本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動態(tài)過程，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(ECM)大量合成、分泌，而降解絕對或相對不足，使ECM在肝臟內(nèi)彌漫沉積。其起始于肝細胞(HC)壞死，隨之是炎癥反應(yīng)、纖維生成介質(zhì)釋放，肝星狀細胞(FSC)激活，最終以肝臟結(jié)締組織成分的合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預(yù)后的重要因素。

過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進展，證實肝纖維化與一定程度的肝硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學藥、生物制劑、中藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強抗肝纖維化作用機制的研究.中華肝病雜志，2005,8(13)：561)。目前防治肝纖維的關(guān)鍵是針對與肝星狀細胞激活相關(guān)的環(huán)節(jié)，主要是：減輕肝損傷；抑制星狀細胞激活，減少細胞外基質(zhì)產(chǎn)生；調(diào)節(jié)細胞因子紊亂，促進活化肝星狀細胞凋亡；抑制肝臟成纖維細胞的增殖以及星狀細胞激活大量分泌誘導(dǎo)肝臟成纖維細胞的增殖。

從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。

本發(fā)明涉及的化合物I是一個2011年發(fā)表(Meng Shao et al.,2010.Psiguadials A and B,Two Novel Meroterpenoids with Unusual Skeletons from the Leaves of Psidium guajava.Organic Letters 12(2010)5040–5043)的化合物，我們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗肝纖維化活性進行了評價，其具有抗肝纖維化活性。

由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子會誘導(dǎo)肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分數(shù)分別為15％和85％。

本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。

藥效學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學上可接受的鹽具有同樣的藥效。

進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗成纖維細胞增殖的活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。

進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗生長因子誘導(dǎo)的成纖維細胞增殖的活性，組合物是一個極具開發(fā)潛力的化合物,它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。

具體實施方式

實施例1 化合物Psiguadial A的制備

化合物Psiguadial A(I)的制備方法參照Meng Shao等人發(fā)表的文獻(Meng Shao et al.,2010.Psiguadials A and B,Two Novel Meroterpenoids with Unusual Skeletons from the Leaves of Psidium guajava.Organic Letters 12(2010)5040–5043)的方法。

實施例2 Psiguadial A的O-溴乙基衍生物(II)的合成

將化合物I(474mg，1.00mmol)溶于20mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.16g)，1,2-二溴乙烷(7.520g，40.00mmol)和12mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌8h。8h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(502mg，73％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ10.44(s,2H),7.24(s,2H),7.20(d,J＝10.0Hz,3H),4.31(s,4H),3.89(s,1H),3.74(s,4H),2.30(s,1H),2.12(s,1H),2.02(s,1H),1.92(s,1H),1.79(s,1H),1.73(s,1H),1.51(d,J＝19.8Hz,3H),0.99(s,3H),0.95(d,J＝4.7Hz,7H),0.85(s,3H),0.53(s,1H),0.43(s,1H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.69(s),170.54(s),165.42(s),163.38(s),142.72(s),129.71(s),127.96(s),127.08(s),118.00(s),116.82(s),114.82(s),72.73(s),40.19(s),34.75(s),34.32(s),31.75(s),30.93(s),28.09(s),26.43(s),24.48(s),23.74(s),21.18(s),20.77(s),19.99(s),14.39(s).

HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₃₄H₄₁Br₂O₅:689.1300；found 689.1303.

實施例3 Psiguadial A的O-(咪唑基)乙基衍生物(III)的合成

將化合物II(344mg，0.5mmol)溶于25mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg，5.0mmol)，碘化鉀(168mg，1.0mmol)和咪唑(3480mg，40mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.4，v/v)，收集黃色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物III的黃色粉末(235.0mg,71％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,2H),7.80(s,2H),7.17(s,2H),7.11(d,J＝10.0Hz,3H),7.07(s,2H),6.66(s,2H),4.47(s,4H),4.37(s,4H),3.91(s,1H),2.03(s,1H),1.86–1.77(m,3H),1.64(s,1H),1.60(s,1H),1.35(d,J＝4.6Hz,3H),1.15(s,1H),0.89(s,3H),0.87–0.64(m,9H),0.43(s,1H),0.17(s,1H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.52(s),170.35(s),165.17(s),163.13(s),142.49(s),139.47(s),129.44(s),128.51(s),127.70(s),126.82(s),119.14(s),117.75(s),116.59(s),114.54(s),69.29(s),43.78(s),39.96(s),34.50(s),34.09(s),30.66(s),27.84(s),26.18(s),24.25(s),23.46(s),20.92(s),20.51(s),19.76(s),14.20(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₀H₄₇N₄O₅:663.3546；found:663.3541。

實施例4 Psiguadial A的O-(二羥乙胺)乙基衍生物(IV)的合成

將化合物II(344mg，0.5mmol)溶于18mL乙腈，加入無水碳酸鉀(0.345g，2.5mmol)，碘化鉀(0.084g，0.5mmol)和二乙醇胺(2.103g，20mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冷水中，用二氯甲烷萃取2次，合并有機相，依次用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑。產(chǎn)物用硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:0.7，v/v)，得到化合物IV的淡棕色固體(0.254g,69％)。

¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.45(s,2H),7.27(t,J＝15.0Hz,2H),7.21(t,J＝15.0Hz,2H),7.21(s,1H),4.04(s,4H),3.97(s,1H),3.39(s,8H),2.68(s,4H),2.54(s,8H),2.16(s,1H),2.01(s,1H),1.98–1.90(m,3H),1.68(s,1H),1.62(s,1H),1.45(s,2H),1.40(s,1H),1.12(s,4H),1.00(s,3H),0.93(s,6H),0.89(s,3H),0.52(s,1H),0.27(s,1H).

¹³C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ188.43(s),170.26(s),165.08(s),163.04(s),142.40(s),129.34(s),127.61(s),126.73(s),117.67(s),116.49(s),114.46(s),69.16(s),58.86(s),56.40(s),53.85(s),39.84(s),34.42(s),33.99(s),30.58(s),27.74(s),26.10(s),24.15(s),23.38(s),20.82(s),20.43(s),19.66(s),14.02(s).

HRMS(ESI):m/z[M+H]⁺calcd for C₄₂H₆₁N₂O₉:737.4377；found:737.4374。

實施例5 組合物抗肝纖維化活性

由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子會誘導(dǎo)肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導(dǎo)的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。

組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的15mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的85mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。

實驗例1：組合物對成纖維細胞NIH/3T3增殖的抑制作用

一、實驗方法：

NIH/3T3細胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上海細胞所細胞庫。

將對數(shù)生長期的亞融合的NIH/3T3細胞用0.25％胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)制成1×10⁴cell/ml的細胞懸液，臺盼藍染色鑒定存活率大于95％，按每孔100ul加入96孔板中，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的DMEM培養(yǎng)液(含10％FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶溶解，酶標儀490nm處讀取OD值，結(jié)果以O(shè)D₄₉₀表示。

二、實驗結(jié)果：

1、形態(tài)學觀察

NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細胞增殖的速度快；而加組合物24h后，成纖維細胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細胞排列混亂，細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物增多?；衔颕II和化合物IV無此作用。

MTT法檢測組合物對NIH/3T3細胞增殖的抑制作用。

表1：MTT法檢測組合物對NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，與細胞陰性對照P<0.05

結(jié)果：組合物在20ug/ml對成纖維細胞NIH/3T3的細胞增殖有顯著的抑制作用。表明組合物體外對成纖維細胞的增殖有顯著抑制作用?；衔颕II和化合物IV無此作用。

實驗例2：組合物對轉(zhuǎn)化生長因子-β₁(TGF-β₁)誘導(dǎo)的成纖維細胞增殖的抑制作用

TGF-β₁是促進細胞增殖和膠原生成的強活性因子，在細胞中加入TGF-β₁10ng/ml刺激細胞增殖，再檢測藥物對TGF-β1誘導(dǎo)的細胞增殖的抑制作用，以分析判斷組合物的作用機理。

表2：MTT法檢測組合物對TGF誘導(dǎo)NIH/3T3增殖的抑制作用

注：*，與細胞+TGF對照P<0.05

結(jié)果：組合物在20ug/ml對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細胞增殖有顯著的抑制作用，化合物III和化合物IV無此作用。表明組合物體外對纖維細胞增殖的抑制作用可能是通過干預(yù)TGF信號通路實現(xiàn)的。

結(jié)論：組合物對成纖維細胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細胞增殖有顯著的抑制作用；組合物對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細胞增殖有顯著的抑制作用。組合物可以用來制備抗肝纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV對成纖維細胞NIH/3T3在10％小牛血清的刺激下的細胞增殖無顯著的抑制作用，對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-β₁的誘導(dǎo)下的細胞增殖無顯著的抑制作用，不可以用來制備抗肝纖維化藥物。

實施例6 本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備

取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。

實施例7 本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備

取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。