。在這些實(shí)施方式中，“限制糖尿病的發(fā)展”可以包括，例如，限制/減緩高血糖癥、胰島素抗性、胰腺β細(xì)胞死亡、胰島素產(chǎn)生減少的進(jìn)展，和/或限制/減緩對象至i型或ii型糖尿病的臨床診斷的進(jìn)展。對糖尿病發(fā)展的任何量的限制對于als對象具有很大的益處。

如本發(fā)明人在本文中示出的，als損害葡萄糖穩(wěn)態(tài)，這部分地是由于作為β細(xì)胞衰竭的結(jié)果的減少的胰島素釋放，其通過由als-igg誘導(dǎo)的vgcc的超激活驅(qū)動(dòng)的缺陷性[ca²⁺]i處置而誘導(dǎo)。本發(fā)明的方法因而涉及抑制對象細(xì)胞中vgcc的igg介導(dǎo)的激活。任何這樣的抑制可以用于治療和/或限制對象中糖尿病的發(fā)展。在各個(gè)實(shí)施方式中，這樣的抑制導(dǎo)致對象細(xì)胞中vgcc的igg介導(dǎo)的激活的5％、10％、25％、50％或更大的降低。抑制als對象中各個(gè)細(xì)胞類型中vgcc的igg介導(dǎo)的激活是有價(jià)值的；例如，在胰島細(xì)胞、血管細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等中這樣的抑制有助于治療和/或限制對象中糖尿病的發(fā)展。

在一個(gè)實(shí)施方式中，抑制包括從對象除去血清igg(即igg耗盡)，其中抑制包括從對象除去血清igg持續(xù)足以治療或限制對象中糖尿病發(fā)展的時(shí)間，其中除去包括將從對象獲得的血液與igg吸附劑接觸，持續(xù)適合于促進(jìn)igg吸附至吸附劑上的時(shí)間和在適合于促進(jìn)igg吸附至吸附劑上的條件下。該實(shí)施方式類似于透析，其中血液從對象除去，“被凈化”，并以降低的igg含量返回至對象。血液可以包括全血，或者可以被分離為血漿和細(xì)胞成分。從對象獲得的血液樣本中igg的任何量的降低可用于治療和/或限制對象中糖尿病的發(fā)展。在各個(gè)實(shí)施方式中，方法導(dǎo)致吸附與igg吸附劑接觸的對象血液樣本中5％、10％、25％、50％或更多的igg?？梢允褂萌魏芜m合的igg吸附劑，其包括但不限于附著至固體載體(即柱免疫吸附)的抗人igg抗體。

在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，igg耗盡包括使用免疫吸附柱，其包含綴合至sepharose^tm珠的抗人igg。在本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平內(nèi)熟知基于本文的教導(dǎo)根據(jù)對象的所有因素確定為給定對象實(shí)施igg耗盡的適合的條件。

在另一實(shí)施方式中，抑制包括阻斷igg激活vgcc，其中阻斷包括給對象施用對于治療或限制對象中糖尿病發(fā)展有效量的igg表達(dá)或活性的抑制劑。如本文所使用，igg的表達(dá)和/或活性的“抑制劑”包括降低iggdna轉(zhuǎn)錄為mrna的化合物、降低iggmrna翻譯為蛋白質(zhì)的化合物和降低igg激活vgcc的能力的化合物。這樣的抑制可以是完全抑制或部分抑制，使得igg的表達(dá)和/或活性降低，導(dǎo)致激活vgcc的能力降低。在各個(gè)非限制性實(shí)施方式中，抑制劑可以包括但不限于抗igg抗體、igg阻斷適配體、igg小干擾rna、igg小的內(nèi)部片段化干擾rna、igg短發(fā)夾rna、igg微rna、igg反義寡核苷酸和igg的任何其它抑制劑(例如小分子抑制劑)。

在另一實(shí)施方式中，抑制包括阻斷對象中的vgcc，其中阻斷包括給對象施用對于治療或限制對象中糖尿病發(fā)展有效量的vgcc表達(dá)或活性的抑制劑。如本文所使用，vgcc的表達(dá)和/或活性的“抑制劑”包括降低vgccdna轉(zhuǎn)錄為mrna的化合物、降低vgccmrna翻譯為蛋白質(zhì)的化合物和降低vgcc的活性的化合物。這樣的抑制可以是完全抑制或部分抑制，使得vgcc的表達(dá)和/或活性降低。在各個(gè)實(shí)施方式中，抑制劑可以包括但不限于ca²⁺通道阻斷劑、vgcc特異性抗體、適配體、小干擾rna、小的內(nèi)部片段化干擾rna、短發(fā)夾rna、微rna和/或反義寡核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方式中，抑制劑是vgcc的抑制劑，其包括但不限于苯烷胺類、苯并硫氮雜類和二氫吡啶類。存在三種類別的vgcc阻斷劑，即二氫吡啶類、苯并硫氮雜類和苯烷胺類。二氫吡啶類對血管l型鈣通道具有高選擇型，苯烷胺類對于心臟l型鈣通道是相對選擇性的，和苯并硫氮雜類是中間的并且作用于心臟和血管l型鈣通道二者。示例性vgcc阻斷劑包括但不限于尼索地平硝苯地平尼卡地平伊拉地平尼莫地平非洛地平氨氯地平地爾硫拉西地平、樂卡地平和異搏定

表1

在這些實(shí)施方式的每個(gè)中，可以以劑量單位制劑通過任何適合的途徑施用治療劑，包括但不限于口服、外部、腸胃外、鼻內(nèi)、肺部或直腸，該劑量單位制劑包括常規(guī)的無毒性藥學(xué)上可接受的載體、佐劑和媒介。如本文所使用的術(shù)語腸胃外包括經(jīng)皮、皮下、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、肌肉內(nèi)或鞘內(nèi)注射或輸注技術(shù)等。另外，提供了包括本發(fā)明的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。治療劑可以以與一種或多種無毒性藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑和/或佐劑——并且如果需要其它活性成分——聯(lián)合存在。治療劑可以是適合于口服使用的形式，例如，作為片劑、錠劑、糖錠、水性或油性懸浮液、可分散的粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿劑或酏劑。

在另一實(shí)施方式中，治療劑也可以經(jīng)由本發(fā)明的組合物已經(jīng)被吸附或包封在其上的膜、海綿或其它適合的材料的植入被局部施用。在使用植入設(shè)備的地方，設(shè)備可以被植入期望的位置，比如被植入胰腺，并且期望分子的遞送可以經(jīng)由擴(kuò)散、定時(shí)釋放的大丸劑或連續(xù)施用。

劑量范圍取決于化合物的選擇、施用途徑、制劑的性質(zhì)、對象的狀況和主治醫(yī)師的判斷。例如，口服施用將被預(yù)期為比通過靜脈注射施用需要更高的劑量。這些劑量水平的變化可以使用標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)驗(yàn)主義途徑調(diào)節(jié)進(jìn)行最優(yōu)化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員很好理解的。

可接受的制劑材料優(yōu)選地是在采用的劑量和濃度下對接受者無毒性的。治療劑可以包含用于改變、維持或保存例如組合物的ph、摩爾滲透壓濃度、粘性、透明度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的制劑材料。適合的制劑材料包括但不限于氨基酸(比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)、抗菌劑、抗氧化劑(比如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩沖液(比如硼酸鹽、碳酸氫鹽、tris-hcl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其它有機(jī)酸)、膨脹劑(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑(比如乙二胺四乙酸(edta))、絡(luò)合劑(比如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精)、填料、單糖類、二糖類、和其它糖類(比如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(zhì)(比如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(比如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、形成鹽的平衡離子(比如鈉)、防腐劑(比如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(比如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇類(比如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或濕潤劑(比如普郎尼克類；peg；失水山梨醇酯；聚山梨醇酯類比如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨丁三醇；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(比如蔗糖或山梨醇)、張度增強(qiáng)劑(比如堿金屬鹵化物——優(yōu)選地氯化鈉或氯化鉀——或甘露醇山梨醇)、遞送媒介、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(參見，例如remington'spharmaceuticalsciences(第18版，a.r.gennaro編輯，mackpublishingcompany1990)，和其的隨后版本，通過引用出于任何目的被并入本文)。

如下面的實(shí)施例中示出的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)als損害葡萄糖穩(wěn)態(tài)，這部分地是由于作為β細(xì)胞衰竭的結(jié)果的減少的胰島素釋放，其通過由als-igg誘導(dǎo)的vgcc的超激活驅(qū)動(dòng)的缺陷性[ca²⁺]i處置而誘導(dǎo)。所產(chǎn)生的異常包括與對照相比改變的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流，其因而允許鑒定處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下的那些als對象的方法，并且因而可以根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行治療(即：限制糖尿病的發(fā)展)。

因而，在另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下的als對象的方法，其包括

a)將細(xì)胞與來自患有als的對象的血液樣本接觸；

b)測量[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流，并將測量的振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流與對照進(jìn)行比較；和

c)鑒定相對于對照具有改變的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的那些對象為處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下。

血液樣本可以是全血、血清、血漿或任何其它適合的血液樣本，其中可以存在來自als對象的循環(huán)igg。例如，血液樣本可以是血漿樣本。如本文所使用的，“血漿樣本”意思是血漿、血液的液體成分，并且例如通過離心全血以除去血細(xì)胞而制備。如本文所使用的，血漿樣本也包括血清樣本，其中凝血因子已經(jīng)被除去。

任何適合的細(xì)胞可以在本發(fā)明的方法中使用，其包括但不限于胰島細(xì)胞、肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞包括胰島。細(xì)胞與血液樣本的接觸可以在體外或在體內(nèi)(例如：在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中)；在一個(gè)實(shí)施方式中，接觸在體外發(fā)生。任何適合的條件可以被用于實(shí)施本發(fā)明的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞與血液樣本在刺激性葡萄糖濃度下接觸。這樣的刺激性葡萄糖濃度可以在6mm-20mm葡萄糖之間；可選地在6mm-15mm葡萄糖之間；在10mm-12mm葡萄糖之間，或大約11mm葡萄糖。在另一實(shí)施方式中，接觸在適合于打開細(xì)胞中的鈣通道的條件下進(jìn)行。例如，去極化電壓(-50到50mv)可以被施加至細(xì)胞。另外地(或組合地)，細(xì)胞與血液樣本在足以打開細(xì)胞中的鈣通道的鉀濃度下接觸。這樣的刺激性鉀濃度可以在25mm和50mm鉀之間；可選地在25mm-40mm鉀之間；在25mm-30mm鉀之間，或大約25mm鉀。

在進(jìn)一步實(shí)施方式中，細(xì)胞在大約37℃下培養(yǎng)(優(yōu)選地在加濕的培養(yǎng)箱中，比如5％co2)，然后在大約室溫下測量[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流。用于測量細(xì)胞[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的技術(shù)(比如通過[ca²⁺]i、單通道和全細(xì)胞膜片鉗測量(細(xì)胞附著和穿孔的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù))，其是本領(lǐng)域中熟知的)，和其它實(shí)施本發(fā)明的方法的適合的測定條件很好地在基于本文教導(dǎo)的本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平內(nèi)。

可以使用任何適合的對照，其包括但不限于在相同的條件下——除了與als對象的血液樣本接觸之外——處理的細(xì)胞(例如，其中對照細(xì)胞與(i)來自非als對象的血液樣本接觸，或(ii)與可選的對照樣本接觸)，或預(yù)定的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流閾值，使得與閾值不同(即更快的振蕩模式和/或更高的全細(xì)胞ca²⁺電流閾值)的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流指示發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。指示als對象中發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的與對照的差異可以是10％、25％、50％、100％或更多的差異。在一個(gè)實(shí)施方式中，差異是通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析判斷的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。

在一個(gè)實(shí)施方式中，als對象處于i型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下；在另一實(shí)施方式中，als對象處于ii型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下的als患者的方法，其包括：

a)測定從患有als的對象獲得的血液樣本中的igg水平；

b)將血液樣本中的igg水平與對照進(jìn)行比較；和

c)鑒定血液樣本中具有升高水平的igg的那些對象為處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下。

本發(fā)明人已經(jīng)在下面的實(shí)施例中示出了igg誘導(dǎo)als患者中vgcc的超激活，這導(dǎo)致糖尿病的發(fā)展。因而，處于發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下的als對象可以通過檢測血液樣本中升高水平的igg來鑒定。血液樣本可以是全血、血清、血漿或任何其它適合的血液樣本，其中可以存在來自asl對象的循環(huán)igg。例如，血液樣本可以是血漿樣本。

可以使用任何適合的對照，包括但不限于在相同的條件下——除了與als對象的血液樣本接觸之外——處理的細(xì)胞(例如，其中對照細(xì)胞與(i)來自非als對象的血液樣本接觸，或(ii)與可選的對照樣本接觸)，或預(yù)定的igg閾值，使得高于閾值的igg水平指示發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。指示als對象中發(fā)展糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)的與對照的差異可以是10％、25％、50％、100％或更多的差異。在一個(gè)實(shí)施方式中，差異是通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析判斷的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。用于測定血液樣本中igg的水平的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。

在一個(gè)實(shí)施方式中，als對象處于i型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下；在另一實(shí)施方式中，als對象處于ii型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)下。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于鑒定治療和/或限制患有als的對象中糖尿病發(fā)展的候選化合物的方法，其包括

a)將第一細(xì)胞群和第二細(xì)胞群與來自患有als和糖尿病的對象的血液樣本接觸，并進(jìn)一步將第二胰細(xì)胞群與一種或多種測試化合物接觸；

b)測量第一群和第二群中的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流；和

c)鑒定相對于第一群導(dǎo)致第二群中[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的減少改變的那些化合物為用于治療和/或限制患有als的對象中糖尿病發(fā)展的候選化合物。

如下面的實(shí)施例中示出的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)als損害葡萄糖穩(wěn)態(tài)，這部分地是由于作為β細(xì)胞衰竭的結(jié)果的減少的胰島素釋放，其通過由als-igg誘導(dǎo)的vgcc的超激活驅(qū)動(dòng)的缺陷性[ca²⁺]i處置而誘導(dǎo)。所產(chǎn)生的異常包括與對照相比改變的[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流，其因而允許鑒定治療和/或限制糖尿病發(fā)展的候選化合物的方法。

血液樣本可以是全血、血清、血漿或任何其它適合的血液樣本，其中可以存在來自asl對象的循環(huán)igg。例如，血液樣本可以是血漿樣本。

任何適合的細(xì)胞可以在本發(fā)明的方法中使用，其包括但不限于胰島細(xì)胞、肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞包括胰島。細(xì)胞與血液樣本的接觸可以在體外或在體內(nèi)(例如：在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中)；在一個(gè)實(shí)施方式中，接觸在體外發(fā)生。任何適合的條件可以被用于實(shí)施本發(fā)明的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞與血液樣本在刺激性葡萄糖濃度下接觸。這樣的刺激性葡萄糖濃度可以在6mm-20mm葡萄糖之間；可選地在6mm-15mm葡萄糖之間；在10mm-12mm葡萄糖之間，或大約11mm葡萄糖。在另一實(shí)施方式中，接觸在適合于打開細(xì)胞中的鈣通道的條件下進(jìn)行。例如，去極化電壓可以被施加至細(xì)胞(-50到50mv)。另外地(或組合地)，細(xì)胞與血液樣本在足以打開細(xì)胞中的鈣通道的鉀濃度下接觸。這樣的刺激性鉀濃度可以在25mm和50mm鉀之間；可選地在25mm-40mm鉀之間；在25mm-30mm鉀之間，或大約25mm鉀。

在進(jìn)一步實(shí)施方式中，細(xì)胞在大約37℃下培養(yǎng)(優(yōu)選地在加濕的培養(yǎng)箱中，比如5％co2)，然后在大約室溫下測量[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流。用于測量細(xì)胞[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的技術(shù)(比如通過[ca²⁺]i、單通道和全細(xì)胞膜片鉗測量(細(xì)胞附著和穿孔的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù))，其是本領(lǐng)域中熟知的)，和其它實(shí)施本發(fā)明的方法的適合的測定條件很好地在基于本文教導(dǎo)的本領(lǐng)域技術(shù)人員的水平內(nèi)。

指示測試化合物是用于治療和/或限制als發(fā)展的候選化合物的與對照的差異可以是細(xì)胞[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的10％、25％、50％、100％或更大的降低。在一個(gè)實(shí)施方式中，差異是通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析判斷的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。用于測量細(xì)胞[ca²⁺]i振蕩模式和/或全細(xì)胞ca²⁺電流的技術(shù)(比如通過[ca²⁺]i、單通道和全細(xì)胞膜片鉗測量(細(xì)胞附著和穿孔的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，其是本領(lǐng)域中熟知的)。

在一個(gè)實(shí)施方式中，候選化合物是用于限制i型糖尿病發(fā)展和/或治療i型糖尿病的候選化合物。在另一實(shí)施方式中，候選化合物是用于限制ii型糖尿病發(fā)展和/或治療ii型糖尿病的候選化合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過上面的篩選方法鑒定的化合物，和它們用于治療需要其的對象的用途。

當(dāng)測試化合物包括多肽序列時(shí)，這樣的多肽可以化學(xué)合成或重組表達(dá)。重組表達(dá)可以施用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)方法完成，如上面公開的。這樣的表達(dá)載體可以包括細(xì)菌或病毒表達(dá)載體，并且這樣的宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。使用固相、液相的公知技術(shù)，或肽縮合技術(shù)，或其任何組合制備的合成多肽可以包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是利用標(biāo)準(zhǔn)脫保護(hù)、中和、偶聯(lián)和洗滌方案的標(biāo)準(zhǔn)的boc(nα-氨基保護(hù)的nα叔丁氧羰基)氨基酸樹脂，或標(biāo)準(zhǔn)堿不穩(wěn)定的nα-氨基保護(hù)的9-芴甲氧羰基(fmoc)氨基酸。fmoc和bocnα-氨基保護(hù)的氨基酸都可以從sigma、cambridgeresearchbiochemical或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其它化學(xué)公司獲得。另外，多肽可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的其它nα-保護(hù)基團(tuán)合成。固相肽合成可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)完成，并且例如通過使用自動(dòng)化合成器提供。

當(dāng)測試化合物包括抗體時(shí)，這樣的抗體可以是多克隆的或單克隆的?？贵w可以是人源化、全人或鼠科形式的抗體。這樣的抗體可以通過公知的方法制造，比如在harlowandlane,antibodies；alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,n.y.,(1988)中描述的。

當(dāng)測試化合物包括核酸序列時(shí)，這樣的核酸也可以化學(xué)合成或重組表達(dá)。重組表達(dá)技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的(參見，例如，sambrook等，1989，上面)。核酸可以是dna或rna，并且可以是單鏈或雙鏈的。類似地，這樣的核酸可以通過人工或自動(dòng)化反應(yīng)使用本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)化學(xué)地或酶促地合成。如果化學(xué)地合成或者通過體外酶促合成，則核酸可以在引入細(xì)胞中之前被純化。例如，核酸可以從混合物中通過利用溶劑或樹脂的提取、沉淀、電泳、色譜法或其組合進(jìn)行純化?？蛇x地，核酸可以在不純化或最小純化的情況下使用，以避免由于樣本加工而造成的損失。

當(dāng)測試化合物包括除了多肽、抗體或核酸之外的化合物時(shí)，這樣的化合物可以通過本領(lǐng)域中用于進(jìn)行有機(jī)化學(xué)合成的許多方法中的任一種制造。

實(shí)施例

概要

患有神經(jīng)變性疾病肌萎縮性側(cè)索硬化(als)的患者常常顯示ii型糖尿病(t2dm)的特點(diǎn)，比如受損的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。盡管這個(gè)重要的關(guān)系，但是als和t2dm之間的因果關(guān)系仍然是個(gè)謎。我們現(xiàn)在證明了als與受損的葡萄糖穩(wěn)態(tài)相關(guān)聯(lián)，這部分地是由于由改變的β細(xì)胞功能和存活造成的減少的胰島素釋放。后者通過由als-igg誘導(dǎo)的電壓門控ca²⁺通道的超激活驅(qū)動(dòng)的胞質(zhì)游離ca²⁺濃度([ca²⁺]i)的缺陷處置誘導(dǎo)。als-igg對[ca²⁺]i和細(xì)胞存活的類似作用在αtc1-6細(xì)胞中建立。我們的發(fā)現(xiàn)因而指出了als和糖尿病之間的機(jī)械連接，這可以為遭受這些嚴(yán)重疾病組合的患者的新型藥物治療策略奠定基礎(chǔ)。

介紹

肌萎縮性側(cè)索硬化(als)是毀滅性的神經(jīng)變性疾病。受影響的個(gè)體顯示了腦干和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性功能障礙和退化。沒有明確的可用于als的治療劑并且臨床上als患者揭示了高度肌無力、麻痹和在2～5年內(nèi)死亡(1)。als的病因?qū)W是未知的，但是電壓門控ca²⁺通道(vgcc)的功能障礙并且從而胞質(zhì)游離ca²⁺濃度([ca²⁺]i)以及突觸可塑性已經(jīng)被提出(2,3)。而且，免疫系統(tǒng)可以有助于als的發(fā)病機(jī)理。神經(jīng)組織和細(xì)胞中ca²⁺累積的超微結(jié)構(gòu)異常和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元處增加的遞質(zhì)釋放已經(jīng)在用來自als患者的純化的免疫球蛋白g(igg)處理的嚙齒動(dòng)物中描述(4)。增加的[ca²⁺]i可以導(dǎo)致線粒體功能障礙、自由基損傷和細(xì)胞毒性(5-7)。大量的神經(jīng)變性疾病比如als已知與ii型糖尿病(t2dm)的特點(diǎn)——比如受損的葡萄糖穩(wěn)態(tài)——相關(guān)聯(lián)，但是因果關(guān)系是未知的(8-10)。胰島在調(diào)控血糖穩(wěn)態(tài)中具有核心作用。在本研究中，我們測試了如下假設(shè)：與als相關(guān)聯(lián)的糖尿病由負(fù)面影響胰島細(xì)胞功能和存活的循環(huán)因子引起。

大約20％的具有家族性als病史(fals)的患者具有cu²⁺/zn²⁺超氧化物歧化酶(sod1)基因的突變(11)。最近的研究已經(jīng)證明9號染色體開放閱讀框(c9orf72)基因重復(fù)擴(kuò)展是西方國家中fals的最通常的遺傳原因，并且包括tdp43、fus、optn、ubqln2和nefh基因的各種基因突變也涉及fals的責(zé)任原因(12)。在als的各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中，sod1突變的(sod1^g93a)小鼠保持為細(xì)胞死亡機(jī)制的可靠模型，尤其集中于與通過在als患者中的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)揭示的那些類似的免疫炎癥方面。

結(jié)果和討論

我們使用7-8周齡的sod1^g93a轉(zhuǎn)基因(als-tg)小鼠和周齡匹配的對照研究了胰島功能的各個(gè)方面。執(zhí)行腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試(圖1a)。als-tg小鼠證明了與野生型同窩小鼠相比較低效率的葡萄糖穩(wěn)態(tài)——通過從血液的較低效率的葡萄糖清除顯示。來自als-tg小鼠的胰島顯示了與來自野生型小鼠的胰島相比相當(dāng)?shù)偷钠咸烟谴碳さ囊葝u素釋放(圖1b)。葡萄糖刺激的胰島素分泌起因于通過vgcc的增加的β細(xì)胞ca²⁺流入和因而的[ca²⁺]i增加。葡萄糖不僅增加[ca²⁺]i而且引起β細(xì)胞以及胰島中周期范圍為數(shù)秒至數(shù)分鐘的[ca²⁺]i振蕩模式(15-19)。這些類型的[ca²⁺]i振蕩模式對于β細(xì)胞功能和存活是重要的并且也充當(dāng)β細(xì)胞健康的指紋。接著，我們因此研究了在用高葡萄糖刺激之后[ca²⁺]i的改變。在來自野生型小鼠的胰島和來自als-tg小鼠的胰島之間在[ca²⁺]i振蕩模式的分布中存在顯著差異(圖1c、d和圖4a)。與野生型胰島相比，來自als-tg小鼠的胰島顯示了高頻類型的[ca²⁺]i振蕩的顯著損失(圖1c、d和補(bǔ)充圖1a)。再者，[ca²⁺]i的k⁺誘導(dǎo)的增加在als-tg胰島和對照胰島之間是有顯著差異的，前者更明顯(圖1c、d和圖4a)。

為了澄清在患有t2dm的als患者中是否存在可能影響β細(xì)胞[ca²⁺]i處置的循環(huán)因子，我們研究了來自als患者的血清對通過11mm葡萄糖刺激的小鼠胰島中[ca²⁺]i振蕩的影響。我們在本研究中僅使用來自患有t2dm的散發(fā)病例的als血清。與包含對照血清或正常fbs的培養(yǎng)基相比，暴露于als血清的胰島展現(xiàn)了它們的[ca²⁺]i振蕩模式的顯著改變，其與胰島形狀的早期形態(tài)學(xué)改變平行(parallel)(圖1e、f和圖4b)。來自不同胰島的代表性[ca²⁺]i振蕩追蹤和組合的[ca²⁺]i振蕩追蹤的均值的每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件被示出(圖1f和圖4b)。我們也研究了自暴露于als血清、對照血清或fbs的完整胰島的胰島素分泌。來自在對照血清或正常fbs中孵育的胰島的葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌中不存在差異，而在als血清中孵育的胰島在葡萄糖應(yīng)答方面失敗(圖1g、h)。這些數(shù)據(jù)與在來自患有als和t2dm的患者的血清中負(fù)面地影響體內(nèi)β細(xì)胞功能和存活的循環(huán)因子一致。

為了進(jìn)一步深刻理解為與als相關(guān)聯(lián)的[ca²⁺]i處置的觀察到的改變的原因的分子機(jī)制，解離的小鼠胰島細(xì)胞用來自患有和不患有als的t2dm患者的血清孵育過夜。當(dāng)用25mmkcl去極化細(xì)胞時(shí)——這導(dǎo)致vgcc的打開，來自十二個(gè)als患者的血清與來自八個(gè)對照患者的血清相比誘導(dǎo)了顯著更高的[ca²⁺]i的瞬時(shí)增加(圖2a、b)。[ca²⁺]i的als血清誘導(dǎo)的超載可以導(dǎo)致ca²⁺依賴性β細(xì)胞破壞。細(xì)胞存活力測定確認(rèn)，與暴露于對照血清或正常fbs過夜的那些胰島細(xì)胞群相比，暴露于als患者血清的胰島細(xì)胞群中存在更高的毒性(圖2d)。為了鑒定vgcc參與[ca²⁺]i的瞬時(shí)增加，我們應(yīng)用了特定的ca²⁺通道阻斷劑。圖5a和5b示出了l型vgcc(硝苯地平敏感的)是負(fù)責(zé)在解離的小鼠胰島細(xì)胞中[ca²⁺]i增加的主要通道。顯示了每種特定阻斷劑的代表性的追蹤和總結(jié)的柱狀圖(圖5a、b)。接著，硝苯地平敏感的vgcc的活性使用全細(xì)胞膜片鉗配置研究(圖2c)。用來自als患者的血清處理的胰島細(xì)胞與用對照血清處理的胰島細(xì)胞相比展現(xiàn)了更大的ca²⁺電流。電流從-70mv的保持電位通過在-60和40mv之間的300ms電壓階躍引起(圖2c)。圖2c顯示了胰島細(xì)胞中硝苯地平敏感的vgcc的電流-電壓(i-v)關(guān)系，所述胰島細(xì)胞用來自兩個(gè)als患者和一個(gè)對照患者的血清孵育。用als血清孵育顯著地增加了全細(xì)胞ca²⁺電流，如通過從對照細(xì)胞和用als血清處理的細(xì)胞獲得的代表性的全細(xì)胞ca²⁺電流追蹤所顯示的(圖2c)。編輯的數(shù)據(jù)顯示與對照血清相比，als血清顯著地升高了在去極化-20mv下測量的全細(xì)胞ca²⁺電流密度(圖2c)。

為了澄清als血清的影響對分泌胰島素的胰腺β細(xì)胞特異性或者對胰島細(xì)胞具有更一般的影響的程度，我們測試了分泌胰高血糖素的小鼠胰腺α細(xì)胞系——αtc1-6細(xì)胞。也在這些細(xì)胞中，在k⁺誘導(dǎo)的去極化之后，als血清誘導(dǎo)的[ca²⁺]i增加，其比當(dāng)細(xì)胞暴露于對照血清時(shí)獲得的增加更顯著(圖2e、f)。在αtc1-6細(xì)胞中，硝苯地平敏感的vgcc是最豐富的ca²⁺通道——其是介導(dǎo)[ca²⁺]i增加的原因(補(bǔ)充圖2c和圖6b、c)。但是，由于αtc1-6細(xì)胞也具有相當(dāng)大數(shù)目的ω-美洲蜘蛛毒素tk(agtx)敏感的ca²⁺通道，即p/q型vgcc，所以這些也可以參與介導(dǎo)對[ca²⁺]i的影響。而且，與來自對照患者的血清相比，細(xì)胞毒素在用來自als患者的血清處理的αtc1-6細(xì)胞中是普遍的(圖2g和圖7a)。因此，取自患有t2dm的als患者的血清不僅影響分泌胰島素的β細(xì)胞，而且影響分泌胰高血糖素的α細(xì)胞，這證明更寬泛地干擾內(nèi)分泌胰腺中的激素分泌。由于胰島素和胰高血糖素二者在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，因此這些紊亂有可能在糖尿病發(fā)病機(jī)制中起主要作用。

正在尋找介導(dǎo)als血清中對胰島細(xì)胞[ca²⁺]i處置影響的循環(huán)成分，我們將興趣轉(zhuǎn)向igg。該免疫球蛋白自als血清和對照血清(圖6，泳道3和5)純化。來自sigma的人igg被用作陽性對照。血清igg和來自sigma的igg的所有制品在電泳中顯示了兩個(gè)主要的帶，一個(gè)是55kda重鏈和一個(gè)是26kda輕鏈。每個(gè)純化的血清igg樣本被凍干進(jìn)行富集，并被用于以100μgigg/ml的濃度處理解離的胰島細(xì)胞和αtc1-6細(xì)胞。在als-igg的存在下，與對照igg相比，在高k⁺暴露之后，在解離的胰島細(xì)胞(圖3a、b)和αtc1-6細(xì)胞(圖3e、f)二者中都存在更顯著的瞬時(shí)[ca²⁺]i增加。當(dāng)als-igg在96℃下煮沸30分鐘時(shí)，對[ca²⁺]i的影響減弱。而且，我們也檢查了als-igg的細(xì)胞毒性(圖3c、d、g)。暴露于als-igg的細(xì)胞與暴露于對照igg的細(xì)胞相比展示了較低的存活(圖3c、d、g)。

我們的發(fā)現(xiàn)因而表明了在als患者中報(bào)道的葡萄糖穩(wěn)態(tài)異常(10、29、30)通過在胰島細(xì)胞[ca²⁺]i處置中的功能缺陷來解釋，這是由于igg介導(dǎo)的vccs的激活和因而的胰島細(xì)胞死亡。

方法

胰島分離和胰島細(xì)胞培養(yǎng)

胰島通過標(biāo)準(zhǔn)的膠原酶消化來分離，隨后在rpmi1640培養(yǎng)基中在立體顯微鏡下仔細(xì)挑選。單細(xì)胞通過在無ca²⁺培養(yǎng)基中利用(gibco)振蕩胰島獲得，并且將其接種在玻璃蓋玻片上。胰島和單細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺和100u/100μg/ml青霉素/鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37℃下、在空氣中5％co2的加濕氣氛中維持。

患者的登記

患有散發(fā)als和t2dm的十二名患者和患有t2dm但是不患有als的患者被隨機(jī)地選擇。使用來自患者的血清的倫理批準(zhǔn)獲得自hanyanguniversityhospitalinseoul，korea(hyuh2006-04-001-004)。在獲得書面知情同意之后收集血液樣本。實(shí)際患者沒有已知的神經(jīng)肌肉疾病或消瘦(wasting)的家族史。診斷患有t2dm的所有對象利用降血糖劑很好地控制。

血清的制備和igg純化

來自患有t2dm的als患者和患有t2dm但是不患有als的對照對象的血清被收集，同樣地滅菌處理，并在-20℃下儲存直到使用。血清通過在56℃下孵育30min被熱滅活。細(xì)胞在補(bǔ)充有10％真實(shí)血清的rpmi1640培養(yǎng)基中孵育過夜。血清igg使用特定的凝膠基旋轉(zhuǎn)柱純化(gel-basedspincolumnpurification)(igg純化樹脂；pierce/thermofisherscientific)進(jìn)行純化。igg純化試劑盒基于包含專有配體的樹脂，該專有配體僅允許igg穿過。柱載體被用于除去非抗體血清蛋白并分離血清igg。簡單而言，將500μl稀釋的血清加入至根據(jù)制造商的指示準(zhǔn)備的微型旋轉(zhuǎn)柱，并且igg通過在3000g下離心洗脫。洗脫的餾分通過凍干器濃縮并在用于細(xì)胞上之前通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)測試。

[ca²⁺]i的測量

將附著至蓋玻片的胰島和單細(xì)胞用不同的患者血清預(yù)處理，并且然后在包含(以mm計(jì))125nacl、5.9kcl、2.56cacl2、1.2mgcl2、25hepes和3葡萄糖(ph7.4)的hepes緩沖溶液中在37℃下負(fù)載2μmfura-2/am持續(xù)30min。11mm的葡萄糖濃度被用于胰島刺激。在負(fù)載之后，玻璃蓋玻片上的胰島和細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至在37℃下維持的開放灌注室并且[ca²⁺]i測量為340/380nm比率。光源裝配有氙弧燈和集成的快門(lambdadg-4，sutter儀器公司)，并經(jīng)由液體光導(dǎo)連接至顯微鏡(olympusix71)。具有1x1的像素組合(binning)的16位灰度圖像每1秒(100到300ms范圍內(nèi)的曝光時(shí)間)用冷卻的em-ccd攝像機(jī)(imagemx2，hamamatsu)拍攝。攝像機(jī)和快門通過(moleculardevices)軟件控制，該軟件也被用于分析。具有明亮的[ca²⁺]i信號的細(xì)胞限定感興趣的區(qū)域(roi)。roi信號通過減去背景噪聲信號計(jì)算。

電生理學(xué)記錄

在不同的處理之后的小鼠胰島細(xì)胞經(jīng)歷利用epc-10膜片鉗放大器(hekaelektronik，lambrecht/pfalz，germany)的常規(guī)的全細(xì)胞膜片鉗分析。細(xì)胞在下列外用溶液中洗浴(以mm計(jì))：138nacl、10teacl、10cacl2、5.6kcl、1.2mgcl2、5hepes和3葡萄糖(ph7.4)。移液管溶液(pipettesolution)包含(以mm計(jì))150n-甲基-d-葡糖胺、125hcl、10egta、1.2mgcl2、3mg-atp和5hepes(ph7.15)。硼硅酸鹽玻璃電極(1.2mm外直徑，warnerinstrument)用垂直移液管拉頭(pc-10，narishige)拉出，并且當(dāng)充有移液管溶液時(shí)具有范圍在2和3mω之間的尖端電阻。所有記錄在室溫下進(jìn)行。全細(xì)胞ca²⁺電流的振幅通過細(xì)胞電容標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)的獲得和分析使用軟件程序(hekaelektronik)進(jìn)行。大部分的化學(xué)品訂購自sigma-aldrich，并且硝苯地平和ω-美洲蜘蛛毒素tk來自tocris。

葡萄糖耐量測試和胰島素釋放

對于葡萄糖耐量測試，在通宵禁食之后，利用d-葡萄糖溶液(2g/kg體重)腹膜內(nèi)注射小鼠。在葡萄糖注射之后的15、30、60和120min時(shí)從尾靜脈收集血液，然后使用血糖儀(accu-checkrochediagnostics)測定血糖水平。葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的測量利用經(jīng)歷通宵培養(yǎng)的分離的胰島進(jìn)行。十個(gè)胰島分批地合并(pool)并在補(bǔ)充有1mg/ml濃度的bsa的hepes緩沖液(ph7.4)中在37℃下孵育30min，該hepes緩沖液包含(以mm計(jì))125nacl、5.9kcl、1.2mgcl2、2.56cacl2和3或11葡萄糖。小心地抽吸上清液，并且使用小鼠胰島素elisa試劑盒(alpco)測定來自胰島的靜態(tài)胰島素分泌。

wst-1測定

細(xì)胞存活力在不同的實(shí)驗(yàn)條件下使用premix水可溶的四唑鹽(wst-1)細(xì)胞增殖測定系統(tǒng)(takarabioinc.)進(jìn)行評估。將細(xì)胞接種在96孔微量培養(yǎng)板中，并且在利用血清和純化igg的實(shí)驗(yàn)中分別培養(yǎng)12和24小時(shí)。隨后，將培養(yǎng)基替換為新鮮培養(yǎng)基與wst-1試劑的10:1溶液。將微量培養(yǎng)板在37℃下孵育4小時(shí)，然后通過在微量培養(yǎng)板讀出器中測量在450nm下的吸光度定量代謝活躍的活細(xì)胞。

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