本發(fā)明屬于有機(jī)小分子光敏劑領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑、其合成方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自十九世紀(jì)八十年代光動(dòng)力學(xué)治療(photodynamic therapy，PDT)方法首次在臨床應(yīng)用以來(lái)，一直被認(rèn)為是一種極具發(fā)展前景的無(wú)創(chuàng)治療手段。與其他傳統(tǒng)的癌癥治療方法如外科手術(shù)、化療和放射療法等不同，光動(dòng)力學(xué)治療選用合適的光敏劑(photosensitizer，PS)，在光照下產(chǎn)生細(xì)胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，主要是單線態(tài)氧，對(duì)其所在位置的細(xì)胞產(chǎn)生毒性、致其死亡。非常重要的一點(diǎn)是，這一過(guò)程僅在光照條件下發(fā)生并且只發(fā)生在光敏劑存在的部位。這一特性決定了該治療方法是具有優(yōu)良的空間選擇性，并且可以最大限度的減少副作用的發(fā)生?？紤]到雙光子激發(fā)在穿透深度、三維空間選擇性和較小的光損傷等方面的優(yōu)勢(shì)，雙光子激發(fā)的光動(dòng)力治療的理論早在十九世紀(jì)九十年代已經(jīng)被提出。但是現(xiàn)在可用的雙光子吸收的光敏劑在強(qiáng)極性溶劑中(生物環(huán)境)表現(xiàn)出很小的雙光子吸收截面(δ)。例如目前商業(yè)用途的大環(huán)卟啉類化合物的雙光子吸收截面只有1-50GM(1GM＝10-50cm4s photon-1)，這在很大程度了限制了雙光子光動(dòng)力療法的應(yīng)用。為了提高材料的雙光子吸收截面，開發(fā)大共軛的分子骨架、剛性的平面結(jié)構(gòu)、引入強(qiáng)的供體或者受體基團(tuán)是最常用的方法。雖然這些方法能夠制備出幾百甚至幾千GM的材料，但是這些數(shù)值都是在相對(duì)弱極性的溶劑中，如四氫呋喃。在強(qiáng)極性溶劑，如甲醇，依然不是很有效。因此，開發(fā)新型的雙光子光敏劑，能夠在強(qiáng)極性的溶劑中依然保持極大的雙光子吸收截面具有極其重要的意義。

除了提高光敏劑的雙光子吸收截面，選擇合適的光動(dòng)力治療靶點(diǎn)有利于進(jìn)一步放大單線態(tài)氧的破壞能力，從而提高雙光子光動(dòng)力治療的療效。線粒體一直被認(rèn)為是最完美的亞細(xì)胞靶向位點(diǎn)。但是目前為止并沒有這樣的材料出現(xiàn)，主要原因可能是現(xiàn)有共軛有機(jī)小分子較低的雙光子吸收截面和單線態(tài)氧量子效率，以及由于靶向功能修飾過(guò)程引起的雙光子吸收截面的進(jìn)一步降低。所以，開發(fā)一種新的分子結(jié)構(gòu)能同時(shí)提高其雙光子吸收截面，單線態(tài)氧量子產(chǎn)率和線粒體靶向的功能是必要的?？紤]到分子電場(chǎng)與分子的雙光子吸收截面是迫切相關(guān)的，而且線粒體表面負(fù)電荷的特性，在共軛分子中引入類似季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)，可以賦予分子線粒體靶向的功能；帶電荷的陽(yáng)離子基團(tuán)可以產(chǎn)生額外的電場(chǎng)，擾動(dòng)分子電場(chǎng)在一定程度上改變分子的雙光子吸收截面。同時(shí)，研究報(bào)道表面季銨鹽類共軛聚合物可以表現(xiàn)出一定的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率，可以作為一種潛在的光敏劑用于光動(dòng)力治療。因此，將內(nèi)鹽型分子結(jié)構(gòu)引入共軛有機(jī)小分子是提高共軛分子在強(qiáng)極性溶劑中雙光子吸收截面，實(shí)現(xiàn)單線態(tài)氧產(chǎn)生和線粒體靶向的有效途徑之一。

中國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)CN104693323，申請(qǐng)公布日：2015年6月10日，發(fā)明專利名稱：共軛結(jié)構(gòu)的含萘環(huán)的可見光光敏劑及其應(yīng)用。該申請(qǐng)案中公開了一種通過(guò)簡(jiǎn)便的方法合成出共軛機(jī)構(gòu)的含萘環(huán)光敏劑，使其紫外可見吸收的峰值紅移至可見光區(qū)，可做外可見光光敏劑與2,4,6-三氯甲基均三嗪一起組成光敏引發(fā)系統(tǒng)在可見光照射下引發(fā)系類單體聚合。但該發(fā)明中共軛結(jié)構(gòu)的含萘環(huán)的可見光光敏劑需要與其他物質(zhì)配合形成引發(fā)體系，并且無(wú)法將其應(yīng)用于光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)領(lǐng)域。

中國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)CN103705532A，申請(qǐng)公布日：2014年4月9日，發(fā)明專利名稱：靶向胸苷激酶光敏劑及其藥物組合物與治療癌癥的用途。該申請(qǐng)案中公開的靶向胸苷激酶光敏劑具有更大共軛系統(tǒng)吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)有利于治療深度腫瘤，該波長(zhǎng)區(qū)域不需要耗費(fèi)光輸出設(shè)備很多能量，甚至使用LED即可，使PDT更具實(shí)用性和經(jīng)濟(jì)性。但該發(fā)明中胸苷激酶光敏劑和化療劑組合聯(lián)用，雙光子光動(dòng)力治療的效率一般，使用受到一定局限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的共軛小分子光敏劑問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑、其合成方法及應(yīng)用，該內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑可以提高有機(jī)小分子光敏劑在強(qiáng)極性溶劑中雙光子吸收截面，表現(xiàn)出極高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率和線粒體靶向能力，有效提高其雙光子光動(dòng)力治療的效率。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑，其結(jié)構(gòu)式如下：

內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的制備方法，其步驟如下：

A.在裝有磁子的單口瓶中加入前驅(qū)體，用四氫呋喃作溶劑，室溫?cái)嚢柰耆芙夂蠹尤霘溲趸浀乃芤?，接著回流反?yīng)1h；

B.反應(yīng)完畢減壓蒸餾除去四氫呋喃，用的稀鹽酸溶液調(diào)至中性析出大量固體；

C.過(guò)濾；

D.用乙醇重結(jié)晶得到內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑。

更進(jìn)一步的，步驟A中前驅(qū)體為寡聚苯乙炔撐為共軛主鏈同時(shí)具有甲酸甲酯末端和叔胺側(cè)鏈。

更進(jìn)一步的，步驟A中氫氧化鉀的水溶液濃度為1～5mol/L。

更進(jìn)一步的，步驟A中回流反應(yīng)的溫度為50～90℃。

更進(jìn)一步的，步驟B中減壓蒸餾的溫度為30～40℃，壓力為10～20kpa。

更進(jìn)一步的，步驟B中稀鹽酸溶液的濃度為1mol/L。

內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的應(yīng)用，其特征在于，該內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑應(yīng)用于線粒體靶向的雙光子光動(dòng)力治療。

更進(jìn)一步的，所述線粒體靶向的雙光子光動(dòng)力治療步驟為：

S1.先將Hela細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種量約為每孔0.5×10⁴個(gè)細(xì)胞；

S2.孵育24h后，采用含有20μM內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞；

S3.2h后用PBS清洗細(xì)胞，重新培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，每個(gè)孔在1千赫茲光密度1.0W cm^-2的750nm飛秒激光器下照射；

S4.光照后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后用MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，分析光動(dòng)力學(xué)治療的效果。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

(1)本發(fā)明共軛有機(jī)小分子光敏劑，由于引入了內(nèi)鹽型分子結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物除具有傳統(tǒng)共軛有機(jī)小分子易剪裁，易代謝，生物毒性小等特性外，其在強(qiáng)極性溶劑中雙光子吸收截面得到了極大的提高；

(2)本發(fā)明共軛有機(jī)小分子光敏劑相對(duì)于商業(yè)化光敏劑的雙光子吸收截面提高了近兩個(gè)數(shù)量級(jí)；

(3)本發(fā)明共軛有機(jī)小分子光敏劑的制備方法易操作，成本低。

(4)本發(fā)明共軛有機(jī)小分子光敏劑應(yīng)用于線粒體靶向的雙光子光動(dòng)力治療，有效的拓寬了其使用范圍。

(5)本發(fā)明共軛有機(jī)小分子光敏劑應(yīng)用于線粒體靶向的雙光子光動(dòng)力治療，表現(xiàn)出了極高的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率和線粒體靶向能力，可以有效提高雙光子光動(dòng)力治療的效率。

附圖說(shuō)明

圖1為內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的¹HNMR譜圖；

圖2為內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的單晶結(jié)構(gòu)；

圖3為開孔Z-scan技術(shù)用于測(cè)試內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑在甲醇中的雙光子吸收截面；

圖4為內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的單線態(tài)氧產(chǎn)率，以商業(yè)光敏劑TMPyP4為標(biāo)準(zhǔn)；

圖5為內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑線粒體靶向，內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑與商業(yè)線粒體靶向探針(Mito tracker red)共定位實(shí)驗(yàn)圖；

圖6為內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑用于雙光子光動(dòng)力治療；

圖7為蛋白印跡技術(shù)驗(yàn)證內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑引起的內(nèi)源性線粒體凋亡誘導(dǎo)的雙光子光動(dòng)力治療；

圖8內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑引起的內(nèi)源性線粒體凋亡誘導(dǎo)的雙光子光動(dòng)力治療的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

制備內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的主要原料有1,4-二碘-2,5-苯二酚、二氯氨基鹽酸鹽、4-乙炔基苯甲酸甲酯，四三苯基膦鈀(Pd(PPh3)4)、丙酮(aceton，分析級(jí))、二異丙胺(DIPA，分析級(jí))、石油醚(工業(yè)級(jí))、二氯甲烷(工業(yè)級(jí))、氫氧化鉀(分析純)、無(wú)水乙醇(分析純)等。反應(yīng)前驅(qū)體采用Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)，內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑通過(guò)水解后自身質(zhì)子化作用形成。

本發(fā)明的內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑具體合成方法如下：

1.1,4-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]-2,5-二碘苯(單體1)的制備步驟如下：

在帶有回流冷凝管和磁子的500mL兩口圓底燒瓶中加入1,4-二碘-2,5-苯二酚(10.8g,0.03mol)、二氯氨基鹽酸鹽(12.38g,0.072mmol)、無(wú)水碳酸鉀(24.8g,0.18mol)，加畢后將整個(gè)反應(yīng)體系密封抽真空，然后充入氮?dú)?，保持整個(gè)反應(yīng)過(guò)程在氮?dú)夥諊羞M(jìn)行；用針筒注入溶劑丙酮(250mL)，然后加熱65～90℃回流3天。反應(yīng)完畢，過(guò)濾得有機(jī)相，減壓蒸餾除去溶劑得到粗產(chǎn)品；用石油醚、二氯甲烷(石油醚：二氯甲烷＝8：1)和三乙胺(5％體積比)的混合洗脫液通過(guò)硅膠柱提純，再用正己烷重結(jié)晶得白色的晶體(9.3g，0.0167mol)。

2.1,4-二(4-甲氧基羰基苯乙炔)-2,5-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]苯的制備步驟如下：

將4-乙炔基苯甲酸甲酯(0.5g,3mmol)、1,4-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]-2,5-二碘苯(0.8g，1.42mmol)、碘化亞銅(0.052g,0.3mmol)、四三苯基膦鈀(0.12g，0.15mmol)依次加入帶有回流冷凝管和磁子的100mL兩口圓底燒瓶中，反應(yīng)裝置在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用注射器注入混合溶劑四氫呋喃(20mL)和二異丙胺(30mL)，加熱至65℃反應(yīng)24h。反應(yīng)完畢過(guò)濾取濾液減壓蒸餾濃縮后用石油醚和二氯甲烷(石油醚：二氯甲烷＝8：1)的混合洗脫液通過(guò)硅膠柱提純，得到黃色固體粉末(1.25g，2mmol)。

3.1,4-二(4-羧基苯乙炔)-2,5-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]苯(DBA)的制備步驟如下：

將1,4-二(4甲氧基羰基苯乙炔)-2,5-二[3-(N,N-二乙基胺)-1-氧丙基]苯加入單口圓底燒瓶中，用四氫呋喃作溶劑，在室溫?cái)嚢?600-1500rpm)的條件下逐滴加入氫氧化鉀的水溶液(1mol/L)反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完畢減壓蒸餾除去四氫呋喃，用稀鹽酸溶液(1mol/L)調(diào)至中性析出大量固體，過(guò)濾得到的固體用乙醇重結(jié)晶最終得到內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑。

所得產(chǎn)物¹HNMR表征結(jié)果如圖1所示，具體如下：

1H NMR(CD3OD,400MHz):8.05(d,J＝8.4Hz,4H),7.62(d,J＝8.4Hz,4H),7.35(s,2H),4.52–4.45(m,4H),3.74–3.67(m,4H),3.42(q,J＝7.3Hz,8H),1.34(q,J＝7.6Hz,12H).13C NMR(CD3OD,100MHz):152.94,131.01,129.52,117.02,113.94,94.34,64.27,50.91,48.74,8.10。

圖2為內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的單晶結(jié)構(gòu)圖，單晶解析數(shù)據(jù)證明了該共軛有機(jī)小分子的內(nèi)鹽型構(gòu)型。

內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑雙光子吸收截面、單線態(tài)氧量子產(chǎn)率及線粒體靶向能力：

雙光子吸收截面：雙光子吸收截面的測(cè)試是基于經(jīng)典的Z-scan技術(shù)。具體過(guò)程如下：

激發(fā)光源是Ti：sapphire(脈沖：100fs；重復(fù)頻率：80MHz)。具體如下：測(cè)試過(guò)程中，激光入射光首先通過(guò)一個(gè)開孔率為1/10，轉(zhuǎn)速為315r/s的斬波器。該高斯光束通過(guò)凸透鏡聚焦于樣品，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的鎖相放大技術(shù)用硅光電二極管檢測(cè)透射光。測(cè)試曲線是基于焦點(diǎn)(z＝0)鏡像對(duì)稱的，在焦點(diǎn)處表現(xiàn)出最小的透射率。雙光子吸收系數(shù)(β)可以通過(guò)歸一化透射率的方法計(jì)算。

I₀₀是峰值強(qiáng)度，z是樣品位置，是光束的衍射長(zhǎng)度，ω₀是光束在焦點(diǎn)處的束腰半徑，L_eff＝[1-exp(-a₀L)]/a_o是樣品的有效厚度。作為一個(gè)宏觀參數(shù),β＝δ₂'N_Ad₀×10^-3,其中δ₂'是分子的雙光子吸收截面(cm⁴GW^-1)，N_A是阿伏伽德羅常數(shù)，d₀是染料分子的摩爾濃度(單位：M L^-1)。通常雙光子吸收截面定義為δ＝hvδ₂'(單位：GM)。

根據(jù)上述公式與圖3中開孔Z-scan技術(shù)用于測(cè)試內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑在甲醇中的雙光子吸收截面數(shù)據(jù)，計(jì)算得內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑(DBA)在甲醇中的雙光子吸收截面高達(dá)3260GM。相比商業(yè)普遍使用的光敏劑(5,10,15,20-Tetrakis(1-methyl-4-pyridinio)porphyrin tetra(p-toluenesulfonate，TMPyP₄)在甲醇中只有10GM的雙光子吸收截面，該內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)的雙光子吸收截面，為其在雙光子光動(dòng)力治療領(lǐng)域提供了良好的應(yīng)用前景。

單線態(tài)氧量子產(chǎn)率：通過(guò)直接檢測(cè)單線態(tài)氧在1270nm附近的特征發(fā)射峰證明了該內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子具有產(chǎn)生單線態(tài)氧的能力，如圖4所示。進(jìn)一步與已知單線態(tài)氧量子產(chǎn)率的商業(yè)光敏劑TMPyP₄(單線態(tài)氧量子產(chǎn)率74％)對(duì)比，計(jì)算得該內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子的單線態(tài)氧量子產(chǎn)率高達(dá)72.8％，可以與該商業(yè)光敏劑相媲美。

線粒體靶向：通過(guò)細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子的發(fā)光位置與商業(yè)的線粒體探針的發(fā)光位置有完美的重合，如圖5所示，驗(yàn)證了該材料線粒體靶向的能力。

實(shí)施例2

內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑用于雙光子光動(dòng)力治療步驟如下：

S1.先將Hela細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，接種量約為每孔0.5×10⁴個(gè)細(xì)胞，孵育條件同上；

S2.孵育24h后，以含有20μM內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞；

S3.2h后用PBS清洗細(xì)胞然后重新培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液中，每個(gè)孔在1千赫茲光密度1.0W cm^-2的750nm飛秒激光器下照射；

S4.然后光照后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后用MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，分析雙光子光動(dòng)力治療的效果。

圖6為內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑用于雙光子光動(dòng)力治療效果，相比商業(yè)光敏劑TMPyP₄，DBA表現(xiàn)出更加良好的雙光子光動(dòng)力治療。

蛋白印跡技實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞色素c，激活凋亡因子caspase-3，如圖7所示，從而導(dǎo)致最終的細(xì)胞凋亡。圖8給出了該內(nèi)鹽型共軛有機(jī)小分子光敏劑引起的內(nèi)源性線粒體凋亡誘導(dǎo)的雙光子光動(dòng)力治療示意圖。

以上示意性地對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造及其實(shí)施方式進(jìn)行了描述，該描述沒有限制性，附圖中所示的也只是本發(fā)明創(chuàng)造的實(shí)施方式之一，實(shí)際的結(jié)構(gòu)并不局限于此。所以，如果本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員受其啟示，在不脫離本創(chuàng)造宗旨的情況下，不經(jīng)創(chuàng)造性的設(shè)計(jì)出與該技術(shù)方案相似的結(jié)構(gòu)方式及實(shí)施例，均應(yīng)屬于本專利的保護(hù)范圍。