本發(fā)明涉及一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途及基于此用途的組合物，特別是一種黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護神經細胞的用途，以及保護神經細胞組合物。
背景技術：
隨著醫(yī)療、食品科技進步及經濟成功的發(fā)展，人類平均壽命得以延長，并已漸漸步入老年人社會。老化所衍生的疾病包含免疫失調、癌癥、心血管疾病、神經退化病癥及代謝癥候群等。其中后兩者所帶來的龐大醫(yī)療、社會成本及家庭生活品質的受損，乃不容忽視。
人類的神經系統(tǒng)可分為中樞神經系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)，其中中樞神經系統(tǒng)包含腦、小腦和脊髓等。神經系統(tǒng)的基本結構單位是神經元，或稱神經細胞，而成人的中樞神經系統(tǒng)的神經細胞是分化的神經細胞，不能再分裂和增殖，一旦損傷或死亡，即會造成永久性的功能喪失。因此，需要一種方法來保護神經細胞免于受傷、退化或死亡。
黑柄炭角菌(Xylaria nigripe)隸屬于炭角菌目(Xylariales)、炭角菌科(Xylariaceae)及炭角菌屬(Xylaria)，是一種中國傳統(tǒng)的藥用真菌，通常生長在廢棄白蟻巢穴，其菌絲體形成的菌核即是中國傳統(tǒng)的中藥材料“烏靈參”，又稱作烏靈菌、雷震子等。根據四川《中藥志》記載，烏靈參有“補心腎、治失眠”療效的描述，其具有補氣固腎、健脾除濕及鎮(zhèn)定安神等多種生理活性。
因野生資源逐漸匱乏，黑柄炭角菌有采集不易與品質不穩(wěn)定的問題。目前開始以人工液態(tài)培養(yǎng)黑柄炭角菌菌絲體，是解決天然黑柄炭角菌產量不足和品質不穩(wěn)定等問題的一種方法。而液態(tài)培養(yǎng)的過程中，黑柄炭角菌除了合成 自身生長所需的有機物質外，還會分泌代謝產物，其中也可能包含具保護神經細胞功能的成分，因此以液態(tài)培養(yǎng)黑柄炭角菌具有發(fā)展天然保護神經細胞物質的潛力。但不同的培養(yǎng)方式會令菌體生長型態(tài)不同，其基因也表達不盡相同，所產出的代謝產物也必然有所差異，在功效上也不同，或可能產生新的功效與用途。
技術實現要素：
本發(fā)明的一個方面在于提供一種黑柄炭角菌(Xylaria nigripes)菌絲體萃取物的用途，其用于制備保護神經細胞的醫(yī)藥組合物。黑柄炭角菌菌絲體萃取物由下述步驟所制得：提供基質，基質實質由0.5～5％重量比的糙米粉、0.1～1％重量比的麥芽萃取物以及99.4～94％重量比的水所組成。接著進行發(fā)酵工藝過程，其在基質中接種黑柄炭角菌，并在發(fā)酵溫度下培養(yǎng)一發(fā)酵時間，以獲得發(fā)酵物質。再分離發(fā)酵物質，以獲得黑柄炭角菌菌絲體。接著進行萃取工藝過程，其利用溶劑與黑柄炭角菌菌絲體混合成混合物后，將混合物攪拌一萃取時間。最后去除混合物的固體部分，以獲得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物，且黑柄炭角菌菌絲體萃取物具有保護神經細胞活性。
依據前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途，前述的基質由2％重量比的糙米粉、0.5％重量比的麥芽萃出物以及97.5％重量比的水所組成。
依據前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途，其中發(fā)酵工藝過程的發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵時間為10天。
依據前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途，其中萃取工藝過程的溶劑可為80℃至100℃的熱水，萃取時間可為0.5小時至2小時。
依據前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途，其中萃取工藝過程的溶劑可為70％重量比的乙醇，萃取時間可為22小時至26小時。
依據前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途，其中混合物的固體部分可利用離心方式、過濾方式或上述方式的組合而去除。
依據前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途，其中保護神經細胞活性可保護或預防神經細胞免于損傷而死亡。
依據前述的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的用途，其中保護神經細胞活性可通過保護或預防神經細胞的DNA免于損傷。
本發(fā)明的另一個方面在于提供一種保護神經細胞的組合物，組合物包含有效劑量的黑柄炭角菌菌絲體萃取物。
依據前述的保護神經細胞的組合物，組合物選自以下群組的一種形式：醫(yī)藥組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養(yǎng)補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物。
借此，本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物因具有保護神經細胞活性，可以保護或預防神經細胞免于損傷而死亡以及可保護或預防神經細胞的DNA免于損傷，故本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用于制備保護神經細胞的醫(yī)藥組合物。而包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物的組合物可作為保護神經細胞目的的醫(yī)藥組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養(yǎng)補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運用在生醫(yī)保健市場的潛能。
上述發(fā)明內容旨在提供本技術方案內容的簡化摘要，以使閱讀者對本技術方案內容具備基本的理解。此發(fā)明內容并非本技術方案內容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實施例的重要/關鍵元件或界定本發(fā)明的范圍。
附圖說明
為讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，附圖說明如下：
圖1為本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備步驟流程圖。
具體實施方式
本說明書公開內容提出黑柄炭角菌菌絲體萃取物的新穎用途，以體外試驗評估黑柄炭角菌菌絲體萃取物的保護神經細胞活性，并進一步驗證黑柄炭角菌菌絲體萃取物的保護神經細胞活性為保護或預防神經細胞免于損傷而死亡以及保護或預防神經細胞的DNA免于損傷。本說明書公開內容提出的黑柄炭角菌菌絲體萃取物為潛在的保護神經細胞補充劑，可用以制備保護神經細胞的醫(yī)藥組合物。
本發(fā)明所述的“有效劑量”指黑柄炭角菌菌絲體萃取物能有效保護和/或預防神經細胞免于損傷的量。例如，黑柄炭角菌菌絲體萃取物的有效劑量可預防神經細胞免于損傷和/或在一定程度上緩解與神經細胞損傷所引起的疾病相關的一個或多個癥狀。
現在以下列具體試驗例進一步示范說明本發(fā)明，用以使得本發(fā)明所屬技術領域通常知識的人員，可在不需過度解讀的情形下完整利用并實踐本發(fā)明，而不應將這些試驗例視為對本發(fā)明范圍的限制，但用于說明如何實施本發(fā)明的材料及方法。
<試驗例>
一、制備黑柄炭角菌菌絲體萃取物
請參照圖1，其為黑柄炭角菌菌絲體萃取物的制備步驟流程圖。圖1中，黑柄炭角菌菌絲體的制備方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140和步驟150。
步驟110是提供基質，基質實質由0.5～5％重量比的糙米粉、0.1～1％重量比的麥芽萃出物以及99.4～94％重量比的水所組成。優(yōu)選地，基質由2％重量比的糙米粉、0.5％重量比的麥芽萃出物以及97.5％重量比的水所組成。更進一步說，使用的基質的組成分為20g/L糙米粉與5g/L麥芽萃出物。使用的發(fā)酵槽為5公升的攪拌式發(fā)酵槽(stirred-tank fermentor)，工作體積為3公升。以提供碳源、氮源及水分讓后續(xù)黑柄炭角菌能進行液態(tài)培養(yǎng)。
步驟120是進行發(fā)酵工藝過程，在基質中接種黑柄炭角菌，并在發(fā)酵溫度下培養(yǎng)一發(fā)酵時間，以獲得發(fā)酵物質。所使用的菌株為黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219為佳，購自食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存與研究中心(臺灣，新竹)，黑柄炭角菌Xylaria nigripes BCRC34219為分離自臺灣本土的菌株。然而需說明的是，上述黑柄炭角菌菌株(BCRC34219)僅為本發(fā)明的一實施方式。發(fā)酵工藝過程以調節(jié)溫度、通氣量等條件，使黑柄炭角菌菌絲體生長。更進一步的說，發(fā)酵工藝過程的條件為，將300mL黑柄炭角菌種菌接種至基質中，再以攪拌轉速為100rpm、通氣量為1vvm及發(fā)酵溫度為25℃等發(fā)酵條件培養(yǎng)10天后，可獲得發(fā)酵物質。
步驟130是分離發(fā)酵物質，將發(fā)酵物質分離為固體部分和液體部分，其中固體部分包含黑柄炭角菌菌絲體。在發(fā)酵工藝過程完成后，因發(fā)酵物質中已充滿黑柄炭角菌菌絲體，因此將發(fā)酵物質中的液體部分和固體部分分離后，即可在固體部分中獲得黑柄炭角菌菌絲體。而分離方式可為過濾方式、離心方式或上述方式的組合。
步驟140是進行萃取工藝過程，利用溶劑與黑柄炭角菌菌絲體混合成混合物后，將混合物攪拌一萃取時間。在萃取工藝過程中，溶劑可為80℃至100℃的熱水，萃取時間可為0.5小時至2小時?；蛉軇┛蔀?0％重量比的乙醇，萃取時間可為22小時至26小時。更進一步的說，進行黑柄炭角菌菌絲體萃取物制備時，先使用水清洗黑柄炭角菌菌絲體數次，再利用冷凍干燥機干燥黑柄炭角菌菌絲體，制成菌絲體粉末，菌絲體粉末樣品保存在密閉容器內。再將菌絲體粉末與90℃熱水以重量比1：10至1：30的比例混合成混合物后，將混合物攪拌1小時以萃取其中具有功能性的成分?；蚴菍⒕z體粉末與70％重量比的乙醇以重量比1：10至1：30的比例混合成混合物后，將混合物攪拌24小時以萃取其中具有功能性的成分。
步驟150是去除混合物的固體部分，以獲得上清液，其中上清液包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。經過萃取工藝過程后，黑柄炭角菌菌絲體萃取物已溶解至溶劑中，其中包含具有功能性的成分，因此去除混合物中固體部分后， 所獲得的上清液中包含黑柄炭角菌菌絲體萃取物。而混合物的固體部分可利用離心方式、過濾方式或上述方式的組合而去除。更進一步的說，將萃取后的樣品經過濾與離心步驟，取上清液進行濃縮，再使用冷凍干燥機進行干燥，即可得黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物。
二、黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護神經細胞能力
PC12神經細胞株分離自大鼠腎髓質嗜鉻性細胞瘤屬中胚層組織，一般被廣為運用作為研究神經分化、神經毒性、神經藥理、神經保護機制。實驗上以未分化PC12神經細胞(nPC-12cells)模擬未分化的神經細胞，并以誘導劑H2O2處理模擬神經細胞的氧化損傷，通過細胞存活率分析、乳酸脫氫酶的釋出率、細胞的DNA損傷分析來探討黑柄炭角菌菌絲體萃取物對PC12神經細胞的保護能力。下述試驗例的PC12神經細胞購自食品工業(yè)發(fā)展研究所生物資源保存及研究中心(臺灣，新竹)。
1.細胞存活率分析
PC12神經細胞的存活率(viability)分析以細胞存活率分析法(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide；MTT assay)計算黑柄炭角菌菌絲體萃取物對PC12神經細胞的保護率。MTT為可溶于水的黃色染劑，活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)能夠代謝還原MTT，同時在細胞色素C的作用下，生成藍紫色不溶于水的MTT-formazan，在波長595nm下具有吸光值。此法除了可監(jiān)測粒線體的還原能力外，也可代表細胞存活數目，當吸光值越高表示細胞存活率越高。
實驗上PC12神經細胞培養(yǎng)液為含10％胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液。進行細胞存活率分析時，先將PC12神經細胞以3×105 cell/well的濃度接種在96孔微量盤中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，分別給予樣品或誘導劑H2O2，其中以僅添加誘導劑H2O2作為控制組，同時添加誘導劑H2O2與樣品為實驗組，而樣品分別為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物，再在37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后將培養(yǎng)液吸出，用磷酸緩沖液(PBS)洗兩次，加入150μl濃度為0.5mg/ml的MTT，放置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱反應4小時后，將MTT吸出，再加入100μl二甲基亞砜(DMSO)，以溶解MTT-formazan使溶液呈色。放置隔夜后，以酵素免疫分析測讀儀測定在波長595nm的吸光值，可代表細胞存活數目。而PC12神經細胞保護率的計算方式如下：
其中為同時添加誘導劑H2O2與樣品時PC12神經細胞的存活率；為只添加誘導劑H2O2時PC12神經細胞的存活率。
請參照下表一，為以細胞存活率分析法分析黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對于PC12神經細胞保護率。
表一
實驗結果顯示，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物在濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物對于PC12神經細胞保護率分別為9.4％、24.1％和29.6％。黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物在濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對于PC12神經細胞保護率分別為14.3％、29.2％和33.2％。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物，皆可保護PC12神經細胞免于受到H2O2氧化傷害，而保護或預防PC12神經細胞免于損傷而死亡，且具有劑量依賴性。而在不同的樣品濃度下，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對PC12神經細胞保護率均高于黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。
2.乳酸脫氫酶釋出率分析
H2O2對細胞造成氧化傷害，也導致細胞膜的破壞，因而釋放出乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)到培養(yǎng)基之中，故培養(yǎng)基之中LDH釋出率越低，則細胞受到損傷的比率越低，表示樣品越有保護細胞的效力。
實驗上先將PC12神經細胞以3×105 cell/well的濃度接種在96孔微量盤中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，分別給予樣品或誘導劑H2O2，其中以僅添加誘導劑H2O2作為控制組，同時添加誘導劑H2O2與樣品為實驗組，而樣品分別為黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物，再在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)后將培養(yǎng)液吸出，用磷酸緩沖液(PBS)洗兩次后，使用日本寶生物實驗室的LDH細胞毒性檢測試劑盒(Cytotoxicity Detection Kit，TaKaRa Bio Laboratories,Japan)分析培養(yǎng)液中的LDH活性，可以計算對PC12神經細胞造成的毒性百分率(percentage cytotoxicity)，即表示細胞受到損傷的情形。當分析結果LDH活性較低時，其毒性百分率較小，則細胞受到損傷的情形較不嚴重，表示該樣品越有保護細胞的效力。在這個分析套組中，乳酸脫氫酶活性是通過比色法來測定，在特定的基質與酵素反應后，反應液的吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關。毒性百分率計算公式如下:
其中OD樣品為添加樣品處理后，細胞的LDH釋出量。ODLow control為未添加樣品的控制組，即細胞自發(fā)性的LDH釋出量。ODHigh control為未加添樣品的控制組，但添加Triton X-100使細胞100％死亡時的LDH釋出量。
請參照下表二，為以LDH釋出率分析在添加黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物和黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物時，對于H2O2誘發(fā)PC12神經細胞氧化傷害的毒性百分率。
表二
實驗結果顯示，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物在濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物對于H2O2誘發(fā)PC12神經細胞氧化傷害的毒性百分率分別為40.5％、35.7％和32.9％。黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物在濃度為10、50、100μg/mL時，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對于H2O2誘發(fā)PC12神經細胞氧化傷害的毒性百分率分別為44.4％、36.3％和33.1％。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物，皆具保護PC12神經細胞免于受到H2O2氧化傷害的功效，且具有劑量依賴性。而在不同的樣品濃度下，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物對PC12神經細胞保護情形均高于黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。
3.細胞的DNA損傷分析
單細胞凝膠電泳是一種可以檢測單一細胞DNA受損的方法，其原理是利用低熔點瓊脂膠體電泳分離不同大小片段的DNA，監(jiān)測細胞DNA有無斷裂的情況。若細胞DNA未損害則移動慢，而損傷斷裂的DNA片段在電泳后會移動至細胞核外，在核酸染色后，會形成像彗星拖尾的現象，又稱為彗星分析法(Comet assay)。因此，可利用單細胞凝膠電泳來觀察PC12神經細胞受到誘導劑H2O2氧化傷害與黑柄炭角菌菌絲體萃取物保護后，PC12神經細胞DNA受損的情形。
實驗上以未經任何處理的PC12神經細胞作為對照組，以僅添加誘導劑H2O2作為控制組，以同時添加誘導劑H2O2與樣品為實驗組?？刂平M以300μ g/mL的H2O2處理2小時后，再進行單細胞凝膠電泳。而實驗組先分別以濃度為10、50、100μg/mL的黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物或黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物處理24小時后，再以300μg/mL的H2O2處理2小時，之后進行單細胞凝膠電泳。在定量分析上，可使用影像處理軟體，統(tǒng)計DNA拖尾比率與拖尾長度。
請參照下表三，不同實驗組的PC12神經細胞的DNA損傷分析結果。
表三
實驗結果顯示，對照組的PC12神經細胞在進行單細胞凝膠電泳時不會有拖尾的情形出現?？刂平M的PC12神經細胞在進行單細胞凝膠電泳時，拖尾DNA的比率達68.3％，平均拖尾長度為80。而實驗組的P12神經細胞，不論是先經黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物處理24小時，再以300μg/mL的H2O2處理2小時后，在進行單細胞凝膠電泳時，可以發(fā)現拖尾DNA的比率與拖尾長度都降低了。尤其是先以100μg/mL的黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物處理后，拖尾DNA的比率降低為7.6％與平均拖尾長度減短為11.6。顯示不論是黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物或黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物，皆具有保護PC12神經細胞免于受到H2O2氧化傷害的功效，并能保護或預防PC12神經細胞的DNA免于損傷，且不論在何種樣品濃度，黑柄炭角菌菌絲體乙醇萃取物保護PC12神經細胞的能力均優(yōu)于黑柄炭角菌菌絲體熱水萃取物。
由上所述，本發(fā)明所公開的黑柄炭角菌菌絲體萃取物在保護神經細胞活性分析結果顯示，黑柄炭角菌菌絲體萃取物可以保護或預防神經細胞免于損傷而死亡以及可保護或預防神經細胞的DNA免于損傷。故本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物可用于制備保護神經細胞的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明的黑柄炭角菌菌絲體萃取物所制備的保護神經細胞的醫(yī)藥組合物可經由局部表面施用式(topical)投藥、口服(如，口服用粉劑、膠囊、懸浮液或藥錠)、或腸胃外(parenterally)(例如注射)等適當方法施用。故包含有效劑量的黑柄炭角菌菌絲體萃取物的組合物，可作為保護神經細胞目的的醫(yī)藥組合物、飼料組合物、飲料組合物、營養(yǎng)補充組合物、食用組合物以及保健食用組合物上，具有運用在生醫(yī)保健市場的潛能。
雖然本發(fā)明已經以實施方式公開如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何本領域技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，當可作各種變動與潤飾，因此本發(fā)明的保護范圍當視權利要求所界定者為準。