相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)要求2015年9月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序號(hào)62/234,986的權(quán)益，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及作為造影劑用于磁共振成像的組合物和其使用方法。

發(fā)明背景

磁共振成像(mri)以高空間分辨率產(chǎn)生人解剖學(xué)和病理學(xué)的細(xì)膩描述。為了增加mri的診斷靈敏性和特異性，例如對(duì)于癌癥、感染、神經(jīng)學(xué)和心臟疾病的成像，在成像之前和/或期間經(jīng)常靜脈內(nèi)給予造影材料以改進(jìn)信號(hào)。

最常見(jiàn)的mri造影材料基于含有順磁金屬釓(gd)的分子絡(luò)合物。在美國(guó)，所有九種fda-批準(zhǔn)的mri造影劑均是基于gd的。gd具有強(qiáng)的"順磁性"，其導(dǎo)致t1-加權(quán)的圖像的mri信號(hào)局部增加。然而，基于gd的造影劑可導(dǎo)致罕見(jiàn)但嚴(yán)重虛弱的病況，稱為腎原性系統(tǒng)纖維化(nsf)，一種涉及皮膚、關(guān)節(jié)、眼睛和內(nèi)部器官的廣泛纖維化的綜合征。who和fda已經(jīng)發(fā)布了對(duì)在患有腎機(jī)能不全/衰竭的患者中使用這些試劑的限制，其中fda規(guī)定在所有市售的含釓介質(zhì)上的"黑箱"警告。結(jié)果，在美國(guó)數(shù)百萬(wàn)的患者，和在世界范圍內(nèi)的更多患者不再能夠接受用于mri的造影材料，嚴(yán)重限制了對(duì)于數(shù)種疾病的檢測(cè)和表征。

較少見(jiàn)地作為調(diào)查研究或“無(wú)標(biāo)簽(off-label)”使用的其它順磁絡(luò)合物，通常基于作為靜脈內(nèi)鐵代替療法開(kāi)發(fā)和上市的大的氧化鐵基納米顆粒(例如，feraheme?(ferumoxytol)注射液)。然而，因?yàn)樗鼈兇蟮姆肿映叽?這限制這些試劑在血庫(kù)中直至它們最終被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(即，巨噬細(xì)胞、肝、脾)清除)，這些絡(luò)合物用于mri受到限制。

vanzijl等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2014/0154185論述了胃腸外葡萄糖增強(qiáng)mri的用途。亦參見(jiàn)yadavnn,xuj,bar-shira,qinq,chankw,grgack,liw,mcmahonmt,vanzijlpc,naturald-glucoseasabiodegradablemricontrastagentfordetectingcancer.magnresonmed.2012dec;68(6):1764-73;yadavnn,xuj,bar-shira,qinq,chankw,grgack,liw,mcmahonmt,vanzijlpc,naturald-glucoseasabiodegradablemrirelaxationagent.magnresonmed.2014sept;72(3):823-28。

對(duì)于可用于mri掃描技術(shù)的備選造影劑仍有需要。

發(fā)明概述

本文提供了使用胃腸外抗壞血酸(維生素c)作為造影劑用于磁共振成像(mri)，以在人和非人組織中檢測(cè)和表征灌注、代謝和氧化應(yīng)激，而不需要放射性或化學(xué)標(biāo)記的方法。在胃腸外給予后，在吸收抗壞血酸和/或抗壞血酸通過(guò)的組織中檢測(cè)時(shí)間依賴性的磁共振(mr)信號(hào)變化。這些mri信號(hào)變化可使用常規(guī)的基于自旋回波或梯度回波的t2-加權(quán)的mri序列檢測(cè)，和可使用t2映射定量。對(duì)自旋-自旋弛豫敏感的其它較不常見(jiàn)的采集技術(shù)也可用于編碼mr信號(hào)。

因此，本文提供了增強(qiáng)受試者的身體或身體區(qū)域例如器官或器官區(qū)域的mri圖像的方法，所述方法包括以mri圖像增強(qiáng)量胃腸外給予(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、骨內(nèi)或鞘內(nèi)給予)所述受試者抗壞血酸或其藥學(xué)上可接受的鹽；和然后通過(guò)受試者的mri產(chǎn)生所述身體或身體區(qū)域的圖像，從而抗壞血酸或其藥學(xué)上可接受的鹽增強(qiáng)mri圖像。

在一些實(shí)施方案中，在胃腸外給予抗壞血酸或其藥學(xué)上可接受的鹽期間，或其之后至多5、10、30、40、60、90或120分鐘，產(chǎn)生mri圖像。

在一些實(shí)施方案中，抗壞血酸或其藥學(xué)上可接受的鹽是抗壞血酸鈉、抗壞血酸葡甲胺或其混合物(例如，從10:90、20:80、30:70或40:60直至90:10、80:20、70:30或60:40的摩爾或毫摩爾(mm)比(抗壞血酸葡甲胺:抗壞血酸鈉)的抗壞血酸葡甲胺和抗壞血酸鈉)。

還提供了抗壞血酸或其藥學(xué)上可接受的鹽用于進(jìn)行如本文所教導(dǎo)的方法，或用于制備進(jìn)行如本文所教導(dǎo)的方法的藥物或成像劑的用途。

在本文的附圖和下文所示的說(shuō)明書(shū)中更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。本文引用的所有美國(guó)專(zhuān)利參考文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.抗壞血酸和抗壞血酸基團(tuán)的歧化。a,抗壞血酸是一種二酸，然而在ph7.4下，99%作為單價(jià)陰離子(asch^-)存在?？箟难峄鶊F(tuán)(asc^.-)在平衡時(shí)(而且還在低得多的濃度下)以抗壞血酸的氧化和還原形式存在。b,asc^.-的歧化是其主要轉(zhuǎn)化途徑，其中速率常數(shù)(kobs)落入nmr時(shí)間量程的"中間"質(zhì)子交換速率內(nèi)。在存在磷酸鹽的情況下該速率常數(shù)可增加10倍(borsw,buettnergr.(1997)thevitamincradicalanditsreactionsinvitamincinhealthanddisease,l.packer和j.fuchs編輯,marceldekker,inc.,newyork,第4章,第75-94頁(yè))。

圖2.糖、糖醇和抗壞血酸的t2弛豫性(r2=mm^-1sec^-1)。比較包括單糖和二糖兩者。如文中所述，注意，認(rèn)為在較高濃度下減少對(duì)比效果續(xù)發(fā)于類(lèi)似部分的自締合和質(zhì)子交換減少。

圖3.抗壞血酸自旋-自旋弛豫(t2-加權(quán)的)mri對(duì)比的體外("仿體(phantom)")實(shí)驗(yàn)。a,顯示在抗壞血酸濃度逐漸增加的5個(gè)仿體中的定量t2映射。與常規(guī)快速自旋回波(fse)采集的對(duì)照(磷酸鹽緩沖鹽水)相比，低至1-5mm見(jiàn)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的"負(fù)t2對(duì)比"(信號(hào)丟失)。因此，在高吸收組織中藥理學(xué)劑量的抗壞血酸后(例如，腫瘤和腦，10-30mm)，靈敏性在預(yù)期組織/細(xì)胞濃度的較低端。這也不包括來(lái)自組織氧化底物或交換催化劑的任何協(xié)同效果。b,顯示h2o2對(duì)抗壞血酸t(yī)2增強(qiáng)的協(xié)同效果。h2o2，其在胃腸外抗壞血酸后在腦和腫瘤中體內(nèi)升高至100-200微摩爾，對(duì)來(lái)自抗壞血酸的t2對(duì)比效果產(chǎn)生顯著的協(xié)同作用。如上所述，在30min內(nèi)在仿體中，該協(xié)同效果隨時(shí)間緩慢減少，但將在體內(nèi)持續(xù)，只要在藥理學(xué)抗壞血酸劑量后產(chǎn)生h2o2。c,證實(shí)了ph對(duì)抗壞血酸的t2效果的影響，其在中性/生理ph(7.0-7.4)達(dá)到最大。該結(jié)果與關(guān)于在平衡時(shí)以其基團(tuán)形式和氧化形式的抗壞血酸歧化作用(disproportionation)的速率動(dòng)力學(xué)的現(xiàn)有研究一致(圖1)。d,顯示當(dāng)抗壞血酸與葡甲胺成鹽(鹽化)時(shí)顯著的協(xié)同效果，葡甲胺為山梨糖醇(sorbital)的胺糖衍生物，山梨糖醇通常用作數(shù)種fda-批準(zhǔn)的藥物和造影制劑的賦形劑。

圖4.抗壞血酸作為na或葡甲胺鹽的比較。用生理濃度的po4(2mm)和hco3^-(25mm)緩沖液制備溶液。

圖5.抗壞血酸鈉+生理交換催化劑。各溶液在去離子水中設(shè)定為中性(ph=7.0)。生理交換催化劑的濃度與體內(nèi)在血清和細(xì)胞外空間中相同：po4=2mm，葡萄糖=5mm，和hco3^-為25mm。

圖6.在抗壞血酸鈉/葡甲胺和葡萄糖之間的交換協(xié)同作用。溶液在生理緩沖液po4(2mm)和hco3^-(25mm)的情況下進(jìn)行比較，所述生理緩沖液還作為交換催化劑起作用。

圖7.naasc/葡甲胺與糖醇、單糖和二糖的交換協(xié)同作用。在2mmpo4和25mmhco3^-的共存在下制備所有溶液。

圖8.對(duì)于naasc/葡甲胺與糖醇、單糖和二糖的交換協(xié)同作用，在沒(méi)有對(duì)照的情況下重標(biāo)數(shù)據(jù)。所有溶液用2mmpo4和25mmhco3^-制備。

圖9.在高劑量胃腸外抗壞血酸(2g/kg,右ijiv注射)后體內(nèi)抗壞血酸t(yī)2對(duì)比變化。a,顯示通過(guò)正常c57黑小鼠的中腦的常規(guī)單切片軸fset2wi圖像，和右側(cè)的兩個(gè)圖像證實(shí)在抗壞血酸靜脈內(nèi)給予期間和之后對(duì)比變化的“第一遍(firstpass)”提取。在給予抗壞血酸后立即，和其后10分鐘，獲得在腦組織中的t2信號(hào)，然后從在抗壞血酸給予之前獲得的t2腦信號(hào)中減去。因?yàn)榭箟难岙a(chǎn)生信號(hào)強(qiáng)度降低，從投配前掃描的較高信號(hào)減去導(dǎo)致通過(guò)腦組織的流通灌注(血流)的凈正“映射”。在10分鐘時(shí)，灌注效果已幾乎消退(resolved)，和開(kāi)始觀察到與組織吸收相關(guān)的早期信號(hào)強(qiáng)度變化。b,顯示由于高劑量抗壞血酸的組織吸收導(dǎo)致的信號(hào)變化。信號(hào)強(qiáng)度的顏色封泥(color-lute)映射未從投配前掃描中減去，因此顯示t2信號(hào)隨時(shí)間的預(yù)期降低，在正常c57小鼠中在30-60min之間達(dá)到最大。

圖10.在新皮質(zhì)擴(kuò)散性抑制的嚙齒動(dòng)物模型中的抗壞血酸t(yī)2增強(qiáng)。在圖示的實(shí)驗(yàn)中，下排圖像顯示用在高濃度的kcl中浸濕的明膠海綿(紅色箭頭)的微型顱骨切除術(shù)，所述明膠海綿局部擴(kuò)散至附近的頂葉皮層。顱骨切除術(shù)部位是前囪后1mm，前囪是代表下面大腦后的三分之一的顱骨界標(biāo)。上兩排表示在嚙齒動(dòng)物腦中在前囪前3和4mm(即是說(shuō)遠(yuǎn)離sd誘導(dǎo)部位)的t2圖像和信號(hào)變化的定量顏色封泥t2映射。前切片的t2信號(hào)變化顯示與左側(cè)相比，在右側(cè)大腦皮層中清楚的t2不對(duì)稱性(再次，sd仍被限制在右半球)。這些顯著的皮層信號(hào)變化與sd發(fā)生的已知代謝增進(jìn)活性一致，如用¹⁸f-fdgpet，以及用直接微量滲析和代謝組學(xué)測(cè)定也觀察到的。注意到，在顱骨切除術(shù)部位本身下直接觀察到相反的觀察結(jié)果(病灶t2信號(hào)增加)(第三排)，這與在kcl灌注部位的局部浮腫(游離水增加)一致。

圖11.用胃腸外抗壞血酸的灌注和存活性心臟成像。圖11a描述對(duì)于在7t下大鼠心臟成像的兩個(gè)主要的成像面，冠和軸。圖11b顯示初始推注靜脈內(nèi)注射的抗壞血酸的整個(gè)左心室的t2信號(hào)強(qiáng)度的短暫降低。

圖12.靜脈內(nèi)給予三種不同的抗壞血酸制劑后豚鼠中的t2對(duì)比變化。圖12a,60min緩慢灌注抗壞血酸之前和之后的快速自旋回波(fse)t2圖像顯示整個(gè)腦實(shí)質(zhì)中明顯的信號(hào)強(qiáng)度差異。圖12b-c顯示和c,顯示在給予三種不同的抗壞血酸制劑后，對(duì)于豚鼠大腦皮層(cx)和基底神經(jīng)節(jié)(bg)兩者的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度變化和定量的弛豫性測(cè)量。

優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述

一般來(lái)說(shuō)，為研究或獸醫(yī)目的，本發(fā)明的受試者是哺乳動(dòng)物受試者，包括人受試者和動(dòng)物受試者兩者(例如，狗、貓、兔、牛、馬等)。受試者可以是雄性或雌性的，和可以是任何年齡，包括新生兒、嬰兒、少年、青年、成年和老年受試者。

磁共振成像(mri)是已知的，和可通過(guò)市售可得的設(shè)備，和通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行。參見(jiàn)例如s.bushong和g.clarke,magneticresonanceimaging:physicalandbiologicalprinciples(mosby,第4版2014)。在一些實(shí)施方案中，mri是灌注(例如，血流)成像。在一些實(shí)施方案中，mri是代謝成像。代謝成像可用作類(lèi)似于18ffdgpet的診斷生物標(biāo)記，包括但不限于，證實(shí)代謝增進(jìn)或代謝減退的腫瘤或功能異常組織的鑒定/表征。

如本文所教導(dǎo)的，可用mri成像的"身體或身體區(qū)域"包括受試者的身體或身體的任何區(qū)域，例如器官或器官系統(tǒng)、軟組織、骨等，或其任何部分。身體區(qū)域的實(shí)例包括但不限于頭、頸、胸、腹、骨盆、肢、肌肉、脂肪、其它軟組織、骨等。器官的實(shí)例包括但不限于腎上腺、腦垂體、胸腺、黃體、視網(wǎng)膜、腦、脾、肺、睪丸、淋巴結(jié)、肝、甲狀腺、小腸粘膜、白細(xì)胞、胰腺、腎、唾液腺組織、心臟等。

如本文所用的，"增強(qiáng)"mri圖像包括通過(guò)增強(qiáng)在mri信號(hào)中的結(jié)構(gòu)或流體的對(duì)比，促進(jìn)mri顯像。

"mri造影劑"是在mri掃描期間可增強(qiáng)身體內(nèi)結(jié)構(gòu)或流體的對(duì)比的物質(zhì)。實(shí)例包括但不限于，順磁造影劑例如含釓(iii)試劑或錳螯合劑，和超順磁試劑，例如鐵鉑顆粒。亦參見(jiàn)axelsson等的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2014/0350193；lin等的2014/0234210。

如本文所用的，"胃腸外給予"包括但不限于，靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、骨內(nèi)或鞘內(nèi)給予，例如，通過(guò)注射或灌注。作為非限制性實(shí)例，在靜脈內(nèi)(i.v.)途徑對(duì)受試者而言是困難(例如，低血壓)的情況下可使用腹膜內(nèi)或其它胃腸外給予，或該給予途徑另外可產(chǎn)生合適的mri圖像。

造影介質(zhì)的mr成像和臨床應(yīng)用。臨床磁共振成像(mri)通過(guò)從組織中的水和大分子獲得質(zhì)子(¹h)nmr信號(hào)，產(chǎn)生身體的高分辨率圖像。對(duì)于"t1-加權(quán)的"mr圖像，信號(hào)強(qiáng)度在其中縱向弛豫率(自旋晶格弛豫率，1/t1)增加的區(qū)域中增加。以"t2-加權(quán)的"mri，當(dāng)橫向弛豫率(自旋-自旋弛豫率，1/t2)增加時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度減少。事實(shí)上在所有臨床mri研究中，常規(guī)地獲得t1和t2加權(quán)的圖像二者。

在mri中常規(guī)給予靜脈內(nèi)造影劑以進(jìn)一步增加1/t1或1/t2，試圖更好地描繪患病組織與正常組織，改進(jìn)解剖學(xué)清晰度(definition)，和增強(qiáng)生理或病理功能的表征。幾乎所有目前批準(zhǔn)的mri造影劑基于鑭系元素金屬釓(gd)的螯合劑，其中較小亞組的血管造影和灌注研究使用無(wú)標(biāo)簽的氧化鐵材料(例如，feraheme)在患有腎機(jī)能不全/衰竭的患者中進(jìn)行。最通常使用市售的基于gd的材料以增加患病組織的1/t1，其中造影材料傾向于積聚。

對(duì)于用mri進(jìn)行組織灌注測(cè)定，可使用基于gd的試劑或氧化鐵納米顆粒，其中采集策略基于1/t1或1/t2對(duì)比，盡管越來(lái)越偏愛(ài)1/t2對(duì)比方法。灌注成像目前在臨床上用于表征腫瘤侵襲性、腫瘤對(duì)療法的反應(yīng)，和在心臟、腦和其它器官中的組織存活性。

抗壞血酸。抗壞血酸("l-抗壞血酸"、"抗壞血酸"、"維生素c")是天然存在的有機(jī)化合物和必需營(yíng)養(yǎng)素，具有作為抗氧化劑和在至少8種酶促反應(yīng)中的輔助因子的重要性質(zhì)，所述酶促反應(yīng)包括幾種膠原合成反應(yīng)，當(dāng)其功能異常時(shí)，導(dǎo)致最顯著的壞血病癥狀。大部分哺乳動(dòng)物在肝中合成抗壞血酸，其中酶l-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為抗壞血酸。然而，在人、高等靈長(zhǎng)類(lèi)、豚鼠和大部分蝙蝠中，突變導(dǎo)致低或缺少的l-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶表達(dá)，使得抗壞血酸必須在飲食中補(bǔ)充(lachapelle,m.y.;drouin,g.(2010)."inactivationdatesofthehumanandguineapigvitamincgenes".genetica139(2):199–207)。在所有動(dòng)物種類(lèi)中，l-抗壞血酸/抗壞血酸是最豐富的細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，在腫瘤、腦細(xì)胞和一些其它組織中其細(xì)胞內(nèi)濃度能夠達(dá)到10-30mm。積聚超過(guò)100倍血漿中維生素c水平的那些組織包括腎上腺、腦垂體、胸腺、黃體和視網(wǎng)膜。具有10-50倍濃度的那些包括腦、脾、肺、睪丸、淋巴結(jié)、肝、甲狀腺、小腸粘膜、白細(xì)胞、胰腺、腎和唾液腺(hedigerma(may2002)."newviewatc".nat.med.8(5):445–6)。

飲食過(guò)量的維生素c不被吸收，和血液中的過(guò)量維生素c被快速在尿中排泄。維生素c顯示顯著低的毒性，通過(guò)強(qiáng)飼在大鼠中公認(rèn)的ld50為約11.9克/千克體重。這樣的劑量(體重的1.2%，或?qū)τ?0kg人而言為0.84kg)的死亡機(jī)制是未知的，但可能是機(jī)械性的，而非化學(xué)性的("safety(msds)dataforascorbicacid".oxforduniversity.october9,2005.retrievedfebruary21,2007)。鑒于缺少任何意外或有意的中毒死亡數(shù)據(jù)，在人中的ld50是不確定的。因此，大鼠ld50用作人毒性的指導(dǎo)。

在生理ph下，99%的抗壞血酸作為單價(jià)陰離子存在(圖1a)。維生素c的化學(xué)性質(zhì)，和因此成像性質(zhì)，受該部分支配。作為供體抗氧化劑，單價(jià)陰離子提供氫原子(h^.或h⁺+e^-)至氧化基團(tuán)，以產(chǎn)生共振穩(wěn)定的三羰基抗壞血酸自由基asc^.-(圖1b)?；氐竭€原或氧化抗壞血酸的asc^.-的歧化反應(yīng)(圖1c)是主要體外清除途徑。該過(guò)程在體內(nèi)通過(guò)有助于抗壞血酸再循環(huán)的酶進(jìn)行補(bǔ)充(mayjm,quzc,neeldr,lix(may2003)."recyclingofvitamincfromitsoxidizedformsbyhumanendothelialcells".biochim.biophys.acta1640(2–3):153–61)。該基團(tuán)歧化為抗壞血酸或脫氫抗壞血酸通過(guò)丟失或獲得氫發(fā)生，所述氫用作電子載體或較常規(guī)的陽(yáng)離子。此外，抗壞血酸基團(tuán)歧化的速率常數(shù)為10⁵-10⁶m^-1s^-1，使得伴隨歧化的氫交換也以相同速率發(fā)生。在nmr時(shí)間量程上，這些"中間"交換速率對(duì)于改變¹h自旋-自旋弛豫是最佳的。

抗壞血酸運(yùn)輸和排泄。抗壞血酸在體內(nèi)通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸和簡(jiǎn)單擴(kuò)散二者被吸收。兩種主要的主動(dòng)運(yùn)輸途徑是抗壞血酸鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(svct)和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(glut)。svct1和svct2跨質(zhì)膜輸入還原形式的抗壞血酸(savinii,rossia,pierroc,aviglianol,catanimv(april2008)."svct1和svct2:keyproteinsforvitamincuptake".aminoacids34(3):347–55)，而glut1和glut3葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體傳遞氧化形式脫氫抗壞血酸(rumseysc,kwono,xugw,burantcf,simpsoni,levinem(july1997)."glucosetransporterisoformsglut1andglut3transportdehydroascorbicacid".j.biol.chem.272(30):18982–9)。盡管脫氫抗壞血酸濃度在正常條件下在血漿中低，但與還原形式經(jīng)過(guò)svct相比，氧化的分子以高得多的速率經(jīng)過(guò)glut1和3被吸收。當(dāng)抗壞血酸濃度在藥理學(xué)上升高時(shí)，脫氫抗壞血酸濃度也增加，在glut轉(zhuǎn)運(yùn)體以高拷貝存在于例如腦(和血腦屏障)和腫瘤細(xì)胞中的情況下使顯著吸收成為可能。一旦運(yùn)輸，脫氫抗壞血酸被快速還原回到抗壞血酸。

超過(guò)腎再吸收閾值的抗壞血酸濃度自由進(jìn)入尿中，和以約30分鐘的半衰期排泄。在高飲食劑量下(在人中對(duì)應(yīng)于數(shù)百mg/天)，腎再吸收閾值在男性中是1.5mg/dl和在女性中是1.3mg/dl(oreopoulosdg,lindemanrd,vanderjagtdj,tzamaloukasah,bhagavanhn,garrypj(october1993)."renalexcretionofascorbicacid:effectofageandsex".jamcollnutr12(5):537–42)。不直接排泄在尿中或被其它身體代謝破壞的抗壞血酸被l-抗壞血酸氧化酶氧化和除去。

不希望受理論的束縛，在沒(méi)有順磁性的情況下抗壞血酸信號(hào)變化機(jī)制，其也被稱為"t2-加權(quán)的對(duì)比"，基于水質(zhì)子(¹h)自旋-自旋弛豫率1/t2(或者倒數(shù)地，自旋-自旋弛豫時(shí)間，t2)的增強(qiáng)，因?yàn)槿軇┧|(zhì)子與抗壞血酸分子上的羥基質(zhì)子交換。質(zhì)子交換對(duì)t2對(duì)比的影響通過(guò)在生理ph下抗壞血酸基團(tuán)的歧化反應(yīng)被進(jìn)一步放大?？箟难嵫趸涂箟难峄鶊F(tuán)歧化繼而受氧化底物例如過(guò)氧化氫(h2o2)和/或氫("質(zhì)子")交換催化劑的共存驅(qū)動(dòng)。

抗壞血酸，特別是在自旋-自旋交換催化劑(例如，簡(jiǎn)單糖、糖醇或氨基酸)的存在下并與其共配制，是一種安全和可生物降解的mri造影劑，其不需要使用基于金屬(例如，釓或鐵)的造影材料，也不需要電離輻射。該技術(shù)能夠評(píng)估組織灌注以及高分辨率分子表征組織存活性和代謝，這類(lèi)似于¹⁸f-fdgpet。后者可以通過(guò)吸收¹⁸f-fdg的相同葡萄糖運(yùn)輸機(jī)制(即，glut1和3轉(zhuǎn)運(yùn)體)，借助抗壞血酸的吸收(通過(guò)脫氫抗壞血酸)進(jìn)入細(xì)胞(rumseysc,kwono,xugw,burantcf,simpsoni,levinem(july1997)."glucosetransporterisoformsglut1andglut3transportdehydroascorbicacid".j.biol.chem.272(30):18982–9)。

抗壞血酸mri的潛在應(yīng)用包括若干臨床情況，其中pet掃描已經(jīng)證實(shí)有價(jià)值，并且其中方法改進(jìn)將得到進(jìn)一步的臨床益處。這些情況包括用于癌癥、神經(jīng)學(xué)疾病(例如，癡呆、tbi和癲癇)和心血管成像的診斷研究。使用tc99m-標(biāo)記的試劑(例如，tc-99msestimibi或"cardiolite")的心臟研究代表了一種特別值得注意的診斷應(yīng)用，鑒于在接下來(lái)3-5年期間世界上tc-99m供應(yīng)的預(yù)期收縮而迫切需要備選策略。用tc-99m-相關(guān)試劑的心肌灌注和存活性成像是一種必需和廣泛進(jìn)行的程序，尚未提供經(jīng)濟(jì)可行的解決方案來(lái)代替這些tc-99m-依賴性試劑。

使用高劑量胃腸外抗壞血酸作為對(duì)于數(shù)種惡性腫瘤的輔助化學(xué)療法，是研究該維生素的正進(jìn)行的臨床癌癥試驗(yàn)的主題。如本文所教導(dǎo)的，抗壞血酸mri可因此用于指導(dǎo)該化學(xué)療法的研究和應(yīng)用，結(jié)合高分辨率mr成像至治療給予，將能夠?qū)崟r(shí)優(yōu)化遞送和腫瘤反應(yīng)評(píng)估。

現(xiàn)在理解，抗壞血酸具有類(lèi)似于萬(wàn)古霉素的藥代動(dòng)力學(xué)特征?？诜箟难岬纳锓植荚趪?yán)密控制下，血漿濃度很少超過(guò)200μm，甚至在口服劑量超過(guò)100倍的建議每日容許量時(shí)(levinem,conry-cantilenac,wangy,welchrw,washkopw,dhariwalkr,parkjb,lazareva,graumlichjf,kingj,cantilenalr(april1996)."vitamincpharmacokineticsinhealthyvolunteers:evidenceforarecommendeddietaryallowance".proc.natl.acad.sci.u.s.a.93(8):3704–9)。然而，抗壞血酸靜脈內(nèi)給予繞過(guò)這些嚴(yán)密控制系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)10mm或更高的血漿濃度。高于10mm的血漿濃度在人中安全地持續(xù)至多4小時(shí)，具有顯著低的毒性(hofferlj.,levinem.,assoulines.,melnychukd.,padayattysj.,rosadiukk.,rousseauc.,robitaillel.,和millerwh.,jr.,phaseiclinicaltrialofi.v.ascorbicacidinadvancedmalignancy.annoncol19:1969–1974,2008)。

最近的研究表明，通過(guò)靜脈內(nèi)灌注實(shí)現(xiàn)的藥理學(xué)抗壞血酸濃度導(dǎo)致形成抗壞血酸基團(tuán)和產(chǎn)生對(duì)癌癥細(xì)胞而非正常細(xì)胞有細(xì)胞毒性的濃度的過(guò)氧化氫(h2o2)(chenq.,espeymg.,sunay.,pooputc.,kirkkl.,krishnamc.,khoshdb.,driskoj.,和levinem.pharmacologicdosesofascorbateactasaprooxidantanddecreasegrowthofaggressivetumorxenograftsinmice.procnatlacadsciusa105:11105–11109,2008)。若干臨床前異種移植研究證實(shí)用高劑量胃腸外抗壞血酸的顯著生長(zhǎng)抑制，和甚至最近的臨床試驗(yàn)同樣顯示有前景的結(jié)果，其也證實(shí)了優(yōu)秀的安全性特征。在臨床前機(jī)制研究中，h2o2的產(chǎn)生是一個(gè)突出的特征。微量滲析測(cè)量揭示，在高劑量胃腸外抗壞血酸后h2o2濃度升高至>100sμm，其中在腫瘤和腦區(qū)域例如紋狀體中抗壞血酸和h2o2二者均達(dá)到它們的最高濃度(chenq.,espeymg.,sunay.,pooputc.,kirkkl.,krishnamc.,khoshdb.,driskoj.,和levinem.pharmacologicdosesofascorbateactasaprooxidantanddecreasegrowthofaggressivetumorxenograftsinmice.procnatlacadsciusa105:11105–11109,2008)。

作為可用于實(shí)施本發(fā)明的胃腸外給予制劑的在藥學(xué)上可接受的載體(例如，無(wú)菌水或鹽水)中的抗壞血酸是已知的，例如用于治療壞血病。合適的制劑的實(shí)例包括但不限于，抗壞血酸在注射用水中的無(wú)菌溶液，其中每毫升水含有：抗壞血酸500mg、乙二胺四乙酸二鈉0.25mg、氫氧化鈉110mg，在適量注射用水中，ph(范圍5.5-7.0)用碳酸氫鈉和氫氧化鈉調(diào)節(jié)。適合于胃腸外給予的制劑可包括抗壞血酸的藥學(xué)上可接受的鹽(例如，鈉鹽或葡甲胺鹽)，例如其無(wú)菌溶液，和還可包括ph緩沖液，例如碳酸氫鹽(hco3^-)和/或磷酸鹽(po4)。

如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"意指根據(jù)疾病的嚴(yán)重性和治療的必要性，化合物或組合物適合給予受試者以實(shí)現(xiàn)文中所述的治療，而沒(méi)有過(guò)度有害副作用。

在以下非限制性實(shí)施例中更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。

體外實(shí)施例

自旋-自旋弛豫率1/t2的抗壞血酸增強(qiáng)

之前的研究報(bào)道了自主體水質(zhì)子與低分子量溶質(zhì)和大分子的可移動(dòng)質(zhì)子(例如，-nh2,-oh,-sh,-nh)的交換產(chǎn)生的t2-加權(quán)的nmr/mri對(duì)比影響。來(lái)自這種質(zhì)子交換的1/t2的對(duì)比影響描述如下：

主體水與a有關(guān)和可交換質(zhì)子(例如，來(lái)自抗壞血酸oh基團(tuán))與b有關(guān)。是具有5個(gè)參數(shù)的封閉函數(shù)，自carver和richards推導(dǎo)，和由hill等精修(carver,j.p.;richards,r.e.j.general2-sitesolutionforchemicalexchangeproduceddependenceoft2uponcarr-purcellpulseseparationj.magn.reson.1972,6,89–105;hills,b.p.;wright,k.m.;belton,p.s.n.m.r.studiesofwaterprotonrelaxationinsephadexbeadsuspensionsmol.phys.1989,67,1309–1326)。對(duì)于抗壞血酸的羥基質(zhì)子，是可交換質(zhì)子的分?jǐn)?shù)，是可交換質(zhì)子和水質(zhì)子之間的交換速率，是羥基和主體水質(zhì)子之間的化學(xué)位移，和是羥基質(zhì)子的局部自旋-自旋弛豫時(shí)間。τ是t2-加權(quán)的采集序列的脈沖間(90^o-180^o)間隔。

影響t2對(duì)比的質(zhì)子交換的必需但經(jīng)常被忽視的參數(shù)是交換催化的作用(liepinshe和otting,gprotonexchangeratesfromaminoacidsidechains–implicationsforimagecontrast.magnresonmed.199635(1):30-42)。oh或nh基團(tuán)和水之間的質(zhì)子交換的速率常數(shù)k可描述如下：

ka、kb和kc分別表示由于h⁺、oh^-和其它交換催化劑的催化導(dǎo)致的交換速率常數(shù)。指數(shù)y是1或2，取決于給定的交換催化劑的機(jī)制。速率常數(shù)ka和kb可繼而計(jì)算如下：

其中kd是質(zhì)子供體和受體的擴(kuò)散控制碰撞的速率常數(shù)(~10¹⁰mol^-1s^-1)，和pkd和pka是質(zhì)子供體和受體的pk值。盡管pkh3o+和pkoh-=15.7，但kc對(duì)于預(yù)測(cè)是更有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)橘|(zhì)子傳遞對(duì)催化劑濃度的非線性依賴。然而，以在pkd-pka之間的至少中等差異和在生理ph下顯著濃度的催化活性的酸或堿形式的交換催化劑，達(dá)到在中性ph下有效的交換催化。

因此h2o，盡管其高濃度，在中性ph下是無(wú)效的交換催化劑，因?yàn)槠涫窍鄬?duì)差的質(zhì)子供體，其pkd和pka(對(duì)于h3o⁺和oh^-)是15.7。另一方面，在生理?xiàng)l件下公認(rèn)的交換催化劑包括有機(jī)磷酸鹽、碳酸鹽(例如，碳酸氫鹽，hco3^-)，和具有羧基和氨基的分子(liepinshe和otting,gprotonexchangeratesfromaminoacidsidechains–implicationsforimagecontrast.magnresonmed.199635(1):30-42)。如下所示，之前未公認(rèn)的另一種有效的催化劑是抗壞血酸，其在4處具有一個(gè)羥基，具有有利的pka=6.75，以及平衡時(shí)pka=7.0的歧化反應(yīng)。因此，抗壞血酸具有不僅“自催化”的潛力，而且應(yīng)該是一種對(duì)于糖和其它大分子上的堿性羥基的質(zhì)子交換的有效催化劑。

圖2顯示ph7下數(shù)種糖、糖醇和抗壞血酸在去離子水中的純?nèi)芤旱膖2增強(qiáng)的比較。在7t下使用至少6個(gè)不同的回波時(shí)間的rarefse方案，自定量的t2映射提供數(shù)據(jù)，溶質(zhì)濃度為10和20mm。如所示的，t2弛豫性大致是各分子上可獲得的可交換的oh質(zhì)子數(shù)的函數(shù)，其中如預(yù)測(cè)的，二糖產(chǎn)生比單糖按比例更大的對(duì)比效果。應(yīng)注意的是對(duì)溶質(zhì)濃度的非線性依賴，其中弛豫性增強(qiáng)隨濃度增加而降低，該現(xiàn)象可能與在純?nèi)芤褐刑堑淖跃喓嫌嘘P(guān)。后者特別與下文所述的觀察結(jié)果有關(guān)，其中當(dāng)抗壞血酸和糖以較高的總?cè)苜|(zhì)濃度組合在一起時(shí)，總體t2效果反而協(xié)同增強(qiáng)。組合抗壞血酸與單糖或二糖的制劑提供遞送較高濃度的兩種物質(zhì)的方法以增加mr成像的t2對(duì)比效果。

圖3a描述了在中性ph下不同濃度的純的抗壞血酸溶液的t2效果的更詳細(xì)的論證。圖3b顯示，當(dāng)抗壞血酸在存在僅μm(即，生理)濃度的過(guò)氧化氫(h2o2)的情況下t2效果顯著增強(qiáng)，所述濃度的過(guò)氧化氫驅(qū)動(dòng)氧化成脫氫抗壞血酸的反應(yīng)以及抗壞血酸基團(tuán)歧化。盡管h2o2也被認(rèn)為本身是交換催化劑，但當(dāng)h2o2以抗壞血酸濃度的1/100存在時(shí)對(duì)抗壞血酸-介導(dǎo)的1/t2增強(qiáng)觀察到的顯著效果，表明自h2o2驅(qū)動(dòng)的抗壞血酸氧化/歧化的質(zhì)子交換，而不是自oh抗壞血酸基質(zhì)子的直接交換，是負(fù)責(zé)t2變化的重要的貢獻(xiàn)機(jī)制。自脫氫抗壞血酸氧化/歧化對(duì)質(zhì)子交換的貢獻(xiàn)的進(jìn)一步的證據(jù)描述于圖3c，表明1/t2增強(qiáng)效果在中性ph下到目前為止是最顯著的，其中抗壞血酸-脫氫抗壞血酸歧化的反應(yīng)速率也是最大的。

圖3d的數(shù)據(jù)首次表明，具有合適的pk的在抗壞血酸和受體/供體分子之間的交換催化可顯著驅(qū)動(dòng)1/t2增強(qiáng)變化。此處的數(shù)據(jù)比較了抗壞血酸作為鈉鹽和葡甲胺(氨基糖)鹽的溶液。此處，在水中在中性ph下，與單獨(dú)的葡甲胺或抗壞血酸相比，抗壞血酸葡甲胺的t2對(duì)比效果(t2弛豫，ms)大約為4倍。

接著研究了葡甲胺與抗壞血酸的顯著協(xié)同效果是否取決于與作為成鹽陽(yáng)離子的抗壞血酸的化學(xué)締合(即使在理論上，這兩個(gè)部分應(yīng)該在水中完全締合)。圖4顯示，當(dāng)通過(guò)na⁺陽(yáng)離子實(shí)現(xiàn)“成鹽功能”時(shí)，質(zhì)子交換實(shí)際上是協(xié)同的，假定除了葡甲胺的堿性oh基團(tuán)之外，還留下胺基團(tuán)以參加與抗壞血酸的交換催化。注意，此處對(duì)照t2弛豫(ms)值(t2=840ms)未顯示，以更好地說(shuō)明各實(shí)驗(yàn)組之間的差異。

圖5概述了來(lái)自一系列實(shí)驗(yàn)的t2弛豫數(shù)據(jù)，其研究各種生理交換催化劑對(duì)來(lái)自抗壞血酸的對(duì)比效果的影響。使用已知的血清和細(xì)胞外濃度po4=2mm,葡萄糖=5mm和hco3^-為25mm，其中抗壞血酸為10mm，單獨(dú)和組合檢查這些部分各自的t2弛豫。如所示的，抗壞血酸單獨(dú)或與水中的po4一起的t2弛豫效果是適度的，但在存在生理濃度的葡萄糖或hco3^-時(shí)顯著增加，其中10mm抗壞血酸(以胃腸外給予容易和安全實(shí)現(xiàn)的血漿濃度)產(chǎn)生顯著的50%的t2弛豫變化。在體內(nèi)一起存在已知的濃度的葡萄糖、hco3^-和po4的情況下，用抗壞血酸見(jiàn)到最大增強(qiáng)。因此，通過(guò)僅靜脈內(nèi)給予抗壞血酸，抗壞血酸的體內(nèi)t2增強(qiáng)效果明顯大于在仿體研究中沒(méi)有存在生理交換催化劑的情況下在僅研究單獨(dú)的抗壞血酸后可預(yù)期的。

自上述實(shí)驗(yàn)還預(yù)測(cè)抗壞血酸與體內(nèi)通常不存在的其它糖的制劑可進(jìn)一步催化抗壞血酸對(duì)比效果的可能性。例如，圖6證實(shí)了當(dāng)以當(dāng)量濃度(20mm)加入葡甲胺至抗壞血酸鈉的溶液和加入到2mmpo4,25mmhco3^-的背景時(shí)額外的協(xié)同作用。數(shù)據(jù)顯示存在或不存在生理濃度(5mm)的葡萄糖的比較，以及單獨(dú)葡甲胺加入到生理催化劑的效果。如所見(jiàn)的，當(dāng)組合所有部分時(shí)觀察到最大對(duì)比效果。因此，一個(gè)暗示是通過(guò)組合彼此不同的交換催化劑，因此限制任何一種外源給予的物質(zhì)的濃度，可實(shí)現(xiàn)較高的對(duì)比效果。

圖7概述了擴(kuò)展此概念的數(shù)據(jù)，測(cè)試了當(dāng)抗壞血酸鈉和葡甲胺與其它單糖和二糖和糖醇一起配制時(shí)潛在的協(xié)同作用。如所示的，每一種潛在的制劑的對(duì)比效果是顯著的。在圖8中，對(duì)照溶液(2mmpo4和25mmhco3^-)更好地說(shuō)明在各組之間的對(duì)比變化的差異。由此觀察到的最強(qiáng)效果是當(dāng)抗壞血酸和葡甲胺與常見(jiàn)的二糖蔗糖組合時(shí)，因此建議僅使用可全都經(jīng)安全地胃腸外給予的部分，用于mri的有前景的候選制劑(即，抗壞血酸/葡甲胺/蔗糖)。

體內(nèi)實(shí)施例1

正常腦灌注和代謝變化

圖9.在高劑量胃腸外抗壞血酸(2g/kg,右ijiv注射)后體內(nèi)抗壞血酸t(yī)2對(duì)比變化。a,顯示通過(guò)正常c57黑小鼠的中腦的常規(guī)單切片軸fset2wi圖像，和右側(cè)的兩個(gè)圖像證實(shí)在抗壞血酸靜脈內(nèi)給予期間和之后，對(duì)比變化的“第一遍”提取。在抗壞血酸給予后立即，和其后10分鐘，獲得腦組織中的t2信號(hào)，然后從抗壞血酸給予前采集的t2腦信號(hào)減去。因此抗壞血酸產(chǎn)生信號(hào)強(qiáng)度降低，從投配前掃描的較高信號(hào)減去，可導(dǎo)致通過(guò)腦組織的流通灌注(血流)的凈正“映射”。在10分鐘，灌注效果已經(jīng)幾乎消退，和與組織吸收相關(guān)的早期信號(hào)強(qiáng)度變化開(kāi)始觀察到。b,顯示由于高劑量抗壞血酸的組織吸收導(dǎo)致的信號(hào)變化。信號(hào)強(qiáng)度的顏色封泥映射未從投配前掃描中減去，因此顯示t2信號(hào)隨時(shí)間的預(yù)期降低，在正常c57小鼠中在30-60min之間達(dá)到最大值。

體內(nèi)實(shí)施例2

與新皮質(zhì)擴(kuò)散性抑制有關(guān)的病灶性大腦代謝增進(jìn)

圖10.在新皮質(zhì)擴(kuò)散性抑制的嚙齒動(dòng)物模型中的抗壞血酸t(yī)2增強(qiáng)。擴(kuò)散性抑制(sd)是cns組織的一種實(shí)驗(yàn)上重現(xiàn)的病理生理現(xiàn)象，最初在60年前由loao描述。在皮質(zhì)的病灶區(qū)域達(dá)到離子干擾的臨界閾值后，細(xì)胞去極化的大量擴(kuò)展波可開(kāi)始和通過(guò)灰質(zhì)組織傳播，但仍限制在它所誘導(dǎo)的灰質(zhì)區(qū)，沒(méi)有跨越白質(zhì)途徑。如果誘導(dǎo)機(jī)制(例如，施用局部高濃度的氯化鉀)對(duì)相同區(qū)域是連續(xù)的，擴(kuò)散性抑制的這些波將每8-10分鐘重現(xiàn)一次，和持續(xù)2-3小時(shí)的時(shí)間。腦代謝的顯著變化伴隨sd，和因?yàn)樵趕d后不存在組織學(xué)可檢測(cè)的神經(jīng)損傷，這些代謝變化伴有在非缺血性的高刺激性腦組織例如致癲癇病灶中的代謝流出。

在上述實(shí)驗(yàn)中，下排圖像顯示用在高濃度的kcl中浸濕的明膠海綿(紅色箭頭)的微型顱骨切除術(shù)，所述明膠海綿局部擴(kuò)散至附近的頂葉皮層。顱骨切除術(shù)部位是前囪后1mm，前囪是代表下面腦后三分之一的顱骨界標(biāo)。上兩排表示在嚙齒動(dòng)物腦中在前囪前3和4mm(即是說(shuō)遠(yuǎn)離sd誘導(dǎo)部位)的t2圖像和信號(hào)變化的定量顏色封泥t2映射。前切片的t2信號(hào)變化顯示與左側(cè)相比，在右側(cè)大腦皮層中清楚的t2不對(duì)稱性(再次，sd仍被限制在右半球)。這些顯著的皮層信號(hào)變化與sd發(fā)生的已知代謝增進(jìn)活性一致，如用¹⁸f-fdgpet，以及用直接微量滲析和代謝測(cè)定也觀察到的。注意到，在顱骨切除術(shù)部位本身下直接觀察到相反的觀察結(jié)果(病灶t2信號(hào)增加)(第三排)，這與在kcl灌注部位的局部浮腫(游離水增加)一致。

體內(nèi)實(shí)施例3

心臟灌注和代謝成像

圖11.用胃腸外抗壞血酸的灌注和存活性心臟成像。a描述對(duì)于在7t下大鼠心臟成像的兩個(gè)主要的成像面，冠和軸。使用呼吸偶聯(lián)的回顧性門(mén)控，在7t下采集圖像。采集序列適度地經(jīng)t2-加權(quán)，和可進(jìn)一步優(yōu)化增強(qiáng)對(duì)比效果。b顯示初始推注抗壞血酸靜脈內(nèi)注射的整個(gè)左心室的t2信號(hào)強(qiáng)度的短暫降低。在初始推注第一遍后，使用可變倒轉(zhuǎn)角的流或“灌注成像”定量的t2映射顯示在心臟組織中逐漸的t2對(duì)比變化，反映了抗壞血酸吸收。僅存活的、代謝活性細(xì)胞將吸收抗壞血酸。

體內(nèi)實(shí)施例4

靜脈內(nèi)給予三種不同的抗壞血酸制劑后豚鼠中的t2對(duì)比變化

在7t下我們檢查了在輕度麻醉的豚鼠的整個(gè)腦中的t2對(duì)比變化。因?yàn)殡嗍笙碛腥藘?nèi)源合成抗壞血酸的失能，在該模型中mri效果可更加預(yù)測(cè)患者的mri變化。通過(guò)股靜脈或頸靜脈途徑，使用經(jīng)60分鐘受控灌注總劑量2g/kg，胃腸外給予抗壞血酸。進(jìn)行mri90分鐘。

圖12a顯示60min緩慢灌注抗壞血酸之前和之后的快速自旋回波(fse)t2圖像顯示整個(gè)腦實(shí)質(zhì)中明顯的信號(hào)強(qiáng)度差異。

在圖12b和圖12c中，顯示在給予三種不同的抗壞血酸制劑后，對(duì)于豚鼠大腦皮層(cx)和基底神經(jīng)節(jié)(bg)兩者的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度變化和定量的弛豫性測(cè)量：(1)100%抗壞血酸鈉；(2)50%抗壞血酸鈉和50%抗壞血酸葡甲胺；和3)100%抗壞血酸葡甲胺。在圖12b中，在給予由50%naaa:50%megaa組成的第二種制劑(2)期間和之后，信號(hào)強(qiáng)度變化在各時(shí)間點(diǎn)最大，觀察到的皮層fset2強(qiáng)度降低超過(guò)40%。在圖12c中計(jì)算的t2弛豫性值還顯示，用制劑(2)自基線大于10%，最大值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上大于制劑(1)或(3)。在常規(guī)的fset2加權(quán)圖像上，還注意到在幾乎每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用megaa(3)的信號(hào)強(qiáng)度變化大于用抗壞血酸鈉(1)觀察到的那些，然而t2弛豫性計(jì)算未顯示在這些后兩種制劑之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

前文說(shuō)明了本發(fā)明，和不應(yīng)解釋為對(duì)其限制。本發(fā)明由以下權(quán)利要求限定，其中權(quán)利要求的等同方案包括在其中。