本發(fā)明涉及中藥
技術領域：
，尤其涉及靈芝孢子油及其脂肪乳劑的制備技術，具體涉及一種靈芝孢子油及其脂肪乳劑在抗腫瘤中的應用。
背景技術：
：靈芝孢子(Ganodermalucidiumspore)是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來極其細小的孢子，為靈芝的生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質?，F(xiàn)代藥理研究表明，靈芝孢子具有抗腫瘤、增強免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、降血糖、降血脂、抗缺氧能力、抗炎、清除自由基等作用。靈芝及靈芝孢子化學成分復雜，具有廣泛的生物學活性，其中多糖和三萜兩大類活性物質被認為是主要功效成分。靈芝孢子油是靈芝孢子經(jīng)破壁、超臨界二氧化碳萃取所得脂溶性活性物質，主要以甘油三酯類化合物存在，還有少量的游離脂肪酸、類固醇酯及三萜類成分，現(xiàn)代研究表明具有抗腫瘤、增強免疫力、保肝護肝等功效。目前，大部分研究均認為靈芝孢子油具有增強免疫力及抗腫瘤作用是由于其富含靈芝三萜類化合物，因此，對靈芝孢子油的成分研究主要偏重于靈芝三萜類化合物的富集，而對靈芝孢子油中甘油三酯類化合物的成分研究和功效分析，目前尚未見有相關報道。市面上大多數(shù)的靈芝孢子油分離工藝得到的孢子油需經(jīng)過脫酸、脫臭等常規(guī)精煉工序后，才能得到符合食用油衛(wèi)生標準的靈芝孢子油，而精煉工序會使得產(chǎn)品中特有的三萜酸、麥角甾醇、脂溶性維生素等功效成分損失。靈芝孢子油根據(jù)其制備工藝的不同，成品的活性成分也有不同，對抗腫瘤的功效也不同，因此，通過對靈芝孢子油制備工藝的研發(fā)獲得藥效更好的靈芝孢子油，不但能夠更好地造福病患，而且具有廣闊的市場價值。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種以油酸單不飽和脂肪酸為主，產(chǎn)品酸值和過氧化值等衛(wèi)生指標符合食用油衛(wèi)生標準，且產(chǎn)品中靈芝酸、麥角甾醇、脂溶性維生素等功效成分保留較好的靈芝孢子油。本發(fā)明的另一個目的是提供上述靈芝孢子油在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明的另一個目的在于提供以上述靈芝孢子油為主要成分通過高壓均質技術制備的靈芝孢子油口服乳劑。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現(xiàn)的：本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子油的抗腫瘤作用與其特有甘油三酯類成分關系更加密切，其三萜類成分與甾醇成分在油中含量雖然不高，但其抗腫瘤活性也是確切的。因此本發(fā)明人創(chuàng)新性地開發(fā)出一種新型靈芝孢子油的制備工藝，并且驗證了該靈芝孢子油具有很好的抗腫瘤功效。一種靈芝孢子油，其特征在于該靈芝孢子油是由如下方法制備而得：步驟1將靈芝孢子粉經(jīng)低溫振蕩破壁后，得到破壁靈芝孢子粉，破壁率大于95％；步驟2將破壁靈芝孢子粉與乙醇攪拌混合后制粒，得到破壁靈芝孢子顆粒，并將破壁靈芝孢子顆粒進行干燥處理；步驟3將步驟2干燥處理后的破壁靈芝孢子粉顆粒放置于超臨界CO2萃取釜中，進行超臨界CO2萃取，萃取釜的萃取壓力為28～32MPa，萃取釜的萃取溫度為38～42℃；通過分離釜進行兩級分離，分離釜I的分離壓力為10～14MPa，分離釜I的分離溫度為43～47℃，分離釜II的分離壓力為5～7MPa，分離釜II的分離溫度為38～42℃；從分離釜Ⅰ中收集靈芝孢子油，直至萃取完全。上述步驟1中，靈芝孢子粉采用市售的靈芝孢子粉，優(yōu)選采用符合表1所述質量標準的市售的靈芝孢子粉。表1市售靈芝孢子粉的質量標準項目質量指標性狀為棕色或棕褐色干燥粉末，無結塊氣味、滋味具有靈芝孢子粉固有的氣味和滋味，微苦，無異味水分，％≤8.0灰分，％≤3.0酸值(以脂肪計)(以KOH計)，(mg/g)≤10過氧化值(以脂肪計)，(g/100g)≤0.25上述步驟1中，低溫振蕩破壁的參數(shù)條件為：破壁溫度為-16℃～-12℃，破壁時間為40～70分鐘；優(yōu)選破壁溫度為-14℃，破壁時間為55分鐘。上述步驟2中，乙醇采用質量百分比濃度為95％的乙醇溶液；破壁靈芝孢子粉與乙醇的重量比為5：2.5～5：3.5；優(yōu)選破壁靈芝孢子粉與乙醇的重量比為5：3。上述步驟2中，將破壁靈芝孢子粉與乙醇攪拌混合后制粒是采用濕法制粒，先將破壁靈芝孢子粉與乙醇攪拌混合10～30分鐘，然后擠壓過篩制粒，篩網(wǎng)目數(shù)為14目。上述步驟2中，破壁靈芝孢子顆粒的干燥處理溫度為45℃～49℃，干燥時間為4h～8h，干燥至干顆粒水分含量≤7.0％。本發(fā)明靈芝孢子油的成分檢測顯示：該靈芝孢子油中主要含六種含油酸的甘油三酯類化合物，這六種含油酸的甘油三酯類化合物的含量之和約占靈芝孢子油總質量的50％～80％，其含量具體如下所示：(1)甘油三油酸酯(簡稱OOO，C57H104O12)，占靈芝孢子油總質量的12.5％～23.5％；(2)1,2-二油酸-3-棕櫚酸-甘油三酯(簡稱OOP，C55H102O6)，占靈芝孢子油總質量的12.8％～23.8％；(3)1,2-二油酸-3-亞油酸-甘油三酯(簡稱OOL，C57H102O6)，占靈芝孢子油總質量的7.6％～14.1％；(4)1-棕櫚酸-2-油酸-3-亞油酸-甘油三酯(簡稱POL，C55H100O6)，占靈芝孢子油總質量的5.2％～9.7％；(5)1,3-二棕櫚酸-2-油酸-甘油三酯(簡稱POP，C55H102O6)，占靈芝孢子油總質量的3.40％～3.70％；(6)1,2-二亞油酸-3-油酸-甘油三酯(簡稱LLO，C57H100O6)，占靈芝孢子油總質量的5.80％～6.10％。本發(fā)明的靈芝孢子油，其性能檢測結果為：相對密度0.912～0.920，折光率1.460～1.480，碘值78～95g/100g，皂化值186～199mg/g，不皂化物≤15g/kg，酸值≤3.0mg/g，過氧化值≤0.25g/100g，水分及揮發(fā)物≤0.2％，脂肪酸組成(％)：棕櫚酸12～17，硬脂酸2.7～4.0，油酸52～64，亞油酸12～18，亞麻酸ND～3.3。本發(fā)明的靈芝孢子油經(jīng)實驗驗證對腫瘤細胞的生長具有很好的抑制作用，因此，可用本發(fā)明的靈芝孢子油與藥學上可接受的輔料制備抗腫瘤的脂肪乳劑，如口服劑、注射劑等。本發(fā)明還提供一種以上述靈芝孢子油為主要成分的靈芝孢子油脂肪乳，該靈芝孢子油脂肪乳的原料配方是由如下重量份數(shù)的各組分組成：上述維生素E、磷脂和甘油均采用市售產(chǎn)品即可實現(xiàn)本發(fā)明。步驟1油相制備：分別稱取靈芝孢子油和磷脂，將靈芝孢子油預熱至40℃，在高剪切分散乳化機攪拌下，少量多次把靈芝孢子油加至磷脂中，停止攪拌放置5分鐘后繼續(xù)攪拌至分散均勻，加熱至65～70℃，制備得到油相；水相制備：分別量取甘油和純化水，把甘油加至純化水中，混合均勻，加熱到65～70℃，制備得到水相；步驟2初乳的制備：在高剪切分散乳化機的攪拌下，將油相緩緩加入水相中攪拌8～10分鐘制成初乳，并用質量百分比濃度為5％的氫氧化鉀溶液適量調(diào)初乳的pH值至7.0～9.0；步驟3均質：將制備好的初乳置于高壓均質設備中，在25～50MPa的壓力下反復均質3～6次，則制備得到所需靈芝孢子油脂肪乳。上述步驟1和步驟2中，所述高剪切分散乳化劑的轉速為10000r/min～30000r/min。本發(fā)明的靈芝孢子油脂肪乳經(jīng)實驗證明具有一定抑制化療引起的白細胞、紅細胞、血紅蛋白降低的作用，也有一定改善肝臟功能的作用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1.本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子油酸敗嚴重程度受制備及儲存過程中溫度、水分的影響很大，因此本發(fā)明人在研究中強調(diào)制備過程溫度及水分控制以保持產(chǎn)品的新鮮度，包括低溫破壁、破壁孢子粉顆粒的低溫干燥，超臨界二氧化碳萃取和分離溫度均控制在一定溫度范圍，從而有效避免了靈芝孢子油酸敗。2.本發(fā)明的超臨界二氧化碳萃取采用設備自身的兩級分離功能，對分離溫度和壓力等參數(shù)進行了優(yōu)化，使分離后的孢子油不需再進行任何脫酸、脫臭等常規(guī)精煉工序，產(chǎn)品酸值、過氧化值等衛(wèi)生指標已達到食用油衛(wèi)生標準，且更好地保留了產(chǎn)品特有的三萜酸、麥角甾醇、脂溶性維生素等功效成分。3.本發(fā)明通過研發(fā)特定的制備工藝而獲得藥效更好的靈芝孢子油，該靈芝孢子油既富含以油酸為主的單不飽和脂肪酸，又保留了靈芝特有的三萜酸、麥角甾醇、脂溶性維生素等功效成分，具有很好的抗腫瘤活性。4.本發(fā)明的靈芝孢子油中富含甘油三酯類化合物，對腫瘤細胞的生長具有很好的抑制作用，且本發(fā)明通過均質技術將該靈芝孢子油開發(fā)成O/W型的口服乳劑，與傳統(tǒng)的膠囊劑相比，本發(fā)明的靈芝孢子油脂肪乳服用方便、活性成分更利于人體吸收，生物利用度高；5.本發(fā)明的靈芝孢子油及其脂肪乳劑均具有抑制腫瘤細胞的作用，且靈芝孢子油在與抗腫瘤藥物共用時，起到很好的增效作用，同時又能減輕放化療的毒副作用，提高腫瘤患者的生活質量。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步地描述，但具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1靈芝孢子油本實施例靈芝孢子油的制備過程如下所示：步驟1破壁本實施例的靈芝孢子粉采用市售的靈芝孢子粉，該市售的靈芝孢子粉的水分≤8.0％，灰分≤3.0％，酸值(以脂肪計)≤10mg/g，過氧化值(以脂肪計)≤0.25g/100g；將靈芝孢子粉置于貝利微粉機料盒中，設定破壁時間為55分鐘，破壁溫度為-14℃，得到破壁靈芝孢子粉；步驟2制粒稱取60kg步驟1制備的破壁靈芝孢子粉加入CH-200槽型混合機，按照破壁靈芝孢子粉：乙醇＝5：3的重量比，向CH-200槽型混合機中加入質量百分比濃度為95％的乙醇，上蓋，攪拌混合20分鐘，使物料達到“捏之成團，壓之則散”，然后擠壓過篩制粒，篩網(wǎng)目數(shù)為14目，得到破壁靈芝孢子顆粒；將上述破壁靈芝孢子顆粒均勻鋪放于CT-C熱風循環(huán)烘箱不銹鋼托盤上，攤平，物料的厚度不得超過盤高度的2/3；干燥溫度控制在45℃，干燥時間為8h，每30分鐘記錄一次干燥溫度，控制干顆粒水分≤7.0％時，出車；步驟3稱取步驟2干燥處理后的破壁靈芝孢子顆粒3kg投進超臨界CO2萃取釜中，進行超臨界CO2萃取，萃取釜的萃取壓力29MPa，萃取釜的萃取溫度為42℃；通過分離釜進行兩級分離，分離釜I的壓力為10MPa，分離釜I的分離溫度45℃，分離釜II的分離壓力為7MPa，分離釜II的分離溫度為40℃，從分離釜Ⅰ中收集靈芝孢子油，直至萃取完全。對本實施例制備的靈芝孢子油進行性能測試，結果如下所示：本實施例制備所得靈芝孢子油的相對密度0.9156，折光率1.4696，碘值88.46g/100g，皂化值193.62mg/g，不皂化物≤1.00g/kg，酸值≤2.09mg/g、過氧化值≤0.13g/100g、水分≤0.07％，脂肪酸組成(％)：棕櫚酸13，硬脂酸3.3，油酸61，亞油酸13，亞麻酸ND。實施例2靈芝孢子油本實施例靈芝孢子油的制備過程如下所示：步驟1破壁本實施例的靈芝孢子粉采用市售的靈芝孢子粉，該市售的靈芝孢子粉的水分≤8.0％，灰分≤3.0％，酸值(以脂肪計)≤10mg/g，過氧化值(以脂肪計)≤0.25g/100g；將靈芝孢子粉置于貝利微粉機料盒中，設定破壁時間為70分鐘，破壁溫度為-16℃，得到破壁靈芝孢子粉；步驟2制粒稱取60kg破壁靈芝孢子粉加入CH-200槽型混合機，按照破壁靈芝孢子粉：乙醇＝5：3.5的重量比，向CH-200槽型混合機中加入質量百分比濃度為95％的乙醇，上蓋，攪拌混合20分鐘，使物料達到“捏之成團，壓之則散”，然后擠壓過篩制粒，篩網(wǎng)目數(shù)為14目，得到破壁靈芝孢子顆粒；將破壁靈芝孢子顆粒均勻鋪放于CT-C熱風循環(huán)烘箱不銹鋼托盤上，攤平，物料的厚度不得超過盤高度的2/3；干燥溫度控制在49℃，干燥時間為6h，每30分鐘記錄一次干燥溫度，控制干顆粒水分≤7.0％時，出車；步驟3稱取步驟2干燥處理后的破壁靈芝孢子顆粒7kg投進超臨界CO2萃取釜中，進行超臨界CO2萃取，萃取釜的萃取壓力30MPa，萃取釜的萃取溫度為41℃；通過分離釜進行兩級分離，分離釜I的分離壓力為12MPa，分離釜I的分離溫度46℃，分離釜II的分離壓力為6MPa，分離釜II的分離溫度為42℃，從分離釜Ⅰ中收集靈芝孢子油，直至萃取完全。對本實施例制備的靈芝孢子油進行性能測試，結果如下所示：本實施例制備所得靈芝孢子油的相對密度0.9154，折光率1.4700，碘值88.0g/100g，皂化值196mg/g，不皂化物≤0.96g/kg，酸值≤2.0mg/g，過氧化值≤0.17g/100g，水分≤0.05％。脂肪酸組成(％)：棕櫚酸15.8，硬脂酸3.1，油酸61.3，亞油酸15，亞麻酸ND。實施例3靈芝孢子油功能實驗本實施例對實施例1制備的靈芝孢子油的抗腫瘤功能進行實驗研究。1、細胞株和實驗動物細胞株：肝癌H22細胞株，由中山大學實驗動物中心細胞庫提供并復蘇。試驗動物：SPF級BALB/C裸鼠，5-6W，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。2、本實施例分為8個實驗組；各組給藥劑量、濃度以及給藥途徑具體如下所示：(1)對照組：生理鹽水，0.2ml/10g小鼠，每天1次尾靜脈注射；(2)靈芝孢子多糖口服組：靈芝孢子多糖(靈芝孢粉水提物)用水配置成濃度為0.5g/ml的靈芝孢子多糖溶液；量取5ml靈芝孢子多糖溶液用生理鹽水補至總體積為10ml，制備得到靈芝孢子多糖口服組試劑，將該試劑按照0.2ml/10g小鼠的量，每天1次灌胃給小鼠；靈芝孢子多糖口服組的給藥劑量為5.0g生藥/kg；(3)靈芝孢子三萜口服組：靈芝孢子三萜(靈芝孢子粉60％醇提物)用水配置成濃度為0.5g/ml的靈芝孢子三萜溶液；量取5ml靈芝孢子三萜溶液用生理鹽水補至總體積為10ml，制備得到靈芝孢子三萜口服組試劑，將該試劑按照0.2ml/10g小鼠的劑量，每天1次灌胃給小鼠；靈芝孢子三萜口服組的給藥劑量為5.0g生藥/kg；(4)靈芝孢子油口服組：取步驟1制備的靈芝孢子油5ml用生理鹽水補至10ml，然后按照0.2ml/10g小鼠的劑量，每天1次灌胃給小鼠；靈芝孢子油口服組的給藥劑量為1.0g生藥/kg(按靈芝孢子油算)；(5)靈芝孢子油注射組：取步驟1制備的靈芝孢子油5ml用生理鹽水補至10ml，然后按照0.2ml/10g小鼠的劑量，每天1次給小鼠進行尾靜脈注射；靈芝孢子油注射組的給藥劑量為1.0g生藥/kg(按靈芝孢子油算)；(6)康萊特注射液注射組：將市售的康萊特注射液(規(guī)格100ml；10g)按照0.26ml/10g小鼠的劑量，每天1次尾靜脈注射；康萊特注射液注射組的給藥劑量為2.6g生藥/kg；(7)大豆油注射組：將市售的大豆油按照0.2ml/10g小鼠的劑量，每天1次給小鼠進行腹腔注射；大豆油注射組的給藥劑量為20ml/kg；(8)注射用環(huán)磷酰胺(注射)組：市售的注射用環(huán)磷酰胺規(guī)格為0.2g/瓶，取1瓶注射用環(huán)磷酰胺用生理鹽水溶解并定容至133ml，然后按照0.2ml/10g小鼠的劑量，給小鼠進行腹腔注射；注射用環(huán)磷酰胺(注射)組的給藥劑量為30mg/kg；注射用環(huán)磷酰胺(注射)組簡稱CTX組。3、實驗過程荷瘤鼠制備：將肝癌H22細胞進行復蘇，細胞計數(shù)后調(diào)成約2×106/0.2ml接種于裸鼠腹腔7d傳代，將第三代計數(shù)用于試驗。抽取接種7d左右種鼠腹水，呈乳白色，D-Hanks液洗滌離心(800r/min×5min)3次，調(diào)整細胞濃度至1×107/ml，臺盼藍拒染法檢測存活率≥95％，將細胞懸液注射至健康小鼠右腋皮下,每只鼠0.2ml，全程嚴格無菌操作，60min內(nèi)完成。接種第2天，將小鼠按上述8個實驗組進行分組，每組12只，同時進行給藥：1-7組(也就是對照組、靈芝孢子多糖口服組、靈芝孢子三萜口服組、靈芝孢子油口服組、靈芝孢子油注射組、康萊特注射液注射組和大豆油注射組)均每日1次，連續(xù)給藥7天；注射用環(huán)磷酰胺(注射)組是隔3天給藥一次，共給藥2次。4、測定指標和實驗結果于給藥前以及給藥后7d進行體重稱量；于末次給藥24h后處死裸鼠，將腫瘤剝除后馬上重量，計算抑制率(所有實驗數(shù)據(jù)均以表示，由SSPS13.0數(shù)據(jù)處理軟件行方差分析和組間t檢驗)，結果如表2所示。表2靈芝孢子有效部位對裸鼠H22肝癌的腫瘤生長抑制作用注：d1、d8：接種后第1、8天；與對照組比較，*為P<0.05**為P<0.01.由表2可見，靈芝孢子油口服組、靈芝孢子油注射組、康萊特注射液注射組和CTX組均能明顯抑制裸鼠H22肝癌的生長作用(與對照組比較，P<0.05或P<0.01)，抑制率分別為30.78％、48.14％、38.63％和68.28％；靈芝孢子多糖口服組和靈芝孢子三萜口服組也有一定的抑制作用，但與對照組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，抑制率分別為17.76％、26.29％；大豆油注射組抑制率為3.31％。綜上所述，本發(fā)明的靈芝孢子油確實具有很好的腫瘤細胞抑制作用，與陽性對照康萊特注射液效果接近。實施例4靈芝孢子油脂肪乳本實施例的靈芝孢子油脂肪乳的原料配方是由如下重量份數(shù)的各組分組成：上述靈芝孢子油為實施例1制備的靈芝孢子油，維生素E、磷脂和甘油均采用市售產(chǎn)品。本實施例靈芝孢子油脂肪乳的制備方法包括如下步驟：步驟1水相的制備：分別稱取靈芝孢子油和磷脂，將靈芝孢子油預熱至40℃，在高剪切分散乳化機攪拌下，高剪切分散乳化劑的轉速為30000r/min，少量多次把靈芝孢子油加至磷脂中，停止攪拌放置5分鐘后繼續(xù)攪拌至分散均勻，加熱至70℃，制備得到油相；水相制備：分別量取甘油和純化水，把甘油加至純化水中，混合均勻，加熱到70℃，制備得到水相；步驟2初乳的制備：在高剪切分散乳化機的攪拌下，高剪切分散乳化劑的轉速為30000r/min，將油相緩緩加入水相中攪拌10分鐘制成初乳，并用質量百分比濃度為5％的氫氧化鉀溶液適量調(diào)初乳的pH值至8.0；步驟3均質：將制備好的初乳置于高壓均質設備中，在35MPa的壓力下反復均質5次，則制備得到本實施例的靈芝孢子油脂肪乳。實施例5靈芝孢子油脂肪乳的抗腫瘤及增效減毒作用本實施例對實施例4制備的靈芝孢子油脂肪乳進行增效減毒作用的實驗。1、實驗材料市售的玉米油；實施例4制備的靈芝孢子油脂肪乳；市售的康萊特軟膠囊(規(guī)格為0.45g/粒)；注射用環(huán)磷酰胺(規(guī)格為0.2g/瓶)；市售的0.9％氯化鈉注射液(生理鹽水)。2、細胞株和實驗動物細胞株：肝癌H22細胞株，由中山大學實驗動物中心細胞庫提供并復蘇。試驗動物：SPF級昆明小鼠，6W，雄性，由中山大學實驗動物中心提供。3、實驗分組及劑量設計本實施例分為8個實驗組，具體的分組及劑量設計如表3所示。表3實驗分組以及劑量設計4、實驗方法與結果荷瘤鼠制備：復蘇肝癌H22細胞，以每只小鼠細胞數(shù)量約為5×106分別接種于3只小鼠腹腔后約10d。在無菌條件下(超凈臺或接種罩)對荷瘤鼠抽取腹水，用生理鹽水清洗并計數(shù)H22細胞1×107/ml，以0.1ml/只接種到130只小鼠腋下靠背部皮下，待腫瘤長至約50mm3以上，選擇合格動物隨機分成8個實驗組，每組10只。8個實驗組的給藥情況如下所示：(1)玉米油對照組：本組的實驗小鼠是灌胃給予0.2ml/10g的玉米油，每天1次，連續(xù)14d；(2)CTX組(也就是注射用環(huán)磷酰胺組)：按照表2的給藥劑量將注射用環(huán)磷酰胺給予小鼠腹腔注射，隔日1次，共7次；(3)CTX+靈芝孢子油脂肪乳低劑量組：本組的實驗小鼠是要腹腔注射環(huán)磷酰胺和灌胃靈芝孢子油脂肪乳；如表2所示，靈芝孢子油脂肪乳的給藥劑量為0.4g/kg，每天1次灌胃給小鼠，連續(xù)14天；注射用環(huán)磷酰胺的給藥劑量為30mg/kg，隔日1次給小鼠腹腔注射，共7次；(4)CTX+靈芝孢子油脂肪乳高劑量組；本組的實驗小鼠是要腹腔注射環(huán)磷酰胺和灌胃靈芝孢子油脂肪乳；如表2所示，靈芝孢子油脂肪乳的給藥劑量為1.2g/kg，每天1次灌胃給小鼠，連續(xù)14天；注射用環(huán)磷酰胺的給藥劑量為30mg/kg，隔日1次給小鼠腹腔注射，共7次；(5)靈芝孢子油脂肪乳低劑量組：靈芝孢子油脂肪乳的給藥劑量為0.4g/kg，每天給小鼠灌胃1次，連續(xù)14天；(6)靈芝孢子油脂肪乳高劑量組：靈芝孢子油脂肪乳的給藥劑量為1.2g/kg，每天給小鼠灌胃1次，連續(xù)14天；(7)康萊特軟膠囊組：康萊特軟膠囊的給藥劑量為1.8g/kg，每天給小鼠灌胃1次，連續(xù)14天；康萊特軟膠囊組為陽性對照組；(8)CTX+康萊特軟膠囊組：本組的實驗小鼠是要腹腔注射環(huán)磷酰胺和灌胃康萊特軟膠囊；如表2所示，康萊特軟膠囊的給藥劑量為1.8g/kg，每天1次灌胃給小鼠，連續(xù)14天；注射用環(huán)磷酰胺的給藥劑量為30mg/kg，隔日1次給小鼠腹腔注射，共7次。5、測定指標末次給藥24h檢測各項指標。①于給藥前以及給藥后每周進行體重稱量，以及作一般狀態(tài)觀察；②每天對每籠動物進行進食量測定(稱量放的飼料和剩余飼料重量)；③每周測量瘤體積(給藥前、1W、2W)，于末次給藥24h后小鼠處死，將腫瘤剝除后馬上重量，計算抑制率；④記錄死亡動物，并計算死亡率；⑤檢測血常規(guī)指標：WBC(白細胞數(shù))、RBC(紅細胞數(shù))、HGB(血紅蛋白)、PLT(血小板數(shù))等；⑥網(wǎng)織紅細胞數(shù)：取血10μL加入100μL的煌焦油藍酒精溶液中，充分混合,放置10min，取2～3滴在干燥玻片的一端，立即推片，在顯微鏡油鏡下計數(shù)1000個紅細胞中的網(wǎng)織紅細胞，將結果換算成網(wǎng)織紅細胞百分數(shù)；玻片涂片染色，顯微鏡下計數(shù)測定；⑦檢測脾、胸腺系數(shù)和脾結節(jié)數(shù)：臟器系數(shù)＝臟器重量/體重×1000；脾結節(jié)：取脾臟，稱重之后浸泡于苦味酸福爾馬林中，密封浸泡24小時之后，取出；在4倍解剖顯微鏡下觀察，目測計數(shù)脾臟表面的結節(jié)數(shù)；⑧骨髓有核細胞數(shù)(BMNC)：動物處死，取右側完整股骨，用3％醋酸液10ml沖出全部骨髓，使成單細胞懸液，顯微鏡下，在血細胞計數(shù)板上計BMNC；⑨檢測肝功能和腎功能指標：末次給藥24h后小鼠取血分離血清檢測ALT(谷丙轉氨酶)、AST(谷草轉氨酶)、BUN(尿素氮)、CR(肌酐)。所有實驗數(shù)據(jù)均以表示，由SSPS13.0數(shù)據(jù)處理軟件行方差分析和組間t檢驗。6、實驗結果(1)8個實驗組對肝癌H22瘤鼠腫瘤體積影響如表4所示。表4對H22瘤鼠腫瘤體積(mm3)影響(N＝8-10,)與對照組比較：*為P<0.05，**為P<0.01；與CTX組比較，#為P<0.05，##為P<0.01。由表4可見，給藥7d，與對照組相比，各給藥組對腫瘤均有抑制作用趨勢，與CTX合用各組趨勢尤明顯，但無明顯統(tǒng)計學差異（與對照組比P＞0.05）；給藥14d，與對照組相比，CTX單獨給藥組、CTX+靈芝孢子油脂肪乳低劑量組、CTX+靈芝孢子油脂肪乳高劑量組、CTX+康萊特軟膠囊組均能明顯抑制小鼠H22實體瘤的生長（P<0.05或P<0.01），單獨給藥的靈芝孢子油脂肪乳的低劑量組和高劑量組也有一定的作用趨勢，但與對照組比較均P＞0.05；與CTX單獨給藥組相比，各聯(lián)合用藥組均有增強抑制腫瘤生長作用趨勢，靈芝孢子油脂肪乳與CTX的聯(lián)合用藥組略明顯些，但無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。由上述分析可知，靈芝孢子油脂肪乳對抗腫瘤藥物的藥效有一定的增效作用。（2）8個實驗組對肝癌H22瘤鼠瘤重、抑制率和死亡率的影響如表5所示。表5對H22瘤鼠給藥14天瘤重、抑制率、動物死亡率的影響(N=8-10,)與對照組比較：*0.01<P<0.05**P<0.01；與CTX組比較，#為P<0.05，##為P<0.01。由表5可見，通過腫瘤重量進行分析：給藥14d，與對照組相比，給藥治療各組均有一定的抑制作用，其中CTX單獨給藥組、CTX+靈芝孢子油脂肪乳低劑量組、CTX+靈芝孢子油脂肪乳高劑量組、CTX+康萊特軟膠囊組能明顯抑制小鼠H22實體瘤的生長（與對照組比P<0.05），其抑制率分別為：55.03%、61.09%、65.59%、59.03%；各合用組與CTX單獨給藥組相比均有加強抑制作用趨勢，但無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；說明，靈芝孢子油脂肪乳對抗腫瘤藥物的藥效有一定的增效作用。由表5可見，實驗給藥治療14d，對照組裸鼠死亡率為10%；與對照組比較，其它各給藥組死亡率均均為0-20%之間，未見明顯組檢差異，動物死亡原因很可能都是油液體難以灌胃而導致嗆死為主。（3）8個實驗組對肝癌H22瘤鼠血常規(guī)的影響如表6所示。表6對H22瘤鼠血常規(guī)的影響(N=8-10,)與對照組比較：*為P<0.05，**為P<0.01；與CTX組比較，#為P<0.05，##為P<0.01。由表6可見，實驗給藥治療14d時，與對照組相比，CTX單獨給藥組WBC、HGB均明顯降低（P<0.01），RBC也有降低趨勢，但無明顯統(tǒng)計學差異；與單獨環(huán)磷酰胺組相比，各聯(lián)合用藥組均有一定的改善趨勢，其中CTX+靈芝孢子油脂肪乳高劑量組組明顯升高（P<0.01）；CTX+靈芝孢子油脂肪乳高劑量組可明顯提升HGB（血紅蛋白）的含量（與CTX組比P<0.05）；說明，靈芝孢子油脂肪乳有一定抑制化療引起的白細胞、紅細胞、血紅蛋白降低的作用。（4）8個實驗組對肝癌H22瘤鼠肝功能和腎功能的影響如表7所示。表7H22瘤鼠肝功能和腎功能的影響(N=8-10,)與對照組比較：#為P<0.05,##為P<0.01；與CTX組比較，*為P<0.05，**為P<0.01。由表7可見，實驗給藥治療14d時，與對照組相比，CTX單獨給藥組腎功能指標BUN明顯升高（P<0.05），其它肝功能指標AST、ALT和腎功能指標Cr改變不明顯；與單獨環(huán)磷酰胺組相比，CTX+靈芝孢子油脂肪乳低劑量組可顯著降低AST、ALT（P<0.05），CTX+靈芝孢子油脂肪乳高劑量組可顯著降低AST（P<0.015），其它組未見明顯改變（P＞0.05）；說明，靈芝孢子油脂肪乳可能有一定改善肝臟功能作用。（5）8個實驗組對肝癌H22瘤鼠脾系數(shù)、胸腺系數(shù)、骨髓有核細胞數(shù)、網(wǎng)織紅數(shù)和脾結節(jié)數(shù)的影響如表8所示。表8對H22瘤鼠脾系數(shù)、胸腺系數(shù)、骨髓有核細胞數(shù)、網(wǎng)織紅數(shù)、脾結節(jié)數(shù)的影響(N=7-10,)與對照組比較：#為P<0.05,##為P<0.01；與CTX組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；聯(lián)合用藥各組與CTX組比較，無統(tǒng)計學差異.由表8可見，實驗給藥治療14d時，與對照組相比，CTX單獨給藥組胸腺指數(shù)、骨髓有核細胞數(shù)（BMNC）、網(wǎng)織紅細胞、脾結節(jié)降低或減少（P<0.05或0.01）；與單獨環(huán)磷酰胺組相比，各聯(lián)合用藥組對各指標均有一定的改善趨勢，但無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。當前第1頁1 2 3