本發(fā)明涉及化橘紅提取物的新用途，尤其是涉及化橘紅提取物用于制備防治PM2.5誘導慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作藥物的用途。

背景技術(shù)：

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見以持續(xù)性氣流受限為特征的疾病。氣流受限進行性發(fā)展，與氣道和肺臟對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應增強有關。COPD是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一，已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。全球目前有6億人患有慢阻肺；根據(jù)《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告(2015)》，我國40歲及以上人群的慢阻肺患病率高達9.9％。

慢性阻塞性肺疾病全球倡議組織發(fā)布的2015年版GOLD慢阻肺診斷治療和預防的全球策略指出：吸入香煙煙霧和其他有毒顆粒，是COPD發(fā)生的重要原因。戶外大氣污染是促進COPD急性加重發(fā)作，而急性加重影響著疾病的嚴重程度和對個體的預后，導致住院率和病死率的增加。近年來，隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，環(huán)境污染問題日益嚴重，以霧霾為主的大氣污染已經(jīng)成為全國性的環(huán)境問題，許多地區(qū)已嚴重受霧霾影響。霾天氣的本質(zhì)是大氣細顆粒物PM2.5污染，因此，目前霧霾對健康影響的研究主要集中在PM2.5上。PM2.5是指大氣中空氣動力學粒徑小于或等于2.5微米的顆粒物，也稱為可入肺顆粒物。PM2.5富含大量有毒、有害物質(zhì)，進入肺部后可誘導呼吸系統(tǒng)炎癥，增加人群患COPD、肺氣腫及其他呼吸系統(tǒng)疾病的危險性；對于COPD患者，PM2.5可干擾呼吸系統(tǒng)換氣功能和引起肺功能障礙，誘發(fā)COPD急性加重發(fā)作和氣流受限的加重。目前，COPD急性加重期的治療，主要是針對病毒或細菌誘發(fā)的呼吸道感染，常采用氧療、支氣管舒張劑、全身性應用糖皮質(zhì)激素、抗生素等加以治療。而針對PM2.5誘發(fā)的COPD急性加重發(fā)作和氣流受限的加重，主要集中在改善環(huán)境，提高空氣質(zhì)量或減少外出，降低暴露損害等消極應對方法，缺少具有針對性的預防或治療藥物。因此，有必要研制用于預防和治療誘發(fā)COPD急性加重發(fā)作和氣流受限加重的藥物和新型保健產(chǎn)品。

化橘紅是蕓香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis‘Tomentosa’的未成熟或近成熟的干燥外層果皮。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認為，化橘紅味辛、苦，性溫，歸肺、脾經(jīng)，具有理氣寬中，燥濕化痰的功效，用于咳嗽痰多，多積傷酒，嘔惡痞悶?，F(xiàn)代藥理研究表明，化橘紅具有止咳化痰平喘的作用，但尚未有報道化橘紅用于制備預防和治療PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作期氣流受限加重的藥物的用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了化橘紅總黃酮提取物在制備防治PM2.5顆粒誘導慢性阻塞性肺疾病急性發(fā)作藥物中的應用。

并進一步公開化橘紅總黃酮提取物在制備防治PM2.5顆粒誘導慢性阻塞性肺疾病急性加重發(fā)作期氣流受限加重藥物中的應用。

化橘紅總黃酮提取物在制備防治PM2.5顆粒誘導呼吸系統(tǒng)高氣道反應性、低肺動態(tài)順應性疾病藥物中的應用。

優(yōu)選黃酮類化合物的總含量高于50％的化橘紅總黃酮提取物。

最優(yōu)選黃酮類化合物的總含量高于70％的化橘紅總黃酮提取物。

實驗研究中發(fā)現(xiàn)：化橘紅總黃酮提取物灌胃給予PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作大鼠，能顯著降低氣道阻力，提高肺順應性，增加0.2s呼氣量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)與呼氣峰流速(PEF)，說明化橘紅總黃酮提取物具有很好的抑制PM2.5誘導COPD急性發(fā)作的作用；特別是防治PM2.5顆粒誘導慢性阻塞性肺疾病急性加重發(fā)作期氣流受限加重的作用。本發(fā)明的化橘紅總黃酮提取物制備方法簡單，成本低，療效確切；為天然植物提取物，無副作用，可作為預防保健食品或治療藥品。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

各實施例中所涉及的固體混合物中之固體，液體中之液體，以及液體中之固體的百分比分別是以wt/wt、vol/vol、wt/vol計算，除非另有說明。

實施例1：化橘紅總黃酮提取物的制備

化橘紅總黃酮提取物的制備方法為：取化橘紅藥材，加水煎煮，濾過，水煎液濃縮至相對密度為1.05～1.30，加入乙醇或(和)甲醇進行醇沉，有沉淀物出現(xiàn)，濾過，濾液回收醇至無醇味的浸膏，加水調(diào)相對密度至1.05～1.15間，放置3天以上，有沉淀物析出，過濾，得到沉淀物，干燥，即為化橘紅總黃酮提取物。

化橘紅總黃酮提取物的總黃酮含量測定方法為：采用《中國藥典》2010年版第一部化橘紅項下所載方法進行測定含量。即取化橘紅提取物1mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液；另取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋成每1ml中約含柚皮苷60μg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，按藥典所載色譜條件進行測定，計算，即得。

按上述方法，共取用三批不同化橘紅藥材進行提取，得到三批化橘紅總黃酮提取物P1、P2、P3，該三批樣品的黃酮類化合物含量見表1。

表1三批化橘紅總黃酮提取物中黃酮類化合物含量

實施例2：化橘紅總黃酮提取物對PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作期氣流受限加重的抑制作用。

選取實施例1所得三批化橘紅總黃酮提取物進行以下實施例的實驗。

1、實驗動物：

健康Wistar大鼠72只，體重(180±20)g，SPF級，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2013-0002。

2、藥品分組與處理：

正常對照組：正常動物不經(jīng)造模處理，實驗期間每日灌胃等體積的蒸餾水。

COPD模型組(COPD組)：采用煙熏復合氣道內(nèi)注入細菌脂多糖(以下簡稱LPS)法造成COPD模型，實驗期間每日灌胃等體積的蒸餾水；在煙熏8周的最后一天，按2ml/kg體重的劑量給予大鼠氣管滴注生理鹽水。

PM2.5誘導的COPD急性加重發(fā)作模型組(COPD+PM2.5組)：采用煙熏復合氣道內(nèi)注入LPS法造成COPD模型，在煙熏8周的最后一天，以PM2.5混懸液氣管滴注染毒造成PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作模型。

化橘紅總黃酮提取物P1組(COPD+PM2.5+P1組)：采用煙熏復合氣道內(nèi)注入LPS法造成COPD模型，在煙熏8周的最后一天，以PM2.5混懸液氣管滴注染毒造成PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作模型；從煙熏第七周的第一天起，每天于實驗前取P1批化橘紅總黃酮提取物粉末(黃酮類化合物含量為53.5％)，加蒸餾水配成濃度為0.1mg/ml的混懸液，所有動物按1ml/100g體重的劑量灌胃給藥，1次/天(d)，連續(xù)1周。

化橘紅總黃酮提取物P2組(COPD+PM2.5+P2組)：采用煙熏復合氣道內(nèi)注入LPS法造成COPD模型，在煙熏8周的最后一天，以PM2.5混懸液氣管滴注染毒造成PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作模型；從煙熏第七周的第一天起，每天于實驗前取P2批化橘紅總黃酮提取物粉末(黃酮類化合物含量為67.9％)，加蒸餾水配成濃度為0.1mg/ml的混懸液，所有動物按1ml/100g體重的劑量灌胃給藥，1次/天(d)，連續(xù)1周。

化橘紅總黃酮提取物P3組(COPD+PM2.5+P3組)：采用煙熏復合氣道內(nèi)注入LPS法造成COPD模型，在煙熏8周的最后一天，以PM2.5混懸液氣管滴注染毒造成PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作模型；從煙熏第七周的第一天起，每天于實驗前取P3批化橘紅總黃酮提取物粉末(黃酮類化合物含量為76.1％)，加蒸餾水配成濃度為0.1mg/ml的混懸液，所有動物按1ml/100g體重的劑量灌胃給藥，1次/天(d)，連續(xù)1周。

3、實驗方法：

3.1分組與COPD造模：

按隨機數(shù)字表法將大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為6組，正常對照組、COPD模型組、PM2.5誘導的COPD急性加重發(fā)作模型組、化橘紅總黃酮提取物P1組、化橘紅總黃酮提取物P2組、化橘紅總黃酮提取物P3組，每組12只。正常對照組大鼠飼養(yǎng)于無煙的正常環(huán)境，每天灌予等體積蒸餾水；其它各組大鼠分別于實驗第1、15、30天乙醚麻醉動物后氣道內(nèi)注入200μg/200μL生理鹽水脂多糖溶液(當天不進行香煙熏染毒)，其余造模時間內(nèi)每天將大鼠置入密閉的不銹鋼煙熏箱(0.8m×0.8m×1m)進行煙熏染毒，煙熏染毒方法為：每天2次，中間間隔4h，每次煙熏30min，10支煙/次，6天/周，共8周，每支煙含焦油量11mg，煙氣煙堿量1.0mg，一氧化碳量13mg。煙熏箱帶水冷夾層，使箱內(nèi)溫度維持在26℃左右。

3.2 PM2.5的采樣與處理：

于2014月7月1日起,在廣州市區(qū)用Thermo Anderson G-2.5大流量采樣器(美國熱電子公司)用聚四氟乙烯濾膜采樣PM2.5，連續(xù)4周。將載有顆粒物的濾膜剪裁成1cm×3cm大小，置于去離子蒸餾水中，超聲振蕩3次，每次1小時，洗脫顆粒物，震蕩液經(jīng)六層紗布過濾，濾液于4℃、12000r/min離心30min，收集下層懸液冷凍真空干燥，得到PM2.5粉末。用生理鹽水將PM2.5粉末配成所需濃度后超聲震蕩15min，混勻并滅菌，4℃保存，臨用前振蕩使顆粒物充分混勻。

3.3 PM2.5誘導的COPD急性加重發(fā)作模型：

取PM2.5誘導的COPD急性加重發(fā)作模型組、化橘紅總黃酮提取物P1組、化橘紅總黃酮提取物P2組、化橘紅總黃酮提取物P3組的所有大鼠，按2mg/kg體重的劑量給動物進行PM2.5混懸液氣管滴注染毒造模，氣管一次滴注量為2ml/kg體重，染毒時間為24h。

3.4呼吸功能檢測：

用3％戊巴比妥鈉(5mg/kg)腹腔注射麻醉，然后將大鼠仰臥固定在操作臺上，縱行切開頸部皮膚，機械鈍性分離皮下組織暴露氣管，在環(huán)狀軟骨下切一個倒“T”型切口，進行氣管插管。采用美國Buxco公司PFT/Maneuvers動物肺功能檢測分析系統(tǒng)測量氣道阻力、肺順應性、0.2s呼氣量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)、呼吸峰流速(PEF)等呼吸指標。

4、實驗結(jié)果：

由表2可見，與空白對照組比較，COPD組大鼠的氣道阻力顯著升高(P＜0.01)，肺順應性顯著降低(P＜0.01)，0.2s呼氣量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)與呼氣峰流速(PEF)顯著下降(P＜0.01)，說明煙熏復合氣道內(nèi)注入LPS法可造成大鼠表現(xiàn)出明顯的氣流受限現(xiàn)象。與COPD組比較，COPD+PM2.5組的氣流受限明顯加重，表現(xiàn)為氣道阻力顯著升高(P＜0.01)，肺順應性顯著降低(P＜0.01)，0.2s呼氣量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)與呼氣峰流速(PEF)顯著下降(P＜0.01)。與COPD+PM2.5組比較，COPD+PM2.5+P1組、COPD+PM2.5+P2組和COPD+PM2.5+P3組大鼠的氣道阻力顯著降低(P＜0.05或0.01)，肺順應性顯著升高(P＜0.01)，0.2s呼氣量(FEV0.2)/最大肺活量(FVC)與呼氣峰流速(PEF)顯著提高(P＜0.05或0.01)，提示化橘紅總黃酮提取物具有很好的抑制PM2.5誘導COPD急性發(fā)作的作用；尤其是抑制PM2.5誘導COPD急性加重發(fā)作期的氣流受限加重的作用。

表2化橘紅總黃酮提取物對PM2.5誘導的COPD急性加重發(fā)作期氣流受限加重的抑制作用(n＝12)

注：與正常對照組比較：^##P＜0.01；與COPD組比較：^$$P＜0.01；與COPD+PM2.5組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。