本發(fā)明涉及一種抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成的納米環(huán)丙沙星顆粒制備方法，屬于生物納米領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：新型抗生素研制的速度遠(yuǎn)趕不上臨床耐藥菌出現(xiàn)的速度，人類將面臨著無藥可治的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。提高現(xiàn)有抗生素抑菌效力似乎也成為人類的救命稻草。目前解決這一難題的一條有效途徑就是怎樣改變抗生素輸送方式和釋放位置，從而起到靶向和富集的作用，實(shí)現(xiàn)抗生素高效抑制病原菌感染的功效。納米抗生素（nano-antibiotics）是目前發(fā)展的一種新型抗生素體系，可以在納米尺度輸送藥物，逃避細(xì)菌的耐藥機(jī)制，被認(rèn)為是一種有前途的控制細(xì)菌感染方法。銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）生物被膜是細(xì)菌粘附在固體表面，分泌一些胞外基質(zhì)復(fù)合物將其包裹其中而形成的膜狀結(jié)構(gòu)。這些胞外基質(zhì)主要包括一些大分子聚合物，它們構(gòu)成結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)的生物被膜，幫助細(xì)菌逃避抗生素的作用。生物被膜條件下的銅綠假單胞菌，比在自由浮游狀態(tài)下對抗生素的耐藥性可提高1000倍左右。加上銅綠假單胞菌對多種抗生素固有的和獲得性的耐藥性，使得銅綠假單胞菌的感染性疾病在臨床上治療非常困難。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成的納米環(huán)丙沙星顆粒制備方法。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程如下：一種納米環(huán)丙沙星顆粒的制備方法，包括以下步驟：（1）將殼聚糖鹽酸鹽配成水溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.0，經(jīng)微孔膜過濾除菌備用；（2）將β-環(huán)糊精硫酸鹽配成水溶液，經(jīng)微孔膜過濾除菌備用；（3）將鹽酸環(huán)丙沙星配成水溶液，經(jīng)微孔膜過濾除菌，加入到步驟（2）的溶液中，室溫?cái)嚢瑁唬?）將步驟（3）得到的溶液加入步驟（1）的溶液中室溫?cái)嚢?，?jīng)離心、洗滌、冷凍干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物。上述殼聚糖鹽酸鹽、β-環(huán)糊精硫酸鹽和鹽酸環(huán)丙沙星的質(zhì)量比為（1-3）：（1-3）：（1-3）。本發(fā)明制備方法得到的納米環(huán)丙沙星顆?？梢种沏~綠假單胞菌生物被膜形成。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果：本發(fā)明以殼聚糖鹽酸鹽（Chitosanhydrochloride，CS）和β-環(huán)糊精硫酸鹽（β-cyclodextrinsulfatecy，S-β-CD）為載體，包裹鹽酸環(huán)丙沙星（CiprofloxacinHydrochloride，Cip），制備納米環(huán)丙沙星顆粒。CS和S-β-CD構(gòu)成的包載體系穩(wěn)定，載藥率高，細(xì)胞毒性低。納米環(huán)丙沙星顆?？捎行б种沏~綠假單胞菌生物被膜的形成，這將為臨床上治療銅綠假單胞菌感染性疾病提供新的有效途徑。附圖說明圖1為納米環(huán)丙沙星顆粒制備過程中的外觀形態(tài)；圖2為動態(tài)光散射檢測納米顆粒粒徑分布；圖3為納米環(huán)丙沙星顆粒的能譜分析及形貌分析；A：能譜分析；B：掃描電子顯微鏡；圖4為納米環(huán)丙沙星顆粒體外模擬累積釋放曲線；圖5為納米環(huán)丙沙星顆粒對生物被膜形成的抑制及生物被膜內(nèi)部細(xì)菌的清除作用；圖6為納米環(huán)丙沙星顆粒在抑制PAO1生物被膜形成過程中對其厚度的影響；圖7為快速銀染法和掃描電鏡檢測納米環(huán)丙沙星顆粒抑制PAO1生物被膜形成。具體實(shí)施方式以下實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所使用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)驗(yàn)涉及的儀器為磁力攪拌器，臺式高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、動態(tài)光散射儀、原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡、熒光顯微鏡。實(shí)施例1納米環(huán)丙沙星顆粒的制備（1）CS用無菌雙蒸水配成濃度為1.0mg/ml的水溶液，NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.0，無菌微孔膜過濾除菌備用；（2）S-β-CD用無菌雙蒸水配成濃度為1.0mg/ml的水溶液，微孔膜過濾除菌備用；（3）Cip用無菌雙蒸水配成濃度為1mg/ml的水溶液，微孔膜過濾除菌，加入到等體積的1mg/mlS-β-CD溶液，室溫下磁力攪拌1h；（4）加入到等體積的1mg/ml的CS水溶液，室溫下繼續(xù)攪拌4h，即得到納米抗生素載藥顆粒乳光液。16000rpm離心30min，取上清，測包封率，無菌水漂洗沉淀顆粒三次，過夜冷凍干燥，得到納米環(huán)丙沙星顆粒（Cip-NPs）。圖1為納米環(huán)丙沙星顆粒制備過程中的外觀形態(tài)。最終制備的納米環(huán)丙沙星顆粒，呈現(xiàn)均一的乳光液，無任何聚集現(xiàn)象。為了驗(yàn)證制備的納米載藥分散體系的穩(wěn)定性，將制備好的乳光液室溫放置，取不同天數(shù)測粒徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在30天內(nèi)，粒徑大小并無顯著性差異和變化。實(shí)施例2空載納米顆粒的制備濃度分別為1.0mg/ml的CS與S-β-CD按照1:1體積混合，室溫下置于磁力攪拌器上攪拌4h，即得到空載納米顆粒乳光液。16000rpm離心30min，無菌水漂洗沉淀顆粒三次，過夜冷凍干燥，得到空載納米顆粒（NPs）。實(shí)施例3鹽酸環(huán)丙沙星濃度檢測（1）配制10μg/ml的Cip標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）按照表1方法，將10μg/ml的Cip標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋得到不同濃度，以蒸餾水作為空白對照液，用紫外可見分光光度計(jì)于Cip的最大吸收波長276nm處測定各濃度Cip的吸光值。以濃度為X軸，OD值為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為：y=0.109x-0.012（R2=0.997），Y為吸光值，X為藥物濃度（μg/ml）。表1Cip標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制溶液組分配制溶液編號123456789Cip標(biāo)準(zhǔn)液（ml）0.50.751.01.251.51.752.02.252.5蒸餾水（ml）2.52.252.01.751.51.251.00.750.5Cip終濃度（μg/ml）1.66　2.5　3.333　4.167　5．0　5.833　6.667　7.5　8.333　實(shí)施例4納米環(huán)丙沙星顆粒包封率的測定Cip-NPs乳光液于16000rpm離心10min，收集上清液，并用無菌水漂洗沉淀顆粒。重復(fù)三次。沉淀顆粒于-80℃過夜冷凍干燥，即得到載藥納米顆粒。測上清液在276nm處的紫外吸收值，與Cip標(biāo)準(zhǔn)曲線作對比，計(jì)算相應(yīng)的Cip濃度，并推算出上清液中Cip含量。包封率（EE）按照下列公式計(jì)算。所有的樣品三個平行，結(jié)果用平均百分比(w/w)±SD表示。公式如下：EE(%)=Mo-Mc/Mo×100%其中，Mo指在形成納米Cip顆粒之前所加的總Cip量，Mc表示上清液中的Cip的量。實(shí)施例5納米環(huán)丙沙星顆粒的表征（1）Zeta電位儀測量粒徑和Zeta電位將上述制備的新鮮空載NPs或Cip-NPs乳光液稀釋后取3ml于馬爾文動態(tài)光散射儀上測顆粒粒徑和Zeta電位。圖2為動態(tài)光散射（MelvinZeta電位儀）檢測納米顆粒粒徑分布圖。在CS、S-β-CD和Cip均為1mg/ml，攪拌時間為4h，pH值在5.5條件下制備的納米環(huán)丙沙星顆粒的平均粒徑在142.9±1.41nm，最大粒徑在175.4nm，集中度為97.8%；Zeta電位為+62.47±0.28mV，包封率在51.21%，即得到了粒徑相對較小，電位和包封率較高的納米環(huán)丙沙星顆粒。其中，空載顆粒的粒徑為132.5±1.2nm，Zeta電位為+33.63±0.97mV，在加入Cip后，載藥體系的穩(wěn)定性增強(qiáng)，顆粒粒徑有增大趨勢。（2）納米環(huán)丙沙星顆粒表面形態(tài)觀察a)掃描電鏡觀察將上述制備好的新鮮納米乳光液滴于粘有導(dǎo)電膠的金屬導(dǎo)電臺上，室溫下超凈臺中自然晾干，之后噴金掃描采集圖像。b)原子力顯微鏡觀察將金片放于丙酮、95%乙醇和純凈水中依次超聲處理30min，保存于75%乙醇中備用。將新鮮制備的Cip-NPs適當(dāng)稀釋后滴在金片上，室溫下于超凈工作臺中自然晾干后采集圖像。c)紅外光譜檢測將100-200mg的干燥KBr粉末2mg與凍干的Cip-NPs、Cip、CS或S-β-CD粉末分別混勻研細(xì)，做成1mm左右厚度片子，紅外光譜掃描儀采集數(shù)據(jù)，并繪制圖表。圖3為納米環(huán)丙沙星顆粒的能譜分析及形貌分析A:能譜分析；B：電鏡掃描。從電鏡掃描結(jié)果來看，納米環(huán)丙沙星顆粒形貌呈現(xiàn)較為標(biāo)準(zhǔn)的圓球形，有高有低地分散在導(dǎo)電膠上，每個圓球顆?；叶纫恢?，未發(fā)現(xiàn)局部發(fā)黑或者局部偏白的情況，整個顆粒很均勻。為了檢測環(huán)丙沙星納米顆粒的組成成分，隨機(jī)選取納米顆粒進(jìn)行能譜分析，結(jié)果顯示，納米環(huán)丙沙星顆粒組分中CS的特征元素N，S-β-CD的特征元素S和Cip中的特征元素F均可以檢測到，說明載藥顆粒制備成功。FAM結(jié)果看到很多圓球狀顆粒鋪滿整個視野。從3D圖像來看，顆粒呈現(xiàn)不同大小的突起。實(shí)施例6納米環(huán)丙沙星顆粒體外模擬釋放將10ml同濃度的Cip水溶液和Cip-NPs乳光液分別置于透析袋中，封口并固定在裝有200mlpH值為7.4的生理鹽水的燒杯中，密封燒杯。37℃恒溫?cái)嚢瑁?00rpm），不同時間點(diǎn)取樣3ml，并補(bǔ)充等體積生理鹽水。276nm處測不同時間點(diǎn)取樣液的Cip紫外吸收值，并計(jì)算期濃度與含量。所有取樣做三個平行，進(jìn)而計(jì)算累積釋放率。以取樣時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，累積吸光值為縱坐標(biāo)繪制釋放曲線。圖4納米環(huán)丙沙星顆粒體外模擬累積釋放曲線。藥納米顆粒的體外模擬釋放選用生理鹽水作為生理模擬釋放介質(zhì)，從累積釋放曲線來看，載藥顆粒有一定的緩釋作用，Cip水溶液在8h的時候，近90%的藥物已經(jīng)釋放出來，而納米環(huán)丙沙星顆粒卻只釋放了不到50%，一直到48h的時候才釋放到90%，這時候跟Cip的終釋放量基本接近，說明納米環(huán)丙沙星顆粒有較好的緩釋作用。實(shí)施例7銅綠假單胞菌的培養(yǎng)本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)菌株為銅綠假單胞菌野生型菌株P(guān)AO1，所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)時，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，其余按照方法說明進(jìn)行。實(shí)施例8最低抑菌濃度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）測定在96孔板中分別用LB培養(yǎng)液對Cip和納米環(huán)丙沙星顆粒進(jìn)行1/2梯度稀釋，終濃度依次為1.6μg/ml，0.8μg/ml，0.4μg/ml，0.2μg/ml，0.1μg/ml，0.05μg/ml和0.025μg/ml。每孔分別加入10μlOD600=0.1的PAO1菌體，37℃恒溫靜置培養(yǎng)24h。MIC定義為，培養(yǎng)24h后無菌生長的最低抗生素濃度。實(shí)施例9生物被膜模型構(gòu)建及定量（1）生物被膜模型構(gòu)建a)利用硼硅酸鹽試管形成生物被膜銅綠假單胞菌過夜培養(yǎng)物1:100稀釋后，吸取5ml菌液于15ml硼硅酸鹽試管中于30℃培養(yǎng)24h，然后輕輕吸走培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，洗掉浮游菌，加入6ml0.1%結(jié)晶紫染色液染色15min，自來水沖掉浮色，室溫晾干，拍照記錄。b)在蓋玻片上形成生物被膜用鋼化直尺將蓋玻片裁剪成0.5cm×0.5cm大小，濃H2SO4浸泡24h，超聲處理30min后用水沖洗干凈，濕熱高壓滅菌后備用。銅綠假單胞菌過夜培養(yǎng)物按1:100比例稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)活化3h，調(diào)OD600=0.1，分別吸取0.5ml菌液到24孔板中。將無菌蓋玻片放入到24孔板中的各孔中，30℃恒溫靜止培養(yǎng)24h。(2)生物被膜定量a)結(jié)晶紫染色PAO1菌株過夜培養(yǎng)物，1:100比例活化3h后調(diào)OD600=0.1。96孔板每孔加10μl菌液，再加入用LB稀釋成不同濃度的Cip或者Cip-NPs培養(yǎng)液，總體積為200μl。37℃恒溫靜止培養(yǎng)24h，小心吸走培養(yǎng)液，加99%甲醇200μl過夜固定，移去甲醇，加入0.1%的結(jié)晶紫染色液200μl染色20min，用自來水溫和緩慢地沖掉浮色，室溫下自然干燥，之后加入200μl95%乙醇洗脫兩次，收集洗脫液，590nm處測定光吸收值。同時做陰性對照和空白對照。b)快速銀染法無菌PBS溶液多次充分漂洗蓋玻片上的生物被膜，2.5%戊二醛固定12h，飽和CaCl2溶液處理15min，5%AgNO3溶液15min，1%對苯二酚溶液顯色2min，5%Na2S2O3溶液固定2min，以上各步驟中間均用無菌PBS清洗1min。普通光學(xué)顯微鏡觀察。c)掃描電子顯微鏡法用PBS反復(fù)漂洗蓋玻片上的生物被膜，用2.5%戊二醛溶液4℃條件下固定12h后，0.1mol/mlPBS漂洗3次，30%，50%，70%，85%，90%乙醇分別固定15min，之后100%乙醇脫水兩次，每次30min，自然干燥、噴金，掃描電子顯微鏡觀察生物被膜微觀形態(tài)。d)激光共聚焦顯微鏡法將攜帶綠色熒光蛋白gfp的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至PAO1菌株中，菌體黏附在生物被膜表面，內(nèi)部或者被包埋在生物被膜深層，通過檢測綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度即可以間接的反應(yīng)生物被膜的多少和厚度。用蓋玻片上形成生物被膜后，無菌PBS緩沖液漂洗3次，小心放在激光共聚焦顯微鏡載物臺上，由低倍鏡到高倍鏡慢慢調(diào)節(jié)觀察，按照1μm的步距掃描逐層掃描，每個樣沿Z軸各掃描6個視野。60×物鏡，激發(fā)波長488nm，Z軸系列的光學(xué)部分用OlympusFV10-ASM1.7軟件進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)重建，即得到不同組別生物被膜的3D圖像，并估測其厚度，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，整理圖片。實(shí)施例10納米環(huán)丙沙星顆粒對生物被膜形成的抑制及生物被膜菌清除作用（1）Cip對生物被膜形成的抑制在構(gòu)建測定生物被膜過程中，培養(yǎng)基加入Cip濃度為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC和1/16MIC的Cip或者納米環(huán)丙沙星顆粒，比較二者對生物被膜形成的抑制作用。（2）納米環(huán)丙沙星顆粒對生物被膜菌清除作用分別選取Cip濃度為4MIC、2MIC、MIC和1/2MIC的納米環(huán)丙沙星顆?；駽ip，對已在載玻片上形成的生物被膜進(jìn)行1h、2h和6h三個處理時間點(diǎn)的生物被膜菌清除作用。生物被膜內(nèi)銅綠假單胞菌數(shù)量檢測采用稀釋涂布法，即將生物被膜樣品用無菌PBS漂洗三次之后，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，超聲處理2min破壞生物被膜，使得菌游離出來，稀釋適當(dāng)?shù)奶荻群笸坎加?jì)數(shù)。被膜內(nèi)菌的清除率(Clearancerate，CR)計(jì)算公式如下：CR（CFU）=［(CFU空白對照－CFU清除后)/CFU空白對照］×100%。圖5為快速銀染法和掃描電鏡檢測納米環(huán)丙沙星顆粒抑制PAO1生物被膜，A：銀染鑒定；B：電鏡掃描鑒定。從生物被膜的形成量來看，空白的納米環(huán)丙沙星顆粒對PAO1生物被膜的形成無抑制作用，對于納米環(huán)丙沙星顆粒和單純的Cip來說，隨著亞抑制濃度的倍比減小，生物被膜的量呈現(xiàn)增加的趨勢，且Cip組的生物被膜量菌大于納米環(huán)丙沙星顆粒組，說明納米環(huán)丙沙星顆粒對PAO1菌株生物被膜的形成起到了一定的抑制作用。銀染法鑒定，從顯微照片來看，生物被膜經(jīng)過銀染后呈現(xiàn)出棉絮狀膜樣的黑色物。與對照組相比較，Cip組和納米環(huán)丙沙星顆粒組的圖像中生物被膜呈現(xiàn)不同程度散落的黑點(diǎn)或黑斑狀，從1/2MIC至1/16MIC，生物被膜的密集程度增加，由開始的散落的黑點(diǎn)和黑斑狀逐漸擴(kuò)展粘連成棉絮狀，說明隨著Cip濃度的減小，生物被膜的形成量也在逐漸增加，密集程度也再增加。但是Cip-NPs組前三個大濃度則呈較舒散的黑斑狀，說明納米抗生素顆粒對PAO1生物被膜的作用效果存在差異。掃描電鏡結(jié)果更加清晰和直觀的展示了組內(nèi)和組間的差異。相對Cip組，Cip-NPs組的看起來更疏松，表面粘稠狀高低隆起狀也很明顯，散落的菌體數(shù)量較多，這說明納米環(huán)丙沙星顆粒在PAO1菌株生物被膜形成的過程中起到了一定的抑制作用。圖6為激光共聚焦顯微鏡檢測納米環(huán)丙沙星顆粒在抑制生物被膜形成過程中對其厚度的影響。采用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記野生型的PAO1，之后用激光共聚焦顯微鏡逐層掃描生物被膜的厚度，疊加起來即為整個生物被膜的厚度。掃描之后對每個樣品的圖片堆進(jìn)行三維重建，得到樣品的3D圖像，這樣就可以很清晰直觀的看到綠色熒光標(biāo)記的生物被膜的立體高度以及生物被膜的疏密程度。如圖顯示，從Cip組和Cip-NPs組的掃描結(jié)果，隨著亞MIC濃度的梯度降低，生物被膜的量逐漸增多，厚度也隨著加厚，說明Cip對PAO1生物被膜的形成有抑制作用；在四個亞MIC濃度下，納米環(huán)丙沙星顆粒組的生物被膜厚度均顯著小于Cip組(p<0.05)，說明制備的納米環(huán)丙沙星顆粒對PAO1生物被膜的形成抑制作用強(qiáng)于單純的未包裹的Cip水溶液，說明納米環(huán)丙沙星顆粒對PAO1生物被膜的厚度增加有一定的抑制作用。圖7為納米環(huán)丙沙星顆粒對生物被膜形成的抑制及生物被膜內(nèi)部細(xì)菌的清除作用。在生物被膜菌清除實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，隨著Cip濃度的增大，生物被膜菌清除率整體明顯呈現(xiàn)增大趨勢，被膜菌清除率很明顯增大，而且隨著處理時間的延長，被膜菌清除率也呈現(xiàn)增大趨勢。然而，Cip組和Cip-NPs在處理1Hr和2Hr的時候，只有1/2MIC和MIC兩個濃度Cip組的清除率明顯高于Cip-NPs(p<0.05)，其他濃度均為Cip-NPs的清除率稍高，但無顯著差異；在處理6Hr的時，在高于MIC值濃度下，在2h時，2MIC濃度下，Cip-NPs組的清除率高于Cip(p<0.05)；在6Hr時，4MIC濃度下，Cip-NPs組的清除率顯著高于Cip組(p<0.05)，且清除率已超過80%。造成這種不同的原因可能是納米環(huán)丙沙星顆粒的緩釋作用，在剛開始處理的時候，Cip組是高濃度的暴露在生物被膜環(huán)境中的，而納米環(huán)丙沙星顆粒還被載體分子保護(hù)在顆粒里面或者吸附在顆粒上而沒有釋放出來，以至于到處理時間延長的情況下才逐步釋放出來，達(dá)到單純Cip的效果。當(dāng)前第1頁1 2 3