專利名稱:抗第三方中樞記憶性t細(xì)胞、產(chǎn)生其的方法及其在移植和疾病治療中的用途的制作方法
抗第三方中樞記憶性T細(xì)胞、產(chǎn)生其的方法及其在移植和
疾病治療中的用途
相關(guān)申請
本申請要求來自于2008年10月30日提交的美國臨時專利申請61/193，137和于2009 年6月12提交的美國臨時專利申請61/213，482的優(yōu)先權(quán)利益，所述美國臨時專利申請各自完全引入本文作為參考。
發(fā)明領(lǐng)域和背景
本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞表型的不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方細(xì)胞(non-GVHD inducing anti-third party cell)，和更具體而言但并非排他地涉及其生成及其在移植和疾病治療中的用途。
骨髓(BM)移植提供了用于具有血液學(xué)惡性腫瘤和其他血液學(xué)病癥的許多患者的治愈性治療。然而，BM移植物包含供體T細(xì)胞，其對宿主抗原(Ag)應(yīng)答且引起多系統(tǒng)移植物抗宿主病(GVHD)。在80年代早期，無GVHD的有害作用的骨髓移植(BMT)在單倍體相合的(3個HLA基因座不匹配)背景中在重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患者中得到證實(shí)。在此類背景中幾乎一致地致死的GVHD問題通過T細(xì)胞耗盡得到完全預(yù)防。
然而，在白血病患者中，T細(xì)胞耗盡的BM的臨床結(jié)果是令人失望的，因?yàn)镚VHD預(yù)防的好處由顯著增加的移植物排斥比率抵消。排斥顯示為由放射化療抗性的宿主衍生的T 細(xì)胞介導(dǎo)[Reisner 等人，Proc Natl Acad Sci USA. (1986) 83:4012-4015]。克服這個問題的一個方法是在使用免疫抑制藥物超致死(supra-lethal)調(diào)節(jié)和功能滅活宿主T細(xì)胞后執(zhí)行BMT。然而，這種策略被由于緩慢免疫重建的機(jī)會致病菌感染和相當(dāng)大的免疫抑制劑毒性所阻礙。
雖然在高危白血病患者中，此類移植相關(guān)的死亡率可以是可接受的，但如果應(yīng)用于具有長預(yù)期壽命的患者，那么這將是不能忍受的。因此，要保證使用減少強(qiáng)度的調(diào)節(jié)，伴隨嚴(yán)重性較低的免疫消融，使得T耗盡的BM (TDBM)移植物能夠移入，這與減少的GVHD危險相關(guān)。在此類減少的調(diào)節(jié)下，供體類型嵌合狀態(tài)的建立代表移植生物學(xué)中十分希望的目標(biāo)，因?yàn)檫@一般與針對來自原始供體的細(xì)胞或組織的持久耐受性相關(guān)。然而，在輕度預(yù)備方案中存活的的宿主免疫細(xì)胞的顯著水平代表用于移入供體細(xì)胞的困難屏障。
克服同種異體造血干細(xì)胞排斥的一種方法利用大劑量的BM細(xì)胞。在嚙齒類模型中首先證實(shí)“大劑量的”TDBM移植可以克服T細(xì)胞介導(dǎo)的移植物排斥[Lapidot等人，Blood (1989) 73:2025-2032 ；Bachar-Lustig 等人，Nat Med. (1995) 1:1268-1273 ；Uharek 等人， Blood (1992) 79:1612-1621]。然而，BM接種物的顯著增加在人中難以達(dá)到。為了克服這個問題，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(其促進(jìn)來自BM的造血干細(xì)胞(HSC，人中的⑶34+ 細(xì)胞)的動員)已用于增加從血液中收集的HSC得率，并且這些HSC被補(bǔ)充至常規(guī)TDBM [Aversa 等人，N Engl J Med. (1998)339 1186-1193 ;Aversa 等人，J Clin Oncol. (2005) 23:3447-3454 ;Reisner 禾口 Martelli， Immunol Today (1999) 20:343-347 ；Handgretinger 等人，Bone Marrow Transplant. (2001) 27:777-783]。
⑶34 “大劑量”移植提出了關(guān)于這些細(xì)胞如何克服由宿主細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞前體(CTL-p)呈現(xiàn)的屏障的有趣問題。這個問題部分被CD34部分內(nèi)的細(xì)胞賦予有效反抑活性(veto activity)的發(fā)現(xiàn)解答[Gur 等人，Blood (2005)105:2585-2593 ；Gur 等人，Blood (2002)99:4174-4181 ；Rachamim 等人，Transplantation (1998)65 1386-1393] 其他細(xì)胞類型已也顯示介導(dǎo)反抑活性，包括T淋巴細(xì)胞(例如⑶8+ CTL)、天然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞。 各種細(xì)胞類型的反抑反應(yīng)性的直接比較揭示CTL包括最強(qiáng)的反抑效應(yīng)[Reich-Zeliger等人，J Immunol. (2004) 173:6654-6659]。
為生成無GVH反應(yīng)性的反抑CTL而開發(fā)的一種方法由Reisner和同事描述，其中在不存在外源IL-2的情況下CTL針對第三方刺激物進(jìn)行刺激。這種方法基于在原代培養(yǎng)物中僅激活的CTLp能夠經(jīng)受住IL-2剝奪的觀察。這種方法在體外和體內(nèi)顯示耗盡來自抗第三方反抑 CTL 的 GVH 反應(yīng)性[PCT 公開號 WO 2001/049243, Bachar-Lustig 等人，Blood. 2003 ； 102:1943-1950 ；Aviner 等人，Hum Immunol. (2005)66:644-652]。這些抗第三方反抑 CTL引入受體(連同移植物)預(yù)防移植物排斥，而不誘導(dǎo)GVHD(PCT公開號WO 2001/049243)。
已考慮了用于移植物移植而無移植物排斥和/或移植物抗宿主病的各種方法，一些在下文概述。
PCT公開號WO 2007/02:3491公開了致耐受性細(xì)胞(tolerogenic cell)用于減少或預(yù)防受試者中的非同基因移植物的移植物排斥的用途。公開的致耐受性細(xì)胞(例如 CD4+CD25+細(xì)胞)可以衍生自任何供體，其對于受試者和移植物不是同基因的(“第三方”致耐受性細(xì)胞)。移植物(例如骨髓)可以衍生自任何移植物供體，其對于受試者是同種異體的或異種的。
PCT公開號WO 2002/102971公開了包括增強(qiáng)反抑活性的培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞(HPC) 用于誘導(dǎo)針對從供體移植到受體的移植物的耐受性的用途。公開的致耐受性細(xì)胞優(yōu)選表達(dá) CD33，并且在移植物(例如細(xì)胞或器官移植物)移植之前、同時或之后施用。
PCT公開號WO 2002/043651公開了免疫效應(yīng)細(xì)胞的不誘導(dǎo)GVHD的群體用于疾病治療的用途。為了取得免疫效應(yīng)細(xì)胞的不誘導(dǎo)GVHD的群體，在包括IL-2饑餓隨后為IL-2 補(bǔ)充的條件下，使第一個細(xì)胞群體(例如T淋巴細(xì)胞)與第二個細(xì)胞群體共培養(yǎng)，所述第二個細(xì)胞群體對于受試者是非同基因的且對于第一個細(xì)胞群體(例如EBV感染的B淋巴細(xì)胞)是非同基因的。所得到的免疫效應(yīng)細(xì)胞可以用于治療疾病例如惡性疾病、病毒疾病和自身免疫疾病。
美國專利號6，759，035公開了在實(shí)體器官移植受體中抑制移植物排斥且誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受的方法。公開的方法包括從供體和受體中取出外周血單核細(xì)胞(PBMC)，在誘導(dǎo)T細(xì)胞抑制劑活性(例如TGF-β、IL-15和IL-2)的化合物的存在下一起培養(yǎng)供體和受體細(xì)胞， 并且將受體抑制性T細(xì)胞連同移植物一起施用于受體，以預(yù)防受體的T細(xì)胞殺死供體細(xì)胞， 從而誘導(dǎo)移植物的耐受和長期存活。
美國專利號6，803，036公開了用于處理供體細(xì)胞以改善受體患者中的移植物抗宿主病的方法。公開的方法包括從供體中取出PBMC，并且用抑制組合物(例如IL-10、IL-2、 IL-4、IL-15和TGF-β )將細(xì)胞處理足以誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受的時間。隨后將細(xì)胞引入受體患者。處理的細(xì)胞可以在引入患者之前加入供體干細(xì)胞中。
發(fā)明概述
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了分離的細(xì)胞群體，其包括具有中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方細(xì)胞，所述細(xì)胞是誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞 (tolerance-inducing cells)并且在移植后能夠歸巢至淋巴結(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體用于在有此需要的受試者中治療疾病的用途。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體作為用于進(jìn)入受試者內(nèi)的細(xì)胞或組織移植物的輔助治療的用途，其中受試者需要細(xì)胞或組織移植。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了治療需要細(xì)胞或組織移植的受試者的方法，該方法包括(a)將細(xì)胞或器官移植物移植到受試者內(nèi)；和(b)給受試者施用治療有效量的權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體，從而治療受試者。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，該方法進(jìn)一步包括在移植前在亞致死、致死或超致死條件下調(diào)節(jié)受試者。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一個方面，提供了生成權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體的方法，該方法包括(a)在允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件下，使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸；和(b)在允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm) 表型的細(xì)胞增殖的條件下，在IL-15的存在下培養(yǎng)得自步驟(a)的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件包括剝奪細(xì)胞因子的培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件包括至少2天的培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件包括IL-7和/或IL-21。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件包括無抗原環(huán)境。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件包括至少14天的培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，一種或多種第三方抗原選自第三方細(xì)胞、細(xì)胞抗原、 病毒抗原、細(xì)菌抗原、蛋白質(zhì)提取物、純化的蛋白質(zhì)和由自體或非自體呈遞細(xì)胞呈遞的合成肽。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，第三方細(xì)胞就受試者和/或供體而言是同種異體或異種細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，同種異體細(xì)胞是刺激細(xì)胞，其選自由外周血淋巴細(xì)胞、脾或淋巴結(jié)純化的細(xì)胞，細(xì)胞因子動員的PBL和體外擴(kuò)增的抗原呈遞樹突細(xì)胞(APC)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)就受試者而言是同種異體的。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)就受試者而言是異種的。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，疾病選自惡性疾病、病毒疾病和自身免疫疾病。 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，分離的細(xì)胞群體在細(xì)胞或組織移植之前、同時或之后施用。[0033]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型包括⑶8+、⑶62L+、 CD45RA/ CD45 RO+標(biāo)志。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型包括⑶8+/ CD62L+/CD45R0+/L-選擇素 +/CD45RA-。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，至少50%的分離的細(xì)胞群體具有標(biāo)志。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，淋巴結(jié)包括外周淋巴結(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，淋巴結(jié)包括腸系膜淋巴結(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，受試者是人受試者。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞或組織移植物衍生自選自HLA相同的同種異體供體、HLA不相同的同種異體供體和異種供體的供體。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，受試者和供體都是人。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，包括具有中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方細(xì)胞的分離的細(xì)胞群體通過下述生成(a)在允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件下，使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸；和(b)在允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件下，在IL-15的存在下培養(yǎng)得自步驟(a)的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件包括剝奪細(xì)胞因子的培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件包括至少2天的培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件包括IL-7和/或IL-21。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件包括至少14天的培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件包括無抗原環(huán)境。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，一種或多種第三方抗原選自第三方細(xì)胞、細(xì)胞抗原、 病毒抗原、細(xì)菌抗原、蛋白質(zhì)提取物、純化的蛋白質(zhì)和由自體或非自體呈遞細(xì)胞呈遞的合成肽。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，第三方細(xì)胞就受試者和/或供體而言是同種異體或異種細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，同種異體細(xì)胞是刺激細(xì)胞，其選自由外周血淋巴細(xì)胞、脾或淋巴結(jié)純化的細(xì)胞，細(xì)胞因子動員的PBL和體外擴(kuò)增的抗原呈遞樹突細(xì)胞(APC)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)就受試者而言是同種異體的。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)就受試者而言是異種的。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，分離的細(xì)胞群體通過下述生成(a)在允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件下，在剝奪細(xì)胞因子的培養(yǎng)中使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸至少2天；和(b)在允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件下，在無抗原環(huán)境條件下在IL-15的存在下使得自步驟(a)的細(xì)胞培養(yǎng)至少 14天。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，培養(yǎng)得自步驟(a)的細(xì)胞包括IL-7和/或IL-21。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與由本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管下文描述了示例性方法和/或材料，但與本文描述的那些相似或等價的方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案的實(shí)踐或測試中。在沖突的情況下，以本書包括定義為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅是舉例說明性的，并且不預(yù)期是必要限制性的。
附圖簡述
本發(fā)明的一些實(shí)施方案在本文中就附圖而言僅作為例子進(jìn)行描述?，F(xiàn)在具體參考詳細(xì)附圖，重點(diǎn)在于顯示的細(xì)節(jié)作為例子和用于舉例說明性討論本發(fā)明的實(shí)施方案的目的。在這點(diǎn)上，說明書連同附圖使得本發(fā)明的實(shí)施方案可以如何實(shí)踐對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
在附圖中
圖IA-D是描述在接種后36小時，與同基因和同種異體的幼稚T細(xì)胞比較，抗第三方反抑CTL的歸巢模式的照片。受致死照射的FVB (Hltl)小鼠接受5 χ IO6個T細(xì)胞耗盡 BALB/C (H-2d)骨髓同種異體移植物(
圖1A)和IO4個同基因T細(xì)胞(圖1C-D)。此外，受體小鼠接受2 χ IO6個同基因WR標(biāo)記的幼稚HTC(圖1B)、7 χ IO6個幼稚同種異體WR標(biāo)記的T細(xì)胞(圖1C)或7 χ IO6個DIR標(biāo)記的同種異體抗第三方激活的反抑CTL (圖1D)。
圖2Α-Β是描述體外短期細(xì)胞因子剝奪有利于通過IL-15的中樞記憶性T (Tcm) 細(xì)胞誘導(dǎo)的圖。BALB/C或CB6脾細(xì)胞用受照射的FVB脾細(xì)胞刺激60小時(2天)或在不存在細(xì)胞因子的情況下刺激6天，并且使用FACS分析評估⑶8+ T細(xì)胞的⑶62L表達(dá)(圖2Α)。 隨后，陽性選擇⑶8+ T細(xì)胞，并且與rhIL-2 (40 IU/ml)進(jìn)一步培養(yǎng)，并且在無Ag環(huán)境中用FVB脾細(xì)胞、rhIL-2 (40 IU/ml)或rhIL-15 (20 ng/ml)再激活。每隔一天加入新鮮培養(yǎng)基和細(xì)胞因子。在培養(yǎng)第15天時，使用FACS分析就Tcm細(xì)胞(⑶44+⑶62L+)百分比評估細(xì)胞(圖2B)。
圖2C是描述誘導(dǎo)本發(fā)明細(xì)胞的Tcm表型采取的步驟的流程圖。小鼠脾細(xì)胞用受照射的第三方刺激物刺激60小時，無需添加細(xì)胞因子。隨后，陽性選擇存活CD8+ T細(xì)胞， 并且在無抗原環(huán)境中與rhIL-15 (20 ng/ml)進(jìn)一步培養(yǎng)14天。在14天后，培養(yǎng)物包括約 70% Tcm細(xì)胞，如圖2B中指出的。
圖3A-B是描述與反抑CTL細(xì)胞比較，⑶8+⑶62L+ Tcm細(xì)胞在宿主淋巴結(jié)中且以高數(shù)目存在的照片(過繼移植后60小時)。受致死照射的BALB/C (H-2d)小鼠接受5 χ IO6個裸露(nude)C57BL/6骨髓同種異體移植物(H-2b)和IO4個同基因T細(xì)胞。小鼠隨后用WR 標(biāo)記的10 χ IO6個⑶8+ Tcm (圖3A)或反抑CTL細(xì)胞(H-2bd，圖3B)移植。60小時后處死選擇的受體。使用IVIS先體外后體內(nèi)(ex-vivo)獲得圖像。
圖4A-D是描述與反抑CTL細(xì)胞比較，⑶8+⑶62L+ Tqi細(xì)胞在外周和腸系膜淋巴結(jié)中且以高數(shù)目檢測的圖(過繼移植后60小時)。受致死照射的BALB/C (H-2d)小鼠接受5 χ IO6個裸露C57BL/6骨髓同種異體移植物(H-2b)和IO4同基因T細(xì)胞。小鼠隨后用WR標(biāo)記的10 χ IO6個CD8+ Tcm (圖4A-B)或反抑CTL細(xì)胞(H-2bd，圖4C-D)移植。2天后，處死選擇的受體，并且提取外周淋巴結(jié)(圖4A和4C)和腸系膜淋巴結(jié)(圖4B和4D)且磨碎。通過FACS分析細(xì)胞懸浮液且對⑶8進(jìn)行門控(gate)。
圖5A-C是描述與主要集中于肝和脾的⑶8+反抑CTL細(xì)胞比較，⑶62L+ Tcffl細(xì)胞在所有次級淋巴樣器官(SLO)中且以高細(xì)胞數(shù)目存在的照片(過繼移植后6. 5天)。受致死照射的BALB/C (H-2d)小鼠接受5 χ IO6個裸露C57BL/6骨髓同種異體移植物(H_2b)和IO4 個同基因T細(xì)胞(對照，圖5A)。小鼠隨后用WR標(biāo)記的10 χ IO6個⑶8+ Tcm (圖5B)或反抑CTL細(xì)胞(H-2bd，圖5C)移植。6. 5天后，處死選擇的受體，并且使用IVIS先體外后體內(nèi)獲得圖像。
圖6A-K是描述與CD8+反抑CTL細(xì)胞比較，CD62L+ Tcm細(xì)胞在所有SLO中且以高細(xì)胞數(shù)目存在的圖(過繼移植后6.5天)。受致死照射的BALB/C (H-2d)小鼠接受5 χ IO6個裸露C57BL/6骨髓同種異體移植物(H-2b)和IO4個同基因T細(xì)胞。小鼠隨后用WR標(biāo)記的 10 X IO6個CD8. Tcm (圖6A-E)或反抑CTL細(xì)胞(H-2bd，圖6F-J)移植。6. 5天后，處死選擇的受體，提取內(nèi)臟，并且通過FACS分析純化細(xì)胞。數(shù)目代表在恒定時間內(nèi)收集的對CD8門控的總H-2bd細(xì)胞。在移植后2天(黑色條)或6. 5天(灰色條)時，從測試的所有器官中收獲的Tcm或CTL總數(shù)目顯示于圖6K中。
圖7是描述Tcm細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移用于克服T細(xì)胞耗盡骨髓(TDBM)同種異體移植物的排斥的用途的圖。受致死照射的C3H (H-2K)小鼠接受1.25 χ IO4同基因T細(xì)胞。小鼠隨后用3 χ IO6個裸露BALB/C BM細(xì)胞(H_2d)連同或不連同IO7個(C3H*BALB/C) Fl CD8+ Tcm細(xì)胞(H-2kd)的添加移植。
圖8是描述供體嵌合狀態(tài)百分比的圖(BM移植后80天)。受致死照射的C3H(H_2K) 小鼠用3 χ IO6裸露BALB/C BM同種異體移植物(H_2d)移植(列A)，或接受另外1. 25 χ IO4 個同基因T細(xì)胞和IO7個(C3H*BALB/C)F1 CD8+ Tcm (H_2kd)(列B)。通過FACS分析在小鼠外周血中移植后80天的供體嵌合狀態(tài)百分比。
圖9A-B是描述在BM移植后80天時輸注Tcm細(xì)胞的外周血水平的圖。受致死照射的C3H (H-2K)小鼠用3 χ IO6個裸露BALB/C BM細(xì)胞(H_2d)移植(圖9A)，或接受另外 1. 25 χ IO4 個同基因 T 細(xì)胞和 IO7 (C3H*BALB/C)F1 CD8. Tcm 細(xì)胞(H_2kd)(圖 9B)。通過測量⑶8+門中的H2KkH2Dd雙重陽性細(xì)胞的FACS分析來分析Tcm細(xì)胞的外周血水平。該圖顯示來自每個組的代表性小鼠。
圖10A-C是顯示Tcm’賦予顯著耐受性誘導(dǎo)能力且在BMT后在體內(nèi)持續(xù)至少1年的圖。圖IOA -受致死照射(IOGy)的C3H (H_2K)小鼠接受1. 25 χ IO4個同基因HTC。在不同劑量的(C3HXBALB/c)Fl (H_2Kd，“C3BF1 ”)純化的CD8+ ‘Tcm，的存在或不存在下，小鼠隨后用3 χ IO6個BALB/c-NUDE BM細(xì)胞(H_2d，“BA-NU BM”)移植。數(shù)據(jù)代表對于僅照射組的n=22只動物，對于照射+BM組的30只，對于照射+BM+HTC組的59只，和對于下述小鼠組分別為 η= 16、23 或 18 照射+BM+HTC+ (2*106)或(5*106)或(107) W。數(shù)據(jù)由 6 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)合并。圖IOB -移植物排斥模型如9C中建立。在切106個(C3H*BALB/c)Fl (H-2Kd, “C3BF1”)純化的‘Tcm，或107(C3H*BALB/c)F1 ‘CTL，的存在或不存在下，小鼠用 3x106個BALB/c-NUDE BM細(xì)胞(H_2d，"BA-NU BM”)移植。數(shù)據(jù)代表對于僅照射組的n=14 只動物，對于照射+BM組的12只，對于照射+BM+HTC組的21只，和對于接受照射+BM+HTC+ (5xl06) W或(107) ‘CTL’的小鼠組分別為η= 23或16。數(shù)據(jù)由5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)合并。圖IOC -通過測量CD8.門中的H2KkH2Dd雙重陽性細(xì)胞的FACS,在BMT后1年分析iTcm'的外周血水平。該圖顯示僅用BM移植(“單獨(dú)的BM”)的7只小鼠或用BM+HTC+5x106(C3H*BALB/ c) Fl CD8+ ‘Tcm，(“BM+Tcm”)移植的7只小鼠中的代表性小鼠。
圖IlA-C是舉例說明完全同種異體的抗第三方‘Tcm，耗盡GVH反應(yīng)性且支持TDBM 同種異體移植物移入的圖。圖IlA-B -在切106個或hlO6個BLAB/c衍生的⑶8+純化 ‘Tcm，(分別為“BM + Tcm 5”或“BM + Tcm 2”)或幼稚細(xì)胞(分別為“BM +幼稚5”或“BM +幼稚2”)的存在或不存在下，受超致死照射(IlGy)的C3H小鼠用切106個BALB/c_NUDE BM細(xì)胞進(jìn)行放射保護(hù)?！甌cm’或幼稚細(xì)胞的GVH反應(yīng)性由在移植后100天過程中的存活百分比(圖11A)或平均重量改變(圖11B)反映。數(shù)據(jù)代表3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，在每次實(shí)驗(yàn)中對于每個組具有至少5只小鼠。(#)代表與僅接受BM的小鼠組比較ρ-值<0.01。圖 IlC -受致死照射(IOGy)的C3H小鼠接受1.25 χ IO4個同基因HTC。在切106個BALB/ c CD8+純化的‘Tcm，或IO7 BALB/c ‘CTL，的存在或不存在下，小鼠隨后用3xl06個BALB/ c-NUDE BM細(xì)胞(“BA-NU BM”)移植。數(shù)據(jù)代表對于僅照射組的n=17只動物，對于照射+BM 組的11只，對于照射+BM+HTC組的M只，和對于接受照射+BM+HTC+107 ‘CTL’或切106 ‘Tcm’ 的小鼠組分別為η= 27或25。數(shù)據(jù)由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)合并。
圖12Α-Ε是顯示Tcm’在體外顯示低反抑活性但在再激活后獲得效應(yīng)物表型的圖，所述效應(yīng)物表型與有效和特異性反抑活性相關(guān)。圖12A- 2c在CB6 (H-2bd)衍生的純化‘Tcm’、‘CTL’或在體外用其同源物第三方FVB刺激物再激活60小時的純化‘Tcm，(“R’ Tcm”)的存在或不存在下，用受照射的BALB/c (H_2d)脾細(xì)胞刺激脾細(xì)胞。反抑細(xì)胞以指示的反抑/效應(yīng)物比值加入。在MLR起始后3天，通過FACS分析來分析反抑活性，以監(jiān)控 ⑶8+1B2+ 2c細(xì)胞擴(kuò)增的抑制。結(jié)果作為來自5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的抑制百分比的平均值士SD呈現(xiàn)。圖12B在MLR結(jié)束時，在連同或不連同以0. 02的反抑/效應(yīng)物比值的反抑細(xì)胞鋪平板的活(7AAD_)⑶8+1B2+ 2c細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V水平的FACS分析。結(jié)果作為在7次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的膜聯(lián)蛋白V百分比的平均值士SD呈現(xiàn)。圖12C- MLR如A中建立。當(dāng)衍生自“特異性” CB6 (H-2bd, ” spe，”)或“非特異性” C3B6F1 (H_2bk，”non-spe，”)小鼠的反抑細(xì)胞以 0. 02 的反抑/效應(yīng)物比值加入時，評估2c細(xì)胞擴(kuò)增的抑制。結(jié)果作為來自4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的抑制百分比的平均值士SD呈現(xiàn)。2c細(xì)胞也就膜聯(lián)蛋白V水平進(jìn)行分析(圖12D)。圖12E受致死照射(8Gy)的BALB/c小鼠接受4xl06個C57BL/6-NUDE BM細(xì)胞和1. 25 χ IO4個同基因 T細(xì)胞。小鼠隨后用2-lOxlO6個純化的CB6⑶8+ ‘Tcm’移植，這在過繼轉(zhuǎn)移前就⑶62L表型進(jìn)行分析(左圖，“Tcm”)。在過繼轉(zhuǎn)移后4天處死小鼠，并且收獲LN且磨碎；通過FACS分析在從LN中分離的CB6⑶8+ T細(xì)胞上的⑶62L表達(dá)(右圖，“LN Tcm”)。展示了從4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中測試的20只小鼠中的1只小鼠的LN中分離的‘Tcm’的代表性結(jié)果。在圖12A-F 中，(***)代表 ρ-值 <0. 001，(**)代表 ρ-值 <0.01 并且(*)代表 ρ-值 <0. 05。
圖13A-D是顯示Tcm在體內(nèi)特異性耗盡抗供體T細(xì)胞的圖。圖13A-B -受致死照射(IOGy)的C57BL/6小鼠接受IxlO5個純化的CD8+ 2c細(xì)胞和切105個受照射的BALB/c脾細(xì)胞。第二天，小鼠用IxlO6個C57BL/6-NUDE BM細(xì)胞移植，或另外接受衍生自CB6的切106 個“特異性”(黑色條)或衍生自C57BL/6的“非特異性”(灰色條)的純化‘Tcm’。在移植后8天處死受體，收獲其脾，并且通過FACS監(jiān)控2c T細(xì)胞的耗盡。(A)在“特異性” ‘Tcm’ 的不存在(左圖，“單獨(dú)的2c”)或存在下(右圖，“2c+特異性Tcm”)，證實(shí)存活(7AAD_)2c細(xì)
1胞水平的代表性結(jié)果。(B)測量通過“特異性”和“非特異性” ‘Tcm’的2c細(xì)胞抑制的結(jié)果定量。數(shù)據(jù)代表由2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)合并的、來自每個組中的至少10只動物的抑制百分比的平均值士 SD。圖13C-D -同基因BMT模型如A-B中建立，但施用5x10s個純化的⑶8+ 2c細(xì)胞和2. 5xl06個受照射的BALB/c脾細(xì)胞。在移植后8天處死受體，收獲其脾，并且執(zhí)行在活 (7AAD_)CD8+1B2+ 2c細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V水平的FACS分析。圖13C -在“特異性” ‘Tcm， 的不存在(左圖，“單獨(dú)的2c”)或存在下(右圖，“2c+特異性Tcm”)，證實(shí)在2c細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V水平的代表性結(jié)果。圖13D -在與“特異性”或“非特異性” ‘Tcm’相互作用后，測量在2c細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V水平的結(jié)果定量。數(shù)據(jù)代表在執(zhí)行的3次中的1次代表性實(shí)驗(yàn)中、來自每個組中的至少4只動物中的膜聯(lián)蛋白V水平百分比的平均值士SD。(**)代表 ρ-值 <0.01 (***)代表 ρ-值 <0. 001。
本發(fā)明的具體實(shí)施方案描述
本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞表型的不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方細(xì)胞，和更具體而言但并非唯一地涉及其生成及其在移植和疾病治療中的用途。
本發(fā)明的原理和操作可以參考附圖和伴隨說明書得到更好理解。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實(shí)施方案前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不一定使其應(yīng)用限制于下述說明書中所示或由實(shí)施例例示的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他實(shí)施方案或以各種方式進(jìn)行實(shí)踐或執(zhí)行。此外，應(yīng)當(dāng)理解本文采用的措辭和術(shù)語用于描述的目的并且不應(yīng)被視為限制性的。
在使本發(fā)明變成實(shí)踐的同時，本發(fā)明人已揭露了抗第三方中樞記憶性T (Tcm)細(xì)胞的新群體，其在移植后歸巢至淋巴結(jié)且誘導(dǎo)耐受而不誘導(dǎo)移植物抗宿主(GVH)反應(yīng)。
如下文和下述實(shí)施例節(jié)段中所示，本發(fā)明人已生成耐受性誘導(dǎo)Tcm細(xì)胞的新群體，通過首先在不存在細(xì)胞因子的情況下，使CD8+ T細(xì)胞暴露于抗第三方刺激2天，并且隨后在無抗原環(huán)境中在IL-15的存在下將所得到的細(xì)胞培養(yǎng)2周(參見圖2C)。通過本發(fā)明人生成的Tcm細(xì)胞包括Tcm表型(例如⑶44+⑶62L+表達(dá)細(xì)胞，圖2B)，并且在移植后歸巢至淋巴結(jié)(圖3A-B)。此外，這些細(xì)胞在移植后數(shù)天在淋巴結(jié)中清晰可見(圖5B和6A-E)。本發(fā)明的Tcm細(xì)胞的顯著耐受效應(yīng)在T細(xì)胞耗盡骨髓(TDBM)連同抗第三方Tcm細(xì)胞移植到受體內(nèi)而無進(jìn)一步處理后是顯而易見的(圖7、10和11)。這些Tcm細(xì)胞在BM移植受體中展示出強(qiáng)增殖和延長的持續(xù)性(圖6K和圖9C-E)?？沟谌絋cm細(xì)胞的使用使得移植物接受成為可能，而無移植物抗宿主病(GVHD)，如圖12和13中所示?？傊羞@些發(fā)現(xiàn)證實(shí)抗第三方Tcm細(xì)胞作為移植物的使用促進(jìn)細(xì)胞用于在移植物的長期存活中的使用。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了分離的細(xì)胞群體，其包括具有中樞記憶性T 淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方細(xì)胞，所述細(xì)胞是誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞并且在移植后能夠歸巢至淋巴結(jié)。
如本文使用的，短語“分離的細(xì)胞群體”指已從其天然環(huán)境(例如人體)中分離的細(xì)胞。
如本文使用的，術(shù)語“非GVHD”指基本上不具有移植物抗宿主誘導(dǎo)反應(yīng)性。因此， 本發(fā)明的細(xì)胞這樣生成，以便不顯著引起移植物抗宿主病(GVHD)，如通過移植后100天移植小鼠的存活、重量和總體外觀證明的。
如本文使用的，短語“抗第三方細(xì)胞”指針對(例如通過T細(xì)胞識別)一種或多種第三方抗原的淋巴細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞)。
如本文使用的，短語“一種或多種第三方抗原”指一種或多種可溶性或不溶性(例如膜相關(guān))抗原，其不存在于供體或受體中，如下文詳細(xì)描述的。
例如，第三方抗原可以是第三方細(xì)胞、病毒抗原例如EB病毒(EBV)或巨細(xì)胞病毒 (CMV)、或細(xì)菌抗原例如鞭毛蛋白。病毒或細(xì)菌抗原可以由細(xì)胞(例如細(xì)胞系)呈遞，所述細(xì)胞隨之感染或以其他方式使得表達(dá)病毒/細(xì)菌蛋白質(zhì)。自體或非自體抗原呈遞細(xì)胞可以用于呈遞與之融合或由之裝載的短合成肽。此類短肽可以是病毒衍生的肽或代表任何其他抗原的肽。
專門軟件可以用于分析病毒或其他序列，以鑒定免疫原性短肽，即可在I類MHC或 II類MHC背景中呈遞的肽。
第三方細(xì)胞就受體而言可以是同種異體或異種的(在下文進(jìn)一步詳細(xì)解釋)。在同種異體第三方細(xì)胞的情況下，此類細(xì)胞具有不同于供體那種但與受體HLA抗原不交叉反應(yīng)的HLA抗原，從而使得針對此類細(xì)胞生成的抗第三方細(xì)胞針對移植物或受體抗原不是反應(yīng)的。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，同種異體或異種第三方細(xì)胞是選自由外周血淋巴細(xì)胞(PBL)、脾或淋巴結(jié)純化的細(xì)胞，細(xì)胞因子動員的PBL和體外擴(kuò)增的抗原呈遞樹突細(xì)胞 (APC)的刺激細(xì)胞。
第三方抗原可以在細(xì)胞、病毒或細(xì)菌表面上呈遞或由其衍生和/或純化。另外，病毒或細(xì)菌抗原可以在受感染細(xì)胞上展示，并且細(xì)胞抗原可以在人工媒介物例如脂質(zhì)體上展
示 ο
此外，第三方抗原可以是例如由各種來源提取或純化的蛋白質(zhì)?？梢猿洚?dāng)根據(jù)本發(fā)明的第三方抗原的純化的蛋白質(zhì)例子是卵白蛋白。設(shè)想了其他例子。
利用細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、病毒感染的、細(xì)菌感染的、病毒肽或細(xì)菌肽呈遞細(xì)胞作為第三方抗原是特別有利的，因?yàn)榇祟惖谌娇乖乖瓫Q定簇的不同排列，并且像這樣指導(dǎo)不同群體的抗第三方細(xì)胞形成，這可以進(jìn)一步作用于更快速的T細(xì)胞重建，在其中需要此類重建的情況下，例如在致死或亞致死照射或化學(xué)治療程序后。
此外，當(dāng)?shù)谌郊?xì)胞針對第三方抗原時，由于由LFA1-I/CAM1結(jié)合介導(dǎo)的TCR不依賴性殺死[Arditti 等人，Blood (2005) 105 (8) :3365-71. Epub 2004 Jul 6]，獲得至少一些抗疾病細(xì)胞移植物(例如癌細(xì)胞，例如抗白血病移植物)活性似乎是合理的。
根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的抗第三方細(xì)胞包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型。
如本文使用的，短語“中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型”指歸巢至淋巴結(jié)的T細(xì)胞毒性細(xì)胞亞組。在人中具有Tcm表型的細(xì)胞一般包括⑶8+/⑶62L+/⑶45R0+/L-選擇素+/CD45RA-。根據(jù)一個更具體的實(shí)施方案，Tcm表型包括CD8+/CD62L+/ CCR7+/CD45R0+/ L-選擇素+/⑶45RA。應(yīng)當(dāng)理解Tcm細(xì)胞可以在單一細(xì)胞上表達(dá)所有標(biāo)志標(biāo)記，或可以在單一細(xì)胞上表達(dá)僅部分標(biāo)志標(biāo)記。
應(yīng)當(dāng)理解至少至少30%、至少40 % 50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少100 %的分離的細(xì)胞群體包括具有Tcm細(xì)胞標(biāo)志的細(xì)胞。[0091]如所述的，Tcm細(xì)胞在移植后一般歸巢至淋巴結(jié)。根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的抗第三方Tcm細(xì)胞在移植后可以歸巢至任何淋巴結(jié)，作為例子外周淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié) (如下述實(shí)施例節(jié)段的實(shí)施例4中詳細(xì)描述的)。這些細(xì)胞的歸巢性質(zhì)允許其以快速有效的方式發(fā)揮其耐受效應(yīng)。
因此，本發(fā)明的抗第三方Tcm細(xì)胞是誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞。
如本文使用的，短語“誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞”指當(dāng)它們與其接觸時，引起受體細(xì)胞(例如受體T細(xì)胞)的應(yīng)答性下降的細(xì)胞。誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞包括反抑細(xì)胞(即在與其接觸后導(dǎo)致宿主T細(xì)胞凋亡的T細(xì)胞)，如先前在PCT公開號WO 2001/049243和WO 2002/1(^971中描述的。
根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的Tcm細(xì)胞可以是首次用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞(例如未遺傳修飾的)或遺傳修飾的細(xì)胞(例如已遺傳改造為表達(dá)或不表達(dá)特異性基因、標(biāo)記或肽或者分泌或不分泌特異性細(xì)胞因子的細(xì)胞)。本領(lǐng)域已知的任何方法都可以在遺傳改造的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)，例如通過相關(guān)基因的滅活或通過干擾多肽表達(dá)的反義RNA的插入(參見例如在此引入作為參考的W0/2000/039294)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了生成分離的細(xì)胞群體的方法，該方法包括 (a)在允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件下，使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸；和(b)在允許包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件下，在IL-15的存在下培養(yǎng)得自步驟(a)的細(xì)胞。
上述方法的具體實(shí)施方案在下文實(shí)施例1和3中詳細(xì)提供。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實(shí)施方案，抗第三方細(xì)胞通過下述生成首先在剝奪細(xì)胞因子(例如不添加細(xì)胞因子)的培養(yǎng)中，使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸。這個步驟一般執(zhí)行約2天，并且允許GVH反應(yīng)細(xì)胞(例如T細(xì)胞)的消除。接下來，在無抗原環(huán)境中在IL-15的存在下將抗第三方細(xì)胞培養(yǎng)約14天。培養(yǎng)可以在另外的細(xì)胞因子例如IL-7 和/或IL-21的存在下進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。這個過程使得抗第三方細(xì)胞能夠增殖，所述抗第三方細(xì)胞包括中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型且剝奪GVHD反應(yīng)性。
應(yīng)當(dāng)理解在IL-15的存在下培養(yǎng)細(xì)胞前，可以執(zhí)行允許選擇CD8+細(xì)胞的另外步驟，例如通過使用MACS珠。此類步驟可以是有利的，以便增加培養(yǎng)物內(nèi)的CD8+細(xì)胞純度(即消除細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的其他淋巴細(xì)胞，例如T CD4+細(xì)胞)，或以便增加CD8+ T細(xì)胞數(shù)目。
根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，本發(fā)明的非同基因PBMC就受試者而言可以是同種異體或異種的(在下文進(jìn)一步詳細(xì)解釋)。PBMC的來源可以就細(xì)胞的預(yù)期用途而言進(jìn)行確定(參見下文進(jìn)一步細(xì)節(jié))，并且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開內(nèi)容。
應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)呈現(xiàn)的教導(dǎo)還可以使用同基因PBMC (例如來自受試者)(即在同基因Tcm細(xì)胞對于處理可以是有利的情況下，參見下文細(xì)節(jié))。生成此類細(xì)胞可以如對于非同基因細(xì)胞詳細(xì)描述的執(zhí)行。
誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞的使用在其中需要消除移植物排斥且克服移植物抗宿主病 (GVHD)的情況下是特別有利的，例如在同種異體或異種細(xì)胞或組織的移植中。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了治療需要細(xì)胞或組織移植的受試者的方法，該方法包括將細(xì)胞或器官移植物移植到受試者內(nèi)；和給受試者施用治療有效量的分離的細(xì)胞群體。
如本文使用的，術(shù)語“治療”包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)狀況的進(jìn)展，基本上改善狀況的臨床或美學(xué)(aesthetical)癥狀，或基本上預(yù)防狀況的臨床或美學(xué)癥狀的出現(xiàn)。
如本文使用的，術(shù)語“受試者”或“有此需要的受試者”指哺乳動物，優(yōu)選人類，需要細(xì)胞或組織移植的處于任何年齡的男性或女性。一般地，由于順應(yīng)經(jīng)由細(xì)胞或組織移植的治療的病癥或病理學(xué)或不希望有的狀況、狀態(tài)或癥狀，或身體、形態(tài)或生理學(xué)異常，受試者需要細(xì)胞或組織移植(在本文中也稱為受體)。此類病癥的例子在下文進(jìn)一步提供。
如本文使用的，短語“細(xì)胞或組織移植”指體細(xì)胞(例如單細(xì)胞或細(xì)胞群)或組織 (例如可以全部或部分移植的實(shí)體組織或軟組織)。根據(jù)呈現(xiàn)的教導(dǎo)可以移植的示例性組織包括但不限于肝、胰腺、脾、腎、心臟、肺、皮膚、腸和淋巴樣/造血組織(例如淋巴結(jié)、Peyer 氏斑、胸腺或骨髓)。根據(jù)呈現(xiàn)的教導(dǎo)可以移植的示例性細(xì)胞包括但不限于未成熟造血細(xì)胞。此外，本發(fā)明還考慮了整個器官例如腎、心臟、肝或皮膚的移植。
依賴于應(yīng)用，該方法可以使用就受試者而言同基因或非同基因的細(xì)胞或組織實(shí)現(xiàn)。
如本文使用的，術(shù)語“同基因的”指衍生自與受試者在遺傳上基本上等同的個體的細(xì)胞或組織。一般地，基本上完全近親交配的哺乳動物、哺乳動物克隆或同卵雙生哺乳動物是同基因的。
同基因細(xì)胞或組織的例子包括衍生自受試者(在本領(lǐng)域中也稱為“自體的”)、受試者克隆、或受試者的同卵雙生子的細(xì)胞或組織。
如本文使用的，術(shù)語“非同基因的”指衍生自對于受試者的淋巴細(xì)胞是同種異體或異種的個體的細(xì)胞或組織。
如本文使用的，術(shù)語“同種異體的”指這樣的細(xì)胞或組織，其衍生自具有與受試者相同物種的供體，但對于受試者是基本上非克隆的。一般地，相同物種的遠(yuǎn)親雜交、非接合體雙生(non-zygotic twin)哺乳動物彼此是同種異體的。應(yīng)當(dāng)理解同種異體供體就受試者而言可以是HLA相同或HLA不相同的。
如本文使用的，術(shù)語“異種的”指相對于受試者的大量比例淋巴細(xì)胞的種類，基本上表達(dá)不同種類的抗原的細(xì)胞或組織。一般地，不同物種的遠(yuǎn)親雜交哺乳動物彼此是異種的。
本發(fā)明設(shè)想異種細(xì)胞或組織衍生自各種物種，例如但不限于?？?例如牛)、馬科 (例如馬)、豬科(例如豬)、羊科(例如山羊、綿羊)、貓科(例如家貓(Felis domestica))、犬科(例如家犬(Canis domestica))、嚙齒類(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠)或靈長類 (例如黑猩猩、恒河猴、獼猴、狨猴)。
異種起源(例如豬起源)的細(xì)胞或組織優(yōu)選得自已知不含人畜共患病例如豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的來源。類似地，人衍生的細(xì)胞或組織優(yōu)選得自基本上無病原體來源。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，受試者和供體都是人。
依賴于應(yīng)用和可用來源，本發(fā)明的細(xì)胞或組織可以得自出生前的生物、出生后的生物、成體或尸體供體。此外，依賴于需要的應(yīng)用，細(xì)胞或組織可以是首次用于實(shí)驗(yàn)或遺傳修飾的。此類確定完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力內(nèi)。[0115]本領(lǐng)域已知的任何方法都可以用于獲得細(xì)胞或組織(例如用于移植)。
將細(xì)胞或組織移植到受試者內(nèi)可以以眾多方式實(shí)現(xiàn)，依賴于各種參數(shù)，例如細(xì)胞或組織類型；受體疾病(例如器官衰竭)的類型、階段或嚴(yán)重性；對于受試者特異的身體或生理學(xué)參數(shù)；和/或所需治療后果。
移植本發(fā)明的細(xì)胞或組織移植物可以通過將細(xì)胞或組織移植物移植到各種解剖學(xué)定位中的任何一個內(nèi)來實(shí)現(xiàn)，依賴于應(yīng)用。細(xì)胞或組織移植物可以移植到等位的解剖學(xué)定位內(nèi)(對于移植物正常的解剖學(xué)定位)或異位的解剖學(xué)定位內(nèi)(對于移植物異常的解剖學(xué)定位)。依賴于應(yīng)用，細(xì)胞或組織移植物可以有利地植入腎囊下或腎、睪丸脂肪、皮下組織、 網(wǎng)膜、門靜脈、肝、脾、心腔、心臟、胸腔、肺、皮膚、胰腺和/或腹內(nèi)腔內(nèi)。
例如，根據(jù)呈現(xiàn)的教導(dǎo)肝組織可以移植到肝、門靜脈、腎囊、皮下組織、網(wǎng)膜、脾和腹內(nèi)腔內(nèi)。肝移植到各種解剖學(xué)定位例如這些內(nèi)是本領(lǐng)域通常實(shí)踐的，以治療順應(yīng)經(jīng)由肝臟移植治療的疾病(例如肝臟衰竭)。類似地，根據(jù)本發(fā)明移植胰腺組織可以通過將組織移植到門靜脈、肝、胰腺、睪丸脂肪、皮下組織、網(wǎng)膜、腸彎(小腸U環(huán)的漿膜下層)和/或腹內(nèi)腔內(nèi)有利地實(shí)現(xiàn)。胰腺組織的移植可以用于治療順應(yīng)經(jīng)由胰腺移植治療的疾病(例如糖尿病)。同樣地，組織例如腎、心臟、肺或皮膚組織的移植可以在上文描述的任何解剖學(xué)定位內(nèi)執(zhí)行，用于治療患有例如腎衰竭、心力衰竭、肺衰竭或皮膚損傷(例如燒傷)的受體的目的。
本發(fā)明的方法還可以用于例如治療患有需要未成熟造血細(xì)胞移植的疾病的受體。
在后面一種情況下，可以衍生自例如供體的骨髓、動員外周血(通過例如白細(xì)胞去除術(shù))、胎兒肝、卵黃囊和/或臍帶血且優(yōu)選τ細(xì)胞耗盡CD34+未成熟造血細(xì)胞的未成熟同種異體或異種造血細(xì)胞(包括干細(xì)胞)，可以移植給患有疾病的受體。此類疾病包括但不限于白血病例如急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性非成淋巴細(xì)胞性白血病(ANLL)、急性髓細(xì)胞性白血病(AML)或慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)、重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征(SCID)包括腺苷脫氨酶(ADA)、骨硬化癥、再生障礙性貧血、Gaucher氏病、地中海貧血和其他先天或遺傳上決定的造血異常。
應(yīng)當(dāng)理解使用本領(lǐng)域已知用于細(xì)胞移植的任何方法，例如但不限于細(xì)胞輸注(例如I. V.)或經(jīng)由腹膜內(nèi)途徑，可以將本發(fā)明的未成熟同種異體或異種造血細(xì)胞移植到受體內(nèi)。
任選地，當(dāng)將本發(fā)明的細(xì)胞或組織移植物移植到具有缺陷器官的受試者內(nèi)時，首先從受試者中至少部分去除衰退器官可以是有利的，以便使得移植物能夠最佳發(fā)育，及其與受試者的解剖學(xué)/生理學(xué)的結(jié)構(gòu)/功能整合。
本發(fā)明的方法還設(shè)想了在受試者可以通過此類程序有利地影響的情況下幾種器官(例如心臟和肺組織)的共移植。
根據(jù)呈現(xiàn)的教導(dǎo)將細(xì)胞或組織移植物移植到受試者內(nèi)后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)踐，根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域技術(shù)中的任何一種監(jiān)控器官的生長功能性和免疫相容性是合理的。例如， 胰腺組織移植物的功能性可以在移植后通過標(biāo)準(zhǔn)胰腺功能測試(例如胰島素血清水平的分析)進(jìn)行監(jiān)控。同樣地，肝組織移植物可以在移植后通過標(biāo)準(zhǔn)肝功能測試(例如白蛋白、總蛋白、ALT、AST和膽紅素血清水平的分析，和凝血時間的分析)進(jìn)行監(jiān)控。細(xì)胞或組織的結(jié)構(gòu)發(fā)展可以經(jīng)由計算機(jī)斷層掃描或超聲成像進(jìn)行監(jiān)控。
依賴于移植背景，為了促進(jìn)細(xì)胞或組織移植物的移入，該方法可以進(jìn)一步有利地包括在細(xì)胞或組織移植物移植之前、同時或之后用免疫抑制方案調(diào)節(jié)受試者。
合適類型的免疫抑制方案的例子包括免疫抑制藥物、誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞群體(如下文詳細(xì)描述的)和/或免疫抑制照射的施用。
用于選擇且施用合適免疫抑制方案用于移植的豐富指導(dǎo)在本領(lǐng)域文獻(xiàn)中提供(例如，參考Kirkpatrick CH.和 Rowlands DT Jr. , 1992. JAMA. 268,2952 ；Higgins RM.等 A, 1996. Lancet 348,1208 ；Suthanthiran Μ.禾口 Strom TB. , 1996. New Engl. J. Med. 331,365 ；Midthun DE.等人，1997. Mayo Clin Proc. 72,175 ；Morrison VA.等人，1994. Am J Med. 97，14 ；Hanto Dff.，1995. Annu Rev Med. 46，381 ；Senderowicz AM.等人，1997. Ann Intern Med. 126，882 ;Vincenti F.等人，1998. New Engl. J. Med. 338,161 ；Dantal J.等人 1998. Lancet 351,623)。
優(yōu)選地，免疫抑制方案由給受試者施用至少一種免疫抑制劑組成。
免疫抑制劑的例子包括但不限于氨甲蝶呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢菌素、環(huán)孢菌素A、氯喹、羥氯喹、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopyrine)、金鹽、D-青霉胺、來氟米特、硫唑嘌呤、 阿那白滯素、英夫利昔單抗(REMICADE)、依那西普、TNFa、阻滯劑、靶向炎癥細(xì)胞因子的生物制劑、和非類固醇抗炎藥(NSAID)。NSAID的例子包括但不限于乙酰水楊酸、水楊酸膽堿鎂、二氟尼杉卩、水楊酸鎂、雙水楊酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯滅酸鹽、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、乙氨酚、布洛芬、Cox-2抑制劑、曲馬多、雷帕霉素(西羅莫司)和雷帕霉素類似物(例如 CCI-779、RAD001、AP23573)。這些試劑可以個別或組合施用。
與移植類型無關(guān)，為了避免移植物排斥和移植物抗宿主病，本發(fā)明的方法利用新型抗第三方Tcm細(xì)胞(如上文詳細(xì)描述的)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，這些抗第三方Tcm細(xì)胞與細(xì)胞或組織移植物的移植同時、之前或之后施用。
抗第三方Tcm細(xì)胞可以經(jīng)由本領(lǐng)域已知用于細(xì)胞移植的任何方法進(jìn)行施用，例如但不限于細(xì)胞輸注(例如I. V.)或經(jīng)由腹膜內(nèi)途徑。
不受理論束縛，治療有效量是對于耐受作用、抗瘤效應(yīng)和/或免疫重建有效而不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方Tcm細(xì)胞量。因?yàn)楸景l(fā)明的Tcm細(xì)胞在移植后歸巢至淋巴結(jié)，所以可能需要較低的細(xì)胞量(與先前使用的細(xì)胞劑量比較，參見例如WO 2001/049243),以達(dá)到細(xì)胞的有利效應(yīng)(例如耐受作用、抗瘤效應(yīng)和/或免疫重建)。應(yīng)當(dāng)理解可能需要與本發(fā)明的 Tcm細(xì)胞結(jié)合的較低水平的免疫抑制藥物(例如從治療方案中排除雷帕霉素)。
治療有效量的測定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開內(nèi)容。
對于本發(fā)明的方法中使用的任何制劑，治療有效量或劑量可以最初由體外和細(xì)胞培養(yǎng)測定進(jìn)行估計。例如，劑量可以在動物模型中配制以達(dá)到所需濃度或滴度。此類信息可以用于更準(zhǔn)確度確定人中的有用劑量。
例如，在組織移植的情況下，輸注給受體的抗第三方Tcm細(xì)胞數(shù)目應(yīng)超過1 χ IO4 /Kg體重。輸注給受體的抗第三方Tcm細(xì)胞數(shù)目應(yīng)在1 χ IO4 /Kg體重-1 χ IO8 /Kg體重范圍中。
因此，本發(fā)明的新型抗第三方Tcm細(xì)胞可以用作用于細(xì)胞或組織移植的輔助療法(如上文描述的)。此外，本發(fā)明的新型抗第三方Tcm細(xì)胞也賦予移植物抗患病細(xì)胞活性(在上文詳細(xì)描述)，并且因此本身可以用于疾病治療。
根據(jù)一個具體實(shí)施方案，為了獲得抗患病細(xì)胞活性(例如抗瘤效應(yīng)例如抗白血病治療)移植物，可以使用同基因細(xì)胞以及非同基因細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于治療任何疾病，例如但不限于惡性疾病、與移植物移植相關(guān)的疾病、傳染病例如病毒疾病或細(xì)菌病、炎性疾病和/或自身免疫疾病。
可以使用本發(fā)明的方法治療的疾病包括但不限于惡性疾病例如白血病[例如急性淋巴細(xì)胞性、急性成淋巴細(xì)胞性、急性成淋巴細(xì)胞性前B細(xì)胞、急性成淋巴細(xì)胞性T細(xì)胞白血病、急性-成巨核細(xì)胞性、單核細(xì)胞、急性髓性、急性髓樣、急性髓樣伴嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、B細(xì)胞、嗜堿性、慢性髓樣、慢性、B細(xì)胞、嗜酸性、Friend、粒細(xì)胞或髓細(xì)胞、多毛細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞、成髓細(xì)胞、髓樣、骨髓單核細(xì)胞性、漿細(xì)胞、前B細(xì)胞、前髓細(xì)胞性、亞急性、T細(xì)胞、淋巴樣贅生物、骨髓樣惡性腫瘤素質(zhì)、急性非淋巴細(xì)胞性白血病、T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(T-ALL^P B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)]、淋巴瘤(例如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、B細(xì)胞、伯基特、皮膚T細(xì)胞、 組織細(xì)胞、成淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞、胸腺)、癌、胚細(xì)胞瘤和肉瘤；與移植物移植有關(guān)的疾病(例如移植物排斥、慢性移植物排斥、亞急性移植物排斥、過急性移植物排斥、急性移植物排斥和移植物抗宿主病)；傳染病包括但不限于慢性傳染病、亞急性傳染病、急性傳染病、病毒疾病 (例如EBV、CMV、HIV)、細(xì)菌病、原生動物病、寄生蟲病、真菌病、支原體病和朊病毒疾病；炎性疾病(例如慢性炎性疾病和急性炎性疾病)；和自身免疫疾病(例如心血管疾病、類風(fēng)濕性疾病、腺病、胃腸疾病、皮膚疾病、肝病、神經(jīng)學(xué)疾病、肌疾病、腎疾病、與繁殖相關(guān)的疾病、結(jié)締組織疾病和全身性疾病)。
因此，本發(fā)明的方法可以另外有利地應(yīng)用于治療受試者中的疾病，同時伴隨地促進(jìn)與抗第三方Tcm細(xì)胞同基因的細(xì)胞或組織移植物的移入(例如在其中細(xì)胞或組織移植物和抗第三方細(xì)胞衍生自相同供體的情況下)。
如本文使用的，術(shù)語“約”指士 10 %。
術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”及其變化意指“包括但不限于”。
術(shù)語“由……組成意指“包括且限制于”。
術(shù)語“基本上由……組成”意指組合物、方法或結(jié)構(gòu)可以包括另外的成分、步驟和/ 或部分，但僅在另外的成分、步驟和/或部分實(shí)質(zhì)上不改變請求保護(hù)的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本和新型特征的情況下。
如本文使用的，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文另有明確說明。例如，術(shù)語“化合物”或“至少一種化合物”可以包括多種化合物，包括其混合物。
本申請自始至終，本發(fā)明的各種實(shí)施方案可以以范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解以范圍形式的描述僅為了方便和簡短起見，并且不應(yīng)解釋為對本發(fā)明范圍的固定限制。因此，范圍的描述應(yīng)被視為已具體公開所有可能子范圍以及在那個范圍內(nèi)的個別數(shù)值。例如，范圍的描述例如1無論何時在本文中指出數(shù)目范圍，它意欲包括在所示范圍內(nèi)的任何引用數(shù)目(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語第一個指示數(shù)目和第二個指示數(shù)目“之間的范圍”和“從”第一個指示數(shù)目“到”第二個指示數(shù)目“的范圍”在本文中可互換使用，并且意欲包括第一個和第二個指示數(shù)目以及其間的所有分?jǐn)?shù)和指數(shù)數(shù)目。
如本文使用的，術(shù)語“方法”指用于完成給定任務(wù)的方式、方法、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從業(yè)者已知的那些方式、方法、技術(shù)和程序，或由于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從業(yè)者已知方式、方法、技術(shù)和程序容易開發(fā)的那些方式、方法、技術(shù)和程序。
應(yīng)當(dāng)理解為了明確起見在分開實(shí)施方案的背景中描述的本發(fā)明的特定特征也可以與單個實(shí)施方案組合提供。相反，為了簡短起見在單個實(shí)施方案的背景中描述的本發(fā)明的各種特征也可以分開或以任何合適的亞組合或如在本發(fā)明的任何其他所述實(shí)施方案中合適的提供。在各種實(shí)施方案的背景中描述的特定特征不視為那些實(shí)施方案的必需特征， 除非實(shí)施方案沒有那些元素是無效的。
如上文描述且如下文權(quán)利要求
節(jié)段請求保護(hù)的本發(fā)明的各種實(shí)施方案和方面在下述實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)支持。
實(shí)施例
現(xiàn)在參考下述實(shí)施例，這連同上述說明書一起以非限制性方式舉例說明本發(fā)明。
一般地，在本文中使用的命名法和在本發(fā)明中利用的實(shí)驗(yàn)室程序包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分解釋。參見例如，"Molecular Cloning :A laboratory Manual〃 Sambrook 等人，(1989) ；〃Current Protocols in Molecular Biology"第 I-III 卷 Ausubel，R. M.，編輯(1994) ；Ausubel 等人，"Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley 禾口 Sons，Baltimore，Maryland (1989)； Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning"， John Wiley & Sons， New York (1988);Watson 等人，〃Recombinant DNA^,Scientific American BooksiNew York ；Birren 等人(編輯)"Genome Analysis :A Laboratory Manual Series"，第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)；如美國專利號 4，666，828 ；4，683，202 ； 4，801，531 ;5，192,659 和 5，272，057 中所示的方法；"Cell Biology :A Laboratory Handbook〃，第 I-III 卷 Cellis，J· Ε·，編輯(1994);〃Current Protocols in Immunology^ 第 I-III 卷 Coligan J. Ε·，編輯(1994) ;Stites 等人(編輯)，"Basic and Clinical Immunology"(第 8 版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT (1994) ;Mishell 和 Shiigi (編輯)，"Selected Methods in Cellular Immunology"，W. H. Freeman and Co.，New York (1980)；可用的免疫測定在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛描述，參見例如，美國專利號3，791，932 ； 3，839，153 ；3，850，752 ；3，850，578 ；3，853，987 ；3，867，517 ；3，879，262 ；3，901，654 ； 3，935，074 ；3，984，533 ；3，996，345 ；4，034，074 ；4，098，876 ；4，879，219 ；5，011，771 和 5, 281, 521 ；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, Μ. J.，編輯(1984) ;“Nucleic Acid Hybridization" Hames，B. D.禾口 Higgins S. J.，編輯(1985) ；〃Transcription and Translation" Hames, B. D.禾口 Higgins S. J.，編輯(1984) ；〃Animal Cell Culture" Freshney, R. I.，編輯(1986)/,Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press，( 1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal， B. ， (1984)禾口 "Methods in Enzymology^ 第 1-317 卷，Academic Press ；^PCR Protocols :A Guide To Methods AndApplications〃，Academic Press, San Diego, CA (1990) ;Marshak 等人，"Strategies for Protein Purification and Characterization實(shí)施例1 一般材料和實(shí)驗(yàn)程序動物
6-12 周齡的雌性小鼠 BALB/c (H_2d)、CB6 (H_2bd)、FVB (H-2”、SJL (H_2S)、C57BL/6 (H-2b)、 C3H (H-2k)、 Nude-BALB/C 禾Π Nude_C57BL/6 得自 Weizmann Institute Animal Center (Rehovot, Israel)。使 C3H 和 BALB/C 小鼠雜交，以生成(C3HxBALB/C) Fl 小鼠。 表達(dá)來自對于H-2Ld具有特異性的CTL克隆2c的TCR的轉(zhuǎn)基因(Tg) H_2b小鼠的育種對由 Janko Nikolic-Zugic (Sloan_Kettering，NY)友情提供。這些 iTg 小鼠的后代在 Weizmann Institute Animal Breeding Center育種。所有小鼠維持在小籠(5只動物/籠)中并且喂養(yǎng)無菌食物和酸性水。
宿主非反應(yīng)的供體抗第三方CTL的制備
如先前由 Bachar 等人[Bachar-Lustig 等人，Blood. (2003)102:1943-1950]所述制備抗第三方CTL。簡言之，針對受照射(20 Gy)的FVB小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)供體小鼠的脾細(xì)胞。使應(yīng)答者(4 χ IO6個/ml)和刺激物(4 χ IO6個/ml)在RPMI完全組織培養(yǎng)基(CM)中在37°C 在5 % CO2/空氣溫箱中培養(yǎng)6天。培養(yǎng)起始后6天，使細(xì)胞在Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech AB) ± ^v ^ (fractionated), ^ J. ^ ffi BD IMag CD8 Magnetic Particles (BD Pharmingen)，對淋巴樣級分實(shí)施⑶8+細(xì)胞的陽性選擇。分離的細(xì)胞(1 χ IO6個/ml)用受照射(20 Gy)的第三方脾細(xì)胞(4 χ IO6個/ml)再刺激，并且每第二天將人 rIL-2 (40 U/ml，Eurocetus)加入混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)培養(yǎng)物中。在第16天時，收獲MLR培養(yǎng)物，在Ficoll-Paque上分級并且通過FACS就其⑶8純度進(jìn)行分析。
抗第三方Tcm細(xì)胞的制備
針對受照射的第三方(20 Gy) FVB小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)供體小鼠的脾細(xì)胞。使應(yīng)答者(4 χ IO6個/ml)和刺激物(4 χ IO6個/ml)在RPMI完全組織培養(yǎng)基(CM)中在37°C在5 % CO2/空氣溫箱中培養(yǎng)60小時。培養(yǎng)起始后60小時，使細(xì)胞在Ficoll-Paque(Amersham Pharmacia Biotech AB)上分級，并且使用BD IMag CD8 Magnetic ParticlesCBD Pharmingen)，對淋巴樣級分實(shí)施CD8+細(xì)胞的陽性選擇。分離的細(xì)胞(1 χ IO6個/ml)與rIL-15(20 ng/ml,R&D) 一起鋪平板。每第二天替換培養(yǎng)基和細(xì)胞因子。在第16天時，收獲細(xì)胞，在Ficoll-Paque 上分級并且通過FACS就其Tcm純度(⑶8、⑶62L和⑶44表達(dá))進(jìn)行分析。
T細(xì)胞介導(dǎo)的同種異體移植物排斥模型
在第-2天使宿主雌性小鼠(13-14周齡)暴露于單劑量的10 Gy (超致死調(diào)節(jié)的)TBI。 第二天小鼠接受靜脈內(nèi)1.25 χ IO4個未分離宿主T細(xì)胞。在第0天時執(zhí)行與待評估反抑細(xì)胞結(jié)合的3 XlO6個同種異體NudeBM細(xì)胞的移植。
宿主T細(xì)胞制備
宿主小鼠的脾細(xì)胞在Ficoll/I^aque上進(jìn)行分級，并且通過磁性細(xì)胞分選(MACS)對分離的單核細(xì)胞實(shí)施T細(xì)胞(⑶4+加上⑶8+)的陽性選擇。
體內(nèi)成像
使1 χ IO7個靶細(xì)胞與近紅外線親脂羰花青染料(DIR，Invitrogen) 一起在包含1. 5 μδ/πι1 WR染料和0.5 %乙醇的10-ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中在室溫孵育60分鐘。其后， 細(xì)胞用PBS洗滌2次，并且通過臺盼藍(lán)染色驗(yàn)證標(biāo)記細(xì)胞的活力。WR標(biāo)記的細(xì)胞隨后連同 T耗盡BM —起移植到受超致死照射的宿主小鼠內(nèi)，所述宿主小鼠先前用作為移植物排斥誘導(dǎo)物的純化宿主T細(xì)胞輸注(如上文詳細(xì)描述的)。在移植后的指定時間，通過與Pixelfly QE (PCO,Kelheim,德國)電荷耦合器件(CCD)照相機(jī)耦合的光學(xué)全身成像系統(tǒng)(IVIS 100， Xenogen)監(jiān)控小鼠。在IVIS中的激發(fā)和發(fā)射濾波器設(shè)置分別為710CD8+細(xì)胞使用細(xì)胞熒光分析的體內(nèi)追蹤
在BM移植和靶細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移后60小時和6. 5天，從宿主小鼠中收獲淋巴結(jié)、BMJf 和脾(如上文對于體內(nèi)成像方案描述的)。由每個器官制備單細(xì)胞懸浮液，并且在Ficoll上分級細(xì)胞。細(xì)胞隨后用抗H-2kb、抗H-2Dd、抗CD8和抗CD62L Abs (BD bioscience)進(jìn)行染色，并且懸浮于恒定體積的PBS中。在每種樣品的固定時間計數(shù)后執(zhí)行FACS分析。
在2c TCR Tg小鼠模型中關(guān)于反抑活性的測定
表達(dá)對于H-2Ld小鼠具有特異性的TCR的2c Tg H_2b小鼠的脾細(xì)胞在反抑測定中自始至終用作效應(yīng)細(xì)胞。收獲脾細(xì)胞，在冷紅細(xì)胞(RBC)裂解緩沖液(ACK緩沖液)中裂解，以去除紅細(xì)胞，并且在RPMI完全組織培養(yǎng)基(CTMC)中達(dá)到2 χ IO6個細(xì)胞/mL的濃度。隨后在以指定濃度的待評估反抑細(xì)胞(CB6 H-2bd起源)的存在下用受照射(20 Gy)的BALB/c 脾細(xì)胞(2 χ IO6個/ml)刺激細(xì)胞。使培養(yǎng)物在U形96孔板中孵育72小時。通過測量通過針對克隆型抗H-2Ld TCR的1B2 Ab特異性染色的活[對于7-氨基放線菌素_D (7AAD ； hvitrogen)]，⑶8+ 2C細(xì)胞水平的細(xì)胞熒光分析，監(jiān)控特異性效應(yīng)T細(xì)胞的耗盡。抑制活性通過下式進(jìn)行計算
(1-評估孔中的1B2+⑶8+細(xì)胞數(shù)目/對照孔中的1B2+CD8+細(xì)胞數(shù)目)χ100。
使用膜聯(lián)蛋白V通過流式細(xì)胞術(shù)評估凋亡
根據(jù)制造商的方案，用 Fitc嵌合狀態(tài)分析
通過細(xì)胞熒光測定法測定嵌合狀態(tài)。在Ficoll-Paque plus上分級外周血細(xì)胞，并且通過直接免疫熒光用對于供體特異的抗H2d單克隆抗體和對于宿主特異的抗H2k雙重染色每只小鼠的分離單核細(xì)胞。
流式細(xì)胞術(shù)分析
使用修飾的 Becton Dickinson FAC^can 執(zhí)行 FACS 分析。用對于 CD8 α-PE/FITC/ APC、CD3-PE/FITC/APC、CD62L-PE/FITC/APC、CD44-PE/FITC/APC、腿b_PE/FITC、H2Dd-PE/ FITC、H2Kk-PE/FITC (BD Pharmigen), 1B2 生物素化的和鏈霉抗生物素蛋白-APC (Jackson Laboratories)特異的標(biāo)記抗體染色細(xì)胞。根據(jù)制造商的說明書(BD Wiarmigen)完成膜聯(lián)蛋白V和7AAD染色。
在2c TCR Tg小鼠模型中關(guān)于反抑活性的體外測定
如先前所述完成關(guān)于反抑活性的體外測定3°。簡言之，在以指定濃度的待評估反抑細(xì)胞 (CB6 H-2bd起源)的存在下用受照射的BALB/c脾細(xì)胞刺激2c脾細(xì)胞。使培養(yǎng)物在96孔板中孵育72小時。通過測量通過1B2 Ab特異性染色的活(7AAD_)，⑶8+ 2C細(xì)胞水平的FACS 分析，監(jiān)控特異性效應(yīng)T細(xì)胞的耗盡。抑制活性通過下式進(jìn)行計算
(1-評估孔中的1B2+⑶8+細(xì)胞數(shù)目/對照孔中的1B2+CD8+細(xì)胞數(shù)目)χ100。
在2c TCR Tg小鼠模型中關(guān)于反抑活性的體內(nèi)測定
受致死照射(IOGy)的C57BL/6小鼠接受IxlO5個純化的CD8+ 2c細(xì)胞(MACS)和5x10s 個受照射(20Gy)的BALB/c脾細(xì)胞。第二天，小鼠用IxlO6個C57BL/6-NUDE BM細(xì)胞和切106 個Tcm移植。在移植后8天處死受體，收獲其脾，并且通過FACS監(jiān)控2c T細(xì)胞的耗盡，如先前節(jié)段中對于體外測定描述的。
統(tǒng)計分析
使用Kaplan-Meier曲線(對數(shù)秩檢驗(yàn))執(zhí)行存活數(shù)據(jù)的分析。使用斯氏t檢驗(yàn)執(zhí)行平均值的比較。
實(shí)施例2
與同基因和同種異體幼稚T細(xì)胞比較，抗第三方反抑CTL (先前描述的)的歸巢模式在生成宿主不反應(yīng)的反抑CTL的同時，細(xì)胞在IL-2的存在下經(jīng)歷針對第三方刺激物的延長的先體外后體內(nèi)激活。因此，細(xì)胞可能已發(fā)育成效應(yīng)CTL，這先前顯示展示炎癥尋求表型伴隨對淋巴結(jié)(LN)的歸巢能力的喪失[Reinhardt等人，Nature (2001) 410:101-105 ； Weninger 等人，J Exp Med. (2001)194:953-966；Masopust 等人，Science (2001) M13-2417]。此類遷移模式可以是關(guān)于在體外和體內(nèi)的第三方反抑CTL功效之間的差異的原因之一。為了測試這種可能性，本發(fā)明的發(fā)明人已使用體內(nèi)模型，以測試反抑抗第三方CTL的功效。這種緊急模型包括受致死照射的小鼠，其在刻度(graduated)數(shù)目的宿主 T細(xì)胞的存在或不存在下，接受同種異體T細(xì)胞耗盡骨髓(TDBM)，所述宿主T細(xì)胞到骨髓移植(BMT)后第三周時誘導(dǎo)排斥和致死性貧血。
簡言之，在誘導(dǎo)同種異體移植物排斥的過繼轉(zhuǎn)移的純化宿主T細(xì)胞(HTC)的存在或不存在下，受超致死照射的FVB小鼠用來自Balb/c小鼠的同種異體TDBM進(jìn)行放射保護(hù)。 這些BM受體(經(jīng)歷BM同種異體移植物排斥)另外用由WR染料標(biāo)記的不同類型的T細(xì)胞輸注，所述WR染料可以通過體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS)追蹤。
如圖IA-D中可見的，在標(biāo)記細(xì)胞輸注后36小時，同基因(HTC)和同種異體的幼稚 T細(xì)胞顯示對LN的顯著歸巢，而同種異體的抗第三方反抑CTL (先前描述的)集中于肝、肺和BM，并且從LN中排除(圖D)。同種異體的幼稚T細(xì)胞與HTC共定位的能力暗示，在移植物排斥模型的專門環(huán)境的背景中，顯示合適表型的同種異體T細(xì)胞可以歸巢至LN。
實(shí)施例3
在體外誘導(dǎo)抗第三方Tcm細(xì)胞
本發(fā)明的發(fā)明人先前已開發(fā)了抗第三方CTL，其顯示顯著的反抑活性(由于其!^asL表達(dá))，并且由于其針對第三方的延長激活而缺乏GVHD反應(yīng)性[Bachar-Lustig等人，Blood. (2003) 102:1943-1950]。然而，如上文實(shí)施例2中所述，這些細(xì)胞顯示弱LN歸巢。這些結(jié)果已導(dǎo)致本發(fā)明的發(fā)明人嘗試進(jìn)一步改善這些細(xì)胞的體內(nèi)反應(yīng)性，其通過設(shè)法在其針對第三方激活后誘導(dǎo)這些細(xì)胞中的中樞記憶性(Tcm)表型來進(jìn)行。Tcm表型先前已顯示與激活細(xì)胞(⑶44+)相關(guān)，所述激活細(xì)胞表達(dá)在其他表面抗原中使得其歸巢至LN的⑶62L和 CCR7[Sallusto 等人，Nature (1999) 401:708-712 ；Weninger 等人，同上；Masopust 等人， 同上]。
因此，本發(fā)明人已就其誘導(dǎo)抗第三方⑶8+T細(xì)胞的Tcm表型的能力測試了 IL_2或 IL-15的能力。因?yàn)镚VH反應(yīng)性的耗盡要求在測試細(xì)胞因子的存在下擴(kuò)增前的細(xì)胞因子饑餓，所以在短期和長期細(xì)胞因子剝奪期后的不同方案之間進(jìn)行比較。因此，在不存在細(xì)胞因子的情況下，⑶8+ T細(xì)胞經(jīng)歷用受照射的第三方刺激物的2天或6天刺激，并且隨后在IL-2 或IL-15的存在下進(jìn)一步培養(yǎng)，并且就⑶62L和⑶44表達(dá)進(jìn)行監(jiān)控(如上文實(shí)施例1中詳細(xì)描述的)。
如圖2A中所示，在用第三方刺激物刺激60小時后，在不存在細(xì)胞因子的情況下， ⑶8+T細(xì)胞維持⑶62L的表達(dá)(90 ± 5 %的細(xì)胞表達(dá)⑶62L)，而在刺激6天后僅18 土 6 %的⑶8+T細(xì)胞維持⑶62L的表達(dá)(ρ-值< 0.001)。與這個觀察一致，當(dāng)⑶8+T細(xì)胞在無 Ag環(huán)境中與IL-15進(jìn)一步培養(yǎng)時，在刺激期后，與經(jīng)歷6天刺激的細(xì)胞比較，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷60 小時刺激時，到培養(yǎng)第15天時誘導(dǎo)顯著更多的具有⑶44+CD62L+ Tcm表型的細(xì)胞(圖2B-C) (P-值=0.005)。在細(xì)胞的短(2天)第三方刺激后，IL-2的使用未能支持抗第三方Tcm細(xì)胞的顯著誘導(dǎo)(圖2B, ρ-值=0. 007)。
此外，到培養(yǎng)期結(jié)束時，經(jīng)歷6天第三方刺激且隨后與IL-2 —起培養(yǎng)且用其同源 Ag再激活的抗第三方CTL，大多數(shù)展示效應(yīng)物表型，并且僅4 ± 2 %的這些細(xì)胞已展示Tcm 表型(圖2B)，這些結(jié)果與上文實(shí)施例2中所述的這些細(xì)胞的外周歸巢模式一致(圖1D)。
指出⑶8+ T細(xì)胞(其經(jīng)歷長激活方案例如6天)更不易于變成Tcm表型的呈現(xiàn)結(jié)果，與指出存在其中Ag激活T細(xì)胞可以由IL-15驅(qū)動為Tcm表型的時間窗的先前研究一致 [Manjunath 等人，J Clin Invest. (2001) 108871-878 ;Carrio 等人，J Immunol. (2004) 172:7315-7323]。
實(shí)施例4
比較Tcm細(xì)胞與反抑CTL的LN歸巢
如上文實(shí)施例3中所示，本發(fā)明的結(jié)果明確證實(shí)Tcm樣表型可以由短期異構(gòu)激活和在 IL-15的存在下在無^Vg環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。然而，重要的是驗(yàn)證在移植物排斥模型的條件下，與由反抑CTL顯示的那種細(xì)胞比較，表達(dá)這種Tcm樣表型的細(xì)胞顯示更佳的LN 歸巢。
因此，如上文實(shí)施例1中所述生成Tcm細(xì)胞(本文描述的)和反抑CTL (先前呈現(xiàn)的)。在體外擴(kuò)增2周后，在IL-15的存在下，前面一種細(xì)胞就CD62L表達(dá)進(jìn)行陽性選擇，以產(chǎn)生Tcm細(xì)胞的純?nèi)后w(> 96 % OT62L+純度)，與展示低表達(dá)的⑶62L的反抑CTL (> 95 %⑶62L_純度)相反。細(xì)胞用WR進(jìn)行標(biāo)記，并且在上文實(shí)施例1和2中所述的移植物排斥模型的背景中，過繼轉(zhuǎn)移到BALB/C宿主內(nèi)。因?yàn)門cm細(xì)胞經(jīng)歷僅60小時的IL-2饑餓， 代替先前在體外和體內(nèi)顯示耗盡來自反抑CTL的GVHD活性的6天饑餓法[Bachar-Lustig 等人，同上]，所以呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)利用CB6 [ (C57BL/6*BALB/b)Fl，H2-bd]小鼠作為用于過繼轉(zhuǎn)移細(xì)胞的來源。在過繼轉(zhuǎn)移后2天(圖3A-B和圖4A-D)或6. 5天(圖5A-C和圖6A-J)，處死小鼠，并且使用全身先體外后體內(nèi)成像(圖3A-B和圖5A-C)和通過在器官磨碎后獲得的細(xì)胞懸浮液的FACS分析(圖4A-D和圖6A-J)，測定在不同器官中的CB6起源細(xì)胞的分布。
如由結(jié)果明顯的，移植后60小時的IVIS (圖3A-B)和FACS分析(圖4A_D)的確證實(shí)在2種細(xì)胞群體之間的遷移模式中的不同差異。雖然Tcm細(xì)胞在外周和腸系膜LN中明確可見(圖3A和4A-B)，但反抑CTL在這些器官中難以檢測出，并且主要在內(nèi)臟(肝、肺、脾) 和BM中發(fā)現(xiàn)(圖3B和4C-D)。
與反抑CTL形成對比，在6. 5天后也發(fā)現(xiàn)與Tcm細(xì)胞相似的模式，在LN中明確觀察到(圖5B)。使用FACS分析和在磨碎器官中的細(xì)胞直接計數(shù)(圖6A-J)，顯而易見反抑CTL 主要定位于脾、肝和BM (圖6F-J)，而在BMT后6. 5天在LN中發(fā)現(xiàn)是反抑CTL 23倍的Tcm 細(xì)胞(圖6A-E)。在BMT后2天已獲得相似結(jié)果(未顯示)。此外，發(fā)現(xiàn)從測試的所有器官中收獲的‘Tcm’總數(shù)目在BMT后2到6.5天之間增加9倍，與展示輕微增殖的‘CTL’形成鮮明對比(圖6K)。因此，得出結(jié)論‘Tcm’不僅歸巢至BMT受體的LN，還在移植后早期廣泛增殖。
實(shí)施例5
過繼轉(zhuǎn)移的Tcm細(xì)胞對TDBM同種異體移植物受體存活的作用因?yàn)門cm細(xì)胞有效歸巢至LN并且顯示反抑相關(guān)表型(數(shù)據(jù)未顯示)，這可能使得共定位的宿主細(xì)胞(HTC)的耐受作用成為可能，所以本發(fā)明的發(fā)明人評估了過繼轉(zhuǎn)移的抗第三方 Tcm細(xì)胞增強(qiáng)TDBM同種異體移植物受體存活的能力，而無需進(jìn)一步處理。這個研究在先前描述的移植物排斥模型中執(zhí)行(參見上文實(shí)施例1)，這特別設(shè)計為測量T細(xì)胞介導(dǎo)的TDBM 同種異體移植物排斥，而無來自干細(xì)胞競爭的干擾，這可能在暴露于減少強(qiáng)度調(diào)節(jié)的小鼠中發(fā)生。
因此，在過繼轉(zhuǎn)移的純化抗第三方Tcm細(xì)胞(> 95 %純度)的存在或不存在下，在來自裸露BALB/C供體的TDBM同種異體移植物移植前，C3H小鼠受致死照射并且用HTC輸注。(C3HxBALB/C) Fl小鼠用作Tcm細(xì)胞來源，以排除移入的潛在增強(qiáng)或通過GVHD和/或 Tcm細(xì)胞的同種異體反應(yīng)性的致死性。
如圖7中可見的，在未用BM移植物放射保護(hù)的照射對照組中的所有小鼠，在照射處理后不久死亡。相比之下，接受BM移植物的所有小鼠存活，而HTC的添加導(dǎo)致移植物排斥和致死性。令人驚訝的是，HTC介導(dǎo)的排斥在IO7個Tcm細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移后被顯著克服， 而無需進(jìn)一步處理(7/8只小鼠存活)。
為了評估當(dāng)與抗第三方Tcm細(xì)胞結(jié)合施用時，HTC排斥BM移植物的失敗，通過外周血的FACS分析在移植后80天時測試受體小鼠中的嵌合狀態(tài)。如圖8中所示，接受單獨(dú)的BM移植物無誘導(dǎo)排斥的HTC的小鼠(列A)，展示與除BM外還接受HTC和IO7個Tcm細(xì)胞的小鼠可比較水平的供體嵌合狀態(tài)(列B，> 90 %供體嵌合狀態(tài))。因此，Tcm細(xì)胞使得成功移入成為可能，盡管存在同種異體反應(yīng)性HTC。
此外，移植后80天，Tcm細(xì)胞在受體的外周血中容易檢測出，并且在外周中包括44 土6 %的總CD8細(xì)胞(圖9A-B)。
Tcm細(xì)胞在TDBM同種異體移植物受體中的高持續(xù)性指出，除其顯著的耐受性誘導(dǎo)能力外，在BM移植受體中采用的嚴(yán)重調(diào)節(jié)后，這些細(xì)胞還可以對免疫重建作出重要貢獻(xiàn)。
實(shí)施例6Tcm細(xì)胞和反抑CTL之間的耐受性誘導(dǎo)能力的直接比較
為了直接比較本發(fā)明的抗第三方Tcm細(xì)胞與先前描述的抗第三方反抑CTL的耐受性誘導(dǎo)能力，本發(fā)明的發(fā)明人將衍生自(C3HxBALB/C)Fl小鼠的IO7個Tcm或反抑CTL過繼轉(zhuǎn)移到OH小鼠，BALB/C TDBM同種異體移植物受體內(nèi)，在先前描述的移植物排斥模型中(參見上文實(shí)施例1)。
為了評估過繼轉(zhuǎn)移的供體型抗第三方‘Tcm’克服BM同種異體移植物排斥的長期能力，使用上文描述的移植物排斥模型，這特別設(shè)計為測量T細(xì)胞介導(dǎo)的TDBM同種異體移植物排斥，而無來自干細(xì)胞競爭的干擾，這可能在暴露于RIC的小鼠中發(fā)生。因此，在純化 ‘!"cm，的存在或不存在下，在來自BALB/C-NUDE供體的TDBM同種異體移植物移植前，C3H小鼠受致死照射并且用HTC輸注。C3H小鼠受致死照射并且用HTC輸注。(C3HxBALB/C)Fl小鼠用作‘Tcm’來源，以排除移入的潛在增強(qiáng)或通過GVHD和/或‘Tcm’的殘留同種異體反應(yīng)性的致死性。如圖IOA中可見的，在未用BM移植物放射保護(hù)的照射對照組中的所有小鼠，在照射處理后不久死亡。相比之下，接受BM的30只小鼠中的四只存活，而HTC的添加導(dǎo)致接受這種處理的所有59只小鼠的移植物排斥和致死性。令人驚訝的是，這種HTC介導(dǎo)的排斥分別在IxlO7個或切106個Tcm，的過繼轉(zhuǎn)移后的16/18小鼠和19/23小鼠中被克服，而較低數(shù)目的‘Tcm’較不有效(圖10A)。所有存活小鼠展示可持久的供體嵌合狀態(tài)(>90%)， 這持續(xù)超過1年(數(shù)據(jù)未顯示，⑶8嵌合狀態(tài)在圖IOC中展示)。事實(shí)上，如圖IOB中可見的， 接受IxlO7個‘CTLs’而無雷帕霉素的僅3/16只受體小鼠存活(p<0. 0001)。此外，‘Tcm，展示驚人的體內(nèi)持續(xù)性，并且可以在受體的外周血中延長時間段檢測出。因此，即使在移植后 1年時，H2kdW性的⑶8 T細(xì)胞(即輸注‘Tcm，的后代)在外周血中包括19士6%的總⑶8 T 細(xì)胞間隔(圖10C)o
實(shí)施例7
完全同種異體的抗第三方‘Tcm’耗盡GVH反應(yīng)性且支持TDBM同種異體移植物的移入在證實(shí)‘Tcm’克服T細(xì)胞介導(dǎo)的BM同種異體移植物排斥的能力后，使用缺乏同種異體反應(yīng)性的(HostxDonor) Fl供體，通過使用完全MHC不相容的同種異體供體執(zhí)行這些細(xì)胞的完全潛力的進(jìn)一步評估。特別地，考慮抗第三方‘Tcm’通過在細(xì)胞因子剝奪(以便避免 CD62L的下調(diào))下的起始同種異體刺激僅60小時生成，代替用于生成抗第三方‘CTL’的常規(guī)6天剝奪法19，重要的是評估完全同種異體‘Tcm’的GVH反應(yīng)性。
因此，就其在過繼轉(zhuǎn)移到也用BALB/c-NUDE BM移植的受超致死照射的C3H受體內(nèi)后的GVH反應(yīng)性，使BALB/c衍生的純化抗第三方‘Tcm’與BALB/c衍生的幼稚⑶8+細(xì)胞比較。小鼠就存活和GVHD體征進(jìn)行監(jiān)控皮毛起皺、駝背和體重減少。如圖IlA中可見的， 切106個或hlO6個‘Tcm’的輸注不誘導(dǎo)致死GVHD，并且每個組中的14/17只小鼠存活，類似于無另外T細(xì)胞的NUDE-BMT受體(18/20只小鼠存活)。與之鮮明對比，分別接受5xl06 個或2xl06個幼稚CD8+ T細(xì)胞的僅1/15和2/22只小鼠存活。此外，接受‘Tcm，的小鼠的總體外觀及其體重與由用NUDE-BM單獨(dú)移植的對照小鼠顯示的那種并無顯著不同(圖11B)。 這也與接受幼稚T細(xì)胞的小鼠中的結(jié)果形成對比，其展示顯著的重量減輕(p<0. 05)并且具有與GVHD相容的總體外觀。
最后，在先前描述的移植物排斥模型的背景中，評估耗盡GVH反應(yīng)性的這些完全同種異體的抗第三方‘Tcm’克服T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥的能力。如圖IlC中可見的，接受5xl06個BALB/c衍生的‘Tcm’的21/25只小鼠在移植后存活，并且展示穩(wěn)定的供體嵌合狀態(tài)(>95%)。相比之下，IxlO7個BALB/c衍生的iCTL'的輸注僅可以援救7/27只受體小鼠 (p<0. 0001),并且較低的‘CTL’數(shù)目(5xl06或MlO6)在預(yù)防這種HTC介導(dǎo)的排斥中完全無效(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例8
‘Tcm’在體外展示低反抑活性，但在再激活后獲得效應(yīng)物表型，伴隨有效和特異的反抑
活性
雖然抗第三方‘Tcm’有效歸巢至LN，但由這些細(xì)胞的耐受性誘導(dǎo)也要求這些細(xì)胞被賦予強(qiáng)反抑活性。一般而言，具有Tcm表型的⑶8+ T細(xì)胞先前顯示展示弱CTL效應(yīng)機(jī)制，但其反抑活性從未得到描述。
為了評估‘Tcm’的反抑活性，使用TCR轉(zhuǎn)基因⑶8+效應(yīng)細(xì)胞測定(2c模型)。2c ⑶8+細(xì)胞表達(dá)針對H-2d的轉(zhuǎn)基因TCR，并且因此僅通過H-2d起源的反抑‘CTL’而不是不同 H-2類型的非特異性‘CTL’易于反抑缺失，所述非特異性‘CTL’不由2c細(xì)胞識別19。2c細(xì)胞可以通過使用克隆型1B2進(jìn)行特異性鑒定。CB6小鼠用作關(guān)于反抑細(xì)胞的來源，以排除針對2c細(xì)胞假定殘留的同種異體反應(yīng)性。依照先前研究，具有效應(yīng)物表型的‘CTL’顯示由凋亡引起的2c細(xì)胞擴(kuò)增的有效抑制(圖12A)，如由膜聯(lián)蛋白V染色指出的(圖12B)。相比之下，‘Tcm’顯示弱抑制活性(圖12A)，并且未能誘導(dǎo)對2c細(xì)胞的凋亡，如通過較低水平的膜聯(lián)蛋白V染色暗示的(圖12B)。
然而，‘Tcm’的短再激活導(dǎo)致⑶62L表達(dá)的下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)和顯著增強(qiáng)的抑制活性(圖12A)，可能通過基于缺失的機(jī)制介導(dǎo)，如由膜聯(lián)蛋白V染色指出的(圖12B)。此外，再激活的‘Tcm’類似于‘CTL’展示特異性反抑活性，如通過比較衍生自CB6 (H2bd)的再激活的“特異性” ‘!W或‘CTL，或“非特異性” (C57xC3H)Fl (H2bk) CD8+ T細(xì)胞顯示的，這不表達(dá)H-2d分子且不由2c⑶8+ T細(xì)胞識別。因此，僅“特異性”再激活的‘Tcm’或‘CTL’有效抑制2c細(xì)胞擴(kuò)增(圖12C)，并且能夠誘導(dǎo)2c效應(yīng)細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白V表達(dá)(圖12D)?？偟膩碚f，這些結(jié)果暗示‘Tcm’不具有固有的反抑活性，但在再激活后，獲得效應(yīng)物表型和反抑活性。這與先前對于在再激活后具有Tcm表型的CD8+ T細(xì)胞描述的效應(yīng)物表型和功能的快速誘導(dǎo)一致?？偟膩碚f，上文描述的數(shù)據(jù)暗示在體外增強(qiáng)的LN歸巢和有效的反抑活性是相互排斥的。然而，因?yàn)椤甌cm’的再激活顯著改善其反抑活性，所以測定過繼轉(zhuǎn)移的‘Tcm’ 是否可以在BM同種異體移植物受體中再激活是有利的，其中過繼轉(zhuǎn)移的宿主類型T細(xì)胞可以設(shè)定抗供體應(yīng)答。事實(shí)上，在純化‘Tcm’過繼轉(zhuǎn)移后4天，從LN中回收的顯著數(shù)目的輸注細(xì)胞顯示明顯減少的⑶62L表達(dá)(圖12E)，指出再激活可能已發(fā)生，可能是由于由致死調(diào)節(jié)和/或HTC的同種異體反應(yīng)性誘導(dǎo)的刺激。
實(shí)施例9
‘Tcm’在體內(nèi)特異性缺失抗供體T細(xì)胞
考慮‘Tcm’有效歸巢至受體小鼠的LN并且顯示反抑相關(guān)表型，這可能使得共定位的 HTC的耐受作用成為可能，我們評估了過繼轉(zhuǎn)移的‘Tcm’在體內(nèi)抑制Ag特異性T細(xì)胞的能力。為了唯一地評估‘Tcm’的耐受作用活性，而無來自BM細(xì)胞和BM衍生細(xì)胞的充分證明的反抑活性的干擾13’15’18，我們建立了同基因^^模型，其中受致死照射的0578176(!1213)宿主小鼠用同基因的C57BL/6-NUDE BM細(xì)胞進(jìn)行放射保護(hù)。此外，受體小鼠接受2C (H2b)⑶8+T細(xì)胞和受照射的BALB/c (H2d)脾細(xì)胞，這誘導(dǎo)2c細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)增。在2c細(xì)胞及其刺激物轉(zhuǎn)移后1天后，受體接受“特異性” CB6衍生的(H2bd)純化‘Tcm’，或“非特異性” C57BL/6 衍生的純化‘Tcm’，這不表達(dá)子且因此不由2c⑶8+ T細(xì)胞識別。收獲受體的脾，并且在移植后8天就2c細(xì)胞的存在進(jìn)行評估。令人驚訝的是，與僅顯示20%抑制的“非特異性” ‘Tcm’比較，“特異性” ‘Tcm’有效抑制(71%抑制)2c細(xì)胞擴(kuò)增(圖13A-B)。此外，膜聯(lián)蛋白V染色指出由“特異性” ‘Tcm’展示的抑制機(jī)制通過在識別2c細(xì)胞后的凋亡誘導(dǎo)介導(dǎo) (圖 13C-D)。
盡管本發(fā)明已結(jié)合其具體實(shí)施方案進(jìn)行描述，但顯而易見的是許多替代方案、修飾和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是明顯的。因此，預(yù)期包含屬于附加權(quán)利要求
的精神和廣泛范圍的所有此類替代方案、修飾和變化。
本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請在此整體引入說明書內(nèi)，其程度與每個個別出版物、專利或?qū)＠暾執(zhí)貏e且個別指出引入本文作為參考相同。此外，任何參考文獻(xiàn)在本申請中的引用或鑒定不應(yīng)解釋為承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。 就使用的節(jié)段標(biāo)題而言，它們不應(yīng)解釋為必定是限制性的。
權(quán)利要求
1.一種分離的細(xì)胞群體，其包括具有中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的不誘導(dǎo)GVHD 的抗第三方細(xì)胞，所述細(xì)胞是誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞并且在移植后能夠歸巢至淋巴結(jié)。
2.權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體用于在有此需要的受試者中治療疾病的用途。
3.權(quán)利要求
2的用途，其中所述疾病選自惡性疾病、病毒疾病和自身免疫疾病。
4.權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體作為用于進(jìn)入受試者內(nèi)的細(xì)胞或組織移植物的輔助療法的用途，其中所述受試者需要細(xì)胞或組織移植。
5.一種治療需要細(xì)胞或組織移植的受試者的方法，所述方法包括(a)將細(xì)胞或器官移植物移植到所述受試者內(nèi)；和(b)給所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體，從而治療所述受試者。
6.權(quán)利要求
4或5的用途或方法，其中所述分離的細(xì)胞群體在所述細(xì)胞或組織移植之前、同時或之后施用。
7.權(quán)利要求
1、2、4或5的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型包括 CD8+、CD62L+、CD45RA/ CD45 RO+ 標(biāo)志。
8.權(quán)利要求
1、2、4或5的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(iTcm)表型包括 CD8+/CD62L+/CD45R0+/L-選擇素 +/CD45RA-。
9.權(quán)利要求
7的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中至少50%的所述分離的細(xì)胞群體具有所述標(biāo)志。
10.權(quán)利要求
1、2、4或5的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述淋巴結(jié)包括外周淋巴結(jié)。
11.權(quán)利要求
1、2、4或5的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述淋巴結(jié)包括腸系膜淋巴結(jié)。
12.權(quán)利要求
2、4或5的用途或方法，其中所述受試者是人受試者。
13.權(quán)利要求
4或5的用途或方法，其中所述細(xì)胞或組織移植物衍生自選自HLA相同的同種異體供體、HLA不相同的同種異體供體和異種供體的供體。
14.權(quán)利要求
13的用途或方法，其中所述受試者和所述供體都是人。
15.權(quán)利要求
5的方法，其進(jìn)一步包括在所述移植前在亞致死、致死或超致死條件下調(diào)節(jié)所述受試者。
16.權(quán)利要求
1、2、4或5的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中包括具有中樞記憶性T 淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方細(xì)胞的所述分離的細(xì)胞群體通過下述生成 (a)在允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件下，使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸；和(b)在允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件下，在IL-15的存在下培養(yǎng)得自步驟(a)的所述細(xì)胞。
17.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的所述條件包括剝奪細(xì)胞因子的培養(yǎng)。
18.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的所述條件包括至少2天的培養(yǎng)。
19.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的所述條件包括IL-7和/或IL-21。
20.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的所述條件包括至少14天的所述培養(yǎng)。
21.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的所述條件包括無抗原環(huán)境。
22.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述一種或多種第三方抗原選自第三方細(xì)胞、細(xì)胞抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、蛋白質(zhì)提取物、純化的蛋白質(zhì)和由自體或非自體呈遞細(xì)胞呈遞的合成肽。
23.權(quán)利要求
22的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述第三方細(xì)胞就所述受試者和/或供體而言是同種異體或異種細(xì)胞。
24.權(quán)利要求
23的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述同種異體或異種細(xì)胞是刺激細(xì)胞，其選自由外周血淋巴細(xì)胞、脾或淋巴結(jié)純化的細(xì)胞，細(xì)胞因子動員的PBL和體外擴(kuò)增的抗原呈遞樹突細(xì)胞(APC)。
25.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述非同基因外周血單核細(xì)胞 (PBMC)就所述受試者而言是同種異體的。
26.權(quán)利要求
16的分離的細(xì)胞群體、用途或方法，其中所述非同基因外周血單核細(xì)胞 (PBMC)就所述受試者而言是異種的。
27.一種生成權(quán)利要求
1的分離的細(xì)胞群體的方法，所述方法包括(a)在允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件下，使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸；和(b)在允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件下，在IL-15 的存在下培養(yǎng)得自步驟(a)的所述細(xì)胞。
28.權(quán)利要求
27的方法，其中允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的所述條件包括剝奪細(xì)胞因子的培養(yǎng)。
29.權(quán)利要求
27的方法，其中允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的所述條件包括至少2天的培養(yǎng)。
30.權(quán)利要求
27的方法，其中允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的所述條件包括IL-7和/或IL-21。
31.權(quán)利要求
27的方法，其中允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的所述條件包括至少14天的所述培養(yǎng)。
32.權(quán)利要求
27的方法，其中允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的所述條件包括無抗原環(huán)境。
33.權(quán)利要求
27的方法，其中所述一種或多種第三方抗原選自第三方細(xì)胞、細(xì)胞抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、蛋白質(zhì)提取物、純化的蛋白質(zhì)和由自體或非自體呈遞細(xì)胞呈遞的合成肽。
34.權(quán)利要求
33的方法，其中所述第三方細(xì)胞就所述受試者和/或供體而言是同種異體或異種細(xì)胞。
35.權(quán)利要求
34的方法，其中所述同種異體細(xì)胞是刺激細(xì)胞，其選自由外周血淋巴細(xì)胞、脾或淋巴結(jié)純化的細(xì)胞，細(xì)胞因子動員的PBL和體外擴(kuò)增的抗原呈遞樹突細(xì)胞(APC)。
36.權(quán)利要求
27的方法，其中所述非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)就所述受試者而言是同種異體的。
37.權(quán)利要求
27的方法，其中所述非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)就所述受試者而言是異種的。
38.權(quán)利要求
5的方法，其中所述分離的細(xì)胞群體通過下述生成(a)在允許GVH反應(yīng)細(xì)胞消除的條件下，在剝奪細(xì)胞因子的培養(yǎng)中使非同基因外周血單核細(xì)胞(PBMC)與一種或多種第三方抗原接觸至少2天；和(b)在允許包括所述中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的細(xì)胞增殖的條件下，在無抗原環(huán)境條件下，在IL-15的存在下使得自步驟(a)的所述細(xì)胞培養(yǎng)至少14天。
39.權(quán)利要求
38的方法，其中所述培養(yǎng)得自步驟(a)的所述細(xì)胞包括IL-7和/或 IL-21。
專利摘要
提供了分離的細(xì)胞群體，其包括具有中樞記憶性T淋巴細(xì)胞(Tcm)表型的不誘導(dǎo)GVHD的抗第三方細(xì)胞。細(xì)胞是誘導(dǎo)耐受性的細(xì)胞并且在移植后能夠歸巢至淋巴結(jié)。還提供了生成其的方法、其用途和治療方法。
文檔編號A61K39/00GKCN102271702SQ200980153053
公開日2011年12月7日 申請日期2009年10月29日
發(fā)明者奧菲爾 E., 巴查爾-盧斯蒂格 E., 艾德爾施泰因 Y., 賴斯納 Y. 申請人:耶達(dá)研究及發(fā)展有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan