本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域，具體是過(guò)墻風(fēng)總黃酮的提取方法及其在制備保肝藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

過(guò)墻風(fēng)，別名臭茉莉、臭牡丹、大楓葉、臭黃根、鬼點(diǎn)火。藥材基源為馬鞭草科植物尖齒臭茉莉帶根的全株。屬于傳統(tǒng)瑤藥中的風(fēng)類藥，全草含黃酮甙、酚類、皂甙、鞣質(zhì)等，具有祛風(fēng)除濕，活血止痛和清熱解毒的功效，主治風(fēng)濕痹痛，腳氣水腫，黃疸型肝炎等，主要分布于廣東、廣西和云南等。廣東藥學(xué)院吳凡冬等采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)重瓣臭茉莉根總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，而未見(jiàn)臭茉莉根總黃酮（過(guò)墻風(fēng)總黃酮）提取工藝的研究報(bào)道。黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、清除自由基等藥理活性，在防治疾病方面發(fā)揮著重要的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供過(guò)墻風(fēng)總黃酮的提取方法及其在制備保肝藥物中的應(yīng)用。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是：

過(guò)墻風(fēng)總黃酮的提取方法，包括如下步驟：取過(guò)墻風(fēng)根，打成粗粉，按1:20的料液比加入54.76%乙醇，提取溫度83.92 ℃，回流提取2次，每次102.64 min，合并提取液并過(guò)濾，減壓回收濾液中的乙醇，濃縮得過(guò)墻風(fēng)浸膏；浸膏加適量的水，充分混勻成混懸液，加鹽酸調(diào)pH=4.5，采用D102型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，上樣流速3mL·min^-1，上樣后靜止12 h，先用2倍樹脂體積的35%乙醇洗脫，而后用4倍樹脂體積70%乙醇洗脫，流速2.5 mL·min^-1，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮洗脫液，干燥后得過(guò)墻風(fēng)總黃酮干膏。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，得出過(guò)墻風(fēng)總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度54.76%，提取溫度83.92 ℃，提取時(shí)間102.64 min，料液比為1:20，提取2次，在此條件下得率最大。

本發(fā)明采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面法優(yōu)化過(guò)墻風(fēng)總黃酮提取方法，接著進(jìn)一步純化其中總黃酮，并將其作用于四氯化碳肝損傷模型中，實(shí)驗(yàn)保肝作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)墻風(fēng)總黃酮具有保肝護(hù)肝作用，作用機(jī)制可能有由TNF-α、IL-6和 NO所介導(dǎo)的肝細(xì)胞炎性反應(yīng), 有效地保護(hù)肝細(xì)胞。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，過(guò)墻風(fēng)藥材資源豐富，制備過(guò)墻風(fēng)總黃酮工藝簡(jiǎn)單、成本低，具有良好的開發(fā)價(jià)值。此外，本發(fā)明發(fā)掘了過(guò)墻風(fēng)總黃酮具有保肝護(hù)肝作用，制備保肝藥物或保健品具有良好的藥用價(jià)值，并為過(guò)墻風(fēng)總黃酮進(jìn)一步深入開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為提取過(guò)程中提取溫度、提取時(shí)間和乙醇濃度相互作用對(duì)總黃酮提取率影響的效應(yīng)面圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限定。

一、過(guò)墻風(fēng)總黃酮的提取工藝研究

1.材料

DF-25落地式連續(xù)投料粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司），101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），UW-2200H電子天平(日本島津公司)，HW.W21恒溫水浴箱（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司），H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)廠）, UV-2450/2550紫外-可見(jiàn)分光光度儀(日本島津公司)。過(guò)墻風(fēng)購(gòu)買于桂林市七星區(qū)六合路藥材市場(chǎng)，經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院張可鋒副教授鑒定為ClerodendrumphilippinumSchauer var. simplex Mlodenke roots，蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100080-200707），無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱定蘆丁對(duì)照品，配制質(zhì)量濃度為0.40g·L^-1的70%乙醇溶液，混勻，備用。

供試品溶液的制備

將過(guò)墻風(fēng)晾曬后粉碎，過(guò)80目篩，置60℃恒溫烘箱中烘干，放于干燥器中備用。精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末約1.0 g，加入70%的乙醇20倍量（g : mL），在80℃下回流提取1次，過(guò)濾后離心（4 000 r·min^-1）取上清液，備用。

檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

以70%乙醇為空白對(duì)照，分別取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液1.0 mL置于25 mL容量瓶中，先加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液5 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。在200~800 nm范圍內(nèi)測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示對(duì)照品和供試品溶液均在510 nm處有最大吸收，且空白無(wú)干擾，故選擇510 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取0.5、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液，分別置于25 mL容量瓶中，然后按照2.1.3項(xiàng)進(jìn)行操作，在510 nm處測(cè)定吸光度A，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.0133C-0.0399(r=0.9991)，線性范圍0.00~0.064g·L^-1。

方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液1.0 mL，按照2.1.3項(xiàng)在510 nm處測(cè)定吸光度，重復(fù)5次，計(jì)算RSD值為0.44%，表明儀器性能穩(wěn)定。

穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按照2.1.3項(xiàng)在510 nm處，分別于0、0.5、 1、 1.5、 2h時(shí)測(cè)定吸光度，RSD值為0.61%，表明供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末5份，每份約1.0 g，按2.1.2項(xiàng)制備供試品溶液5份，并按2.1.3項(xiàng)在510 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為1.23%，表明該方法重復(fù)性較好。

回收率試驗(yàn)

精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末約1.0 g，按2.1.2和2.1.3項(xiàng)處理后，計(jì)算總黃酮含量；然后精密稱取同一批過(guò)墻風(fēng)粉末3份，分別加入約相當(dāng)于總黃酮含量的0.8， 1.0，1.2倍的蘆丁對(duì)照品，按2.1.2和2.1.3項(xiàng)進(jìn)行處理，計(jì)算平均回收率為101.78%，表明該方法測(cè)定總黃酮含量較為準(zhǔn)確。

單因素試驗(yàn)

2.3.1提取次數(shù)

精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末3份，每份約1.0 g，固定料液比1:20，乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)分別為1次，2次和3次，合并濾液。按2.1.2項(xiàng)制備供試品溶液，并按2.1.3項(xiàng)在510nm測(cè)定吸光度，總黃酮提取率分別為3.65%，4.87%，4.88%。提取兩次后，提取率增加并不明顯，而且提取次數(shù)為非連續(xù)變量，故把提取次數(shù)固定為兩次。

料液比

精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末5份，每份約1.0 g，固定乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間1 h，提取兩次，分別加入10、15、20、25、30倍量70%乙醇，合并濾液。按照2.1.2和2.1.3項(xiàng)在510 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率為4.62%，4.96%，4.97%，4.97%，4.96%。料液比在1:20時(shí)得率最大，考慮到工藝成本等因素，故將料液比固定為1:20。

提取溫度

精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末5份，每份約1.0 g，固定料液比1:20，乙醇濃度70%，提取時(shí)間1 h，提取兩次，分別在50、60、70、80、90℃下回流提取，合并濾液。參照2.1.2和2.1.3項(xiàng)測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率分別為3.43%，3.8%，3.9%，4.09%，3.99%。在80 ℃時(shí)提取率較高，再增加溫度提取率下降。

提取時(shí)間

精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末5份，每份約1.0 g，固定料液比1:20，乙醇濃度70%，提取溫度80 ℃，提取兩次，提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min，合并濾液。按照2.1.2項(xiàng)制備供試品溶液，并按2.1.3項(xiàng)在510 nm測(cè)定吸光度，得總黃酮提取率分別為3.49%，3.83%，4.71%，3.95%，3.84%。隨著溫度的增加，提取率呈先升高后下降的趨勢(shì)，在90 min時(shí)出現(xiàn)峰值，將90 min作為中間水平值。

乙醇濃度

精密稱取過(guò)墻風(fēng)粉末5份，每份約1.0 g，固定料液比1:20，提取溫度80 ℃，提取兩次，提取時(shí)間1 h，乙醇濃度分別為40%，50%，60%，70%，80%，90%，合并濾液。按2.1.2和2.1.3項(xiàng)在510 nm測(cè)定吸光度，總黃酮得率分別為4.05%，4.33%，4.22%，3.97%，3.35%。隨著乙醇濃度的增加，提取率呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度在50%時(shí)得率最高。

優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定提取次數(shù)兩次，料液比1:20，選擇乙醇濃度（A）、提取溫度（B）和提取時(shí)間（C）為自變量，總黃酮提取率（Y）為因變量，使用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，并進(jìn)行方差分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 過(guò)墻風(fēng)總黃酮提取方法星點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 二項(xiàng)式方程方差分析

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸得方程：Y=4.43+0.09A-0.0089B+0.37C（R²=0.697 0，P=0.000 2）；二項(xiàng)式擬合方程：Y=4.64 + 0.090A + 0.37C + 0.071AC - 0.011AB -0.001 3BC-0.11A2-0.17B2 - 0.018C2（R² = 0.913 0，P<0.000 1）。從相關(guān)系數(shù)與模型顯著性比較，二項(xiàng)式模型具有更好的擬合效果。二項(xiàng)式方差分析結(jié)果表明，一次項(xiàng)中，A和B項(xiàng)對(duì)總黃酮提取率具有顯著影響，因C項(xiàng)無(wú)顯著性，且對(duì)二項(xiàng)式相關(guān)系數(shù)和模型顯著性影響較小，為簡(jiǎn)化方程，已將其舍去；交叉項(xiàng)中，均無(wú)顯著項(xiàng)；二次項(xiàng)中，B²和C²對(duì)總黃酮提取率有顯著性影響。提取溫度、提取時(shí)間和乙醇濃度相互作用對(duì)總黃酮提取率影響的效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖1。

根據(jù)二項(xiàng)式擬合方程，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件進(jìn)行模型分析，使響應(yīng)值Y取最大值時(shí)，提取工藝條件為乙醇濃度54.76%，提取溫度83.92 ℃，提取時(shí)間102.64 min，料液比為1:20, 提取兩次，模型預(yù)測(cè)Y值為5.04%。稱取過(guò)墻風(fēng)粉末約1.0 g，共三份，提取率分別為5.00%，5.00%，5.06%，總黃酮平均提取率5.02%，相對(duì)偏差為-0.40%，RSD為0.59%，說(shuō)明該二項(xiàng)式方程能較好預(yù)測(cè)過(guò)墻風(fēng)總黃酮提取率，重復(fù)性好，方法可行。

二、過(guò)墻風(fēng)總黃酮保肝作用實(shí)驗(yàn)

（一）過(guò)墻風(fēng)總黃酮的提取和純化：

取過(guò)墻風(fēng)根打成粗粉，取粗粉1kg，加70%乙醇6 L回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液并過(guò)濾，減壓回收濾液中的乙醇，濃縮得過(guò)墻風(fēng)浸膏；浸膏加適量的水，充分混勻成混懸液，加鹽酸調(diào)pH=4.5，采用D102型大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，上樣流速3 mL·min^-1，上樣后靜止12 h，先用2倍樹脂體積的35%乙醇洗脫，而后用4倍樹脂體積70%乙醇洗脫，流速2.5 mL·min^-1，收集70%乙醇洗脫液，70%乙醇洗脫液經(jīng)硝酸鋁絡(luò)合分光光度法測(cè)定總黃酮純度達(dá)到76.59%，減壓濃縮洗脫液，干燥后得過(guò)墻風(fēng)總黃酮干膏；將過(guò)墻風(fēng)總黃酮干膏打成細(xì)粉，加蒸餾水，待受試藥效試驗(yàn)。

（二）過(guò)墻風(fēng)總黃酮對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝損傷的保肝作用

60只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥物聯(lián)苯雙酯組和供試藥物過(guò)墻風(fēng)高、中、低劑量組。陽(yáng)性對(duì)照組按150 mg·kg^-1，供試藥物組按600、400、200mg·kg^-1劑量灌胃給藥，每天1次，共7天。末次給藥后，除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均腹腔注射0.12% CCl₄花生油( 0.01 mL·g^-1 ) , 禁食不禁水24h,眼球取血, 離心, 分離出血清, 生物化學(xué)法檢測(cè)ALT、AST的活性；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)TNF-α、IL-6和 NO生化指標(biāo)。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示（表1）。

由表1和表2結(jié)果可見(jiàn)，模型組與空白對(duì)照組相比較，ALT 、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6活性有極顯著性差異(P <0.01)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)造模成功。與模型組比較，小鼠口服陽(yáng)性藥和過(guò)墻風(fēng)黃酮均能明顯的抑制ALT、AST 、TNF-α、IL-6和 NO活性 ( P<0.01或P<0.05)，且成量效關(guān)系。因此可判斷過(guò)墻風(fēng)總黃酮具有保肝護(hù)肝的作用，其作用機(jī)理可能與抑制肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)。

表1 過(guò)墻風(fēng)總黃酮對(duì)CCL₄致肝損傷小鼠血清中ALT和AS的影響(±s, n=10)

與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

表 2 過(guò)墻風(fēng)總黃酮對(duì)肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-6和 NO的影響(±s, n=10)

與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)墻風(fēng)總黃酮治療組明顯降低了肝損傷小鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6含量, 與模型組比較有差異(P<0.5，P<0.01)；病理顯示其可明顯改善受損的肝臟，提示過(guò)墻風(fēng)總黃酮具有保肝護(hù)肝作用，作用機(jī)制可能有由TNF-α、IL-6和 NO所介導(dǎo)的肝細(xì)胞炎性反應(yīng), 有效地保護(hù)肝細(xì)胞。