一種預(yù)防或治療放射性和化學(xué)性損傷的方法與流程

文檔序號(hào)：12687407閱讀：503來源：國知局

導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>醫(yī)藥醫(yī)療技術(shù)的改進(jìn);醫(yī)療器械制造及應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明涉及纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶在預(yù)防和/或治療、改善和/或消除受試者放射和化學(xué)損傷及其相關(guān)病癥中的用途，進(jìn)而為預(yù)防和/或治療不同類型的放射和化學(xué)損傷提供全新的預(yù)防和/或治療策略。

背景技術(shù)：

放射損傷是由放射線照射引起的機(jī)體組織損害。一般來說，放射線是由天然或人工能源產(chǎn)生的高能電磁波或高能粒子。大劑量射線瞬間照射或低劑量射線長時(shí)間照射都可能引起組織損傷?；瘜W(xué)損傷是化學(xué)物接觸人體后產(chǎn)生的局部損害或全身損害。其損害程度與化學(xué)物的性質(zhì)、劑量、濃度、接觸時(shí)間及面積、處理是否及時(shí)及有效等因素有關(guān)。臨床上，普遍使用放射治療或化療或兩者的結(jié)合用于治療或改善腫瘤和癌癥患者。其中，放療通常使用X射線、γ射線、中子和其它來源射線殺死癌細(xì)胞或破壞細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)。而化療通過單獨(dú)或組合使用細(xì)胞毒性藥物破壞癌細(xì)胞復(fù)制或增殖。幾乎所有的癌癥患者在經(jīng)歷一次或多次放療、化療或放化療后都表現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用，包括粘膜潰瘍、免疫功能下降、骨髓抑制、消化障礙、炎癥、心臟毒性、腎臟毒性、肺纖維化、靜脈炎、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、肝臟毒性等。因此，化療和放射療法副作用的預(yù)防和保護(hù)對(duì)癌癥患者來說至關(guān)重要。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統(tǒng)(PA系統(tǒng))的關(guān)鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的幾個(gè)組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖^[1]。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMP)激活形成具有活性的金屬蛋白酶(MMP)。因此纖溶酶被認(rèn)為是胞外蛋白水解作用的一個(gè)重要的上游調(diào)節(jié)物^[2,3]。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PA：組織型纖溶酶原激活劑(tPA)或尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)蛋白水解形成的。由于纖溶酶原在血漿和其他體液中相對(duì)水平較高，傳統(tǒng)上認(rèn)為PA系統(tǒng)的調(diào)節(jié)主要通過PA的合成和活性水平實(shí)現(xiàn)。PA系統(tǒng)組分的合成受不同因素嚴(yán)格調(diào)節(jié)，如激素、生長因子和細(xì)胞因子。此外，還存在纖溶酶和PA的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶(α2-antiplasmin)。某些細(xì)胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細(xì)胞表面受體(uPAR)^[4,5]。

纖溶酶原(plasminogen，plg)是一個(gè)單鏈糖蛋白，由791個(gè)氨基酸組成，分子量約為92kDa^[6,7]。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在于胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質(zhì)水解活性的一個(gè)巨大的潛在來源^[8,9]。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個(gè)氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被稱為谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時(shí)，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，并可以更高的速率被PA激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導(dǎo)致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成^[10]。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個(gè)同源三環(huán)，即所謂的kringle，羧基末端部分包含蛋白酶結(jié)構(gòu)域。一些kringle含有介導(dǎo)纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)。最新發(fā)現(xiàn)一個(gè)纖維蛋白溶酶原為38kDa的片段，其中包括kringle1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個(gè)片段被命名為血管抑素，可通過幾個(gè)蛋白酶水解纖溶酶原產(chǎn)生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預(yù)防病理性血栓形成的關(guān)鍵^[11]。纖溶酶還具有對(duì)ECM幾個(gè)組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用^[7,12,13]。間接地，纖溶酶還可以通過將某些蛋白酶前體轉(zhuǎn)化為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細(xì)胞外蛋白水解的一個(gè)重要的上游調(diào)節(jié)器^[14]。此外，纖溶酶具有激活某些潛在形式的生長因子的能力^[15-17]。在體外，纖溶酶還能水解補(bǔ)體系統(tǒng)的組分并釋放趨化補(bǔ)體片段。

我們?cè)谘芯恐畜@奇發(fā)現(xiàn)纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶對(duì)機(jī)體的放射和化學(xué)損傷有明顯的治療作用，且安全性高。因此，使用纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶是一種新的用于治療不同類型的放射和化學(xué)損傷其相關(guān)病癥的治療策略。

發(fā)明簡(jiǎn)述

一方面，本發(fā)明涉及纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶在制備治療和/或消除受試者輻射損傷和化學(xué)損傷及其相關(guān)病癥的藥物中的用途。同時(shí)，本發(fā)明涉及纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶在制備治療和/或消除受試者放射治療、化療或放化療引起的機(jī)體器官和組織損傷及其相關(guān)病癥的藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷包括對(duì)骨髓造血系統(tǒng)、皮膚、粘膜、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷包括對(duì)肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胃腸道、胸腺、骨髓、睪丸、附睪的損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷是放射治療、化療或放化療導(dǎo)致的一般健康狀況的下降，全身副作用和局部副作用，包括急性副作用、長期副作用和累積副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷相關(guān)病癥包括：粘膜潰瘍、免疫功能下降、骨髓抑制、消化功能障礙、心、肝、脾、肺、腎、卵巢、睪丸中毒性功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)中毒性功能障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可與一種或多種其它藥物或療法聯(lián)合施用，包括：抗癌藥物、抗感染藥物、免疫增強(qiáng)劑、止痛藥、營養(yǎng)劑和解毒劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者缺乏纖維蛋白溶酶或者纖維蛋白溶酶原。具體地，所述缺乏是先天的、繼發(fā)的和/或局部的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎(chǔ)上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個(gè)氨基酸，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動(dòng)物或嚙齒類動(dòng)物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩、恒河猴、鼠、牛、馬、狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最優(yōu)選，本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶通過外用，口服，全身或局部給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過以下途徑施用：表面、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、吸入、椎管內(nèi)、局部注射、關(guān)節(jié)內(nèi)注射或通過直腸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的施用方式是外用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述局部給藥通過在受損區(qū)域直接給予纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶來進(jìn)行預(yù)防和/或治療。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖溶酶原與適當(dāng)?shù)亩嚯妮d體或穩(wěn)定劑組合施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計(jì)算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方厘米體表面積計(jì)算)的劑量施用，優(yōu)選至少重復(fù)一次，優(yōu)選至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據(jù)情況進(jìn)一步調(diào)整。

另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療和/或消除受試者輻射損傷和化學(xué)損傷及其相關(guān)病癥的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶，以及預(yù)防和/或治療和/或消除受試者輻射損傷和化學(xué)損傷及其相關(guān)病癥的、包含纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶的藥物組合物。同時(shí)，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療和/或消除受試者放射治療、化療或放化療引起的機(jī)體器官和組織損傷及其相關(guān)病癥的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶，以及用于治療和/或消除受試者放射治療、化療或放化療引起的機(jī)體器官和組織損傷及其相關(guān)病癥的、包含纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷包括對(duì)骨髓造血系統(tǒng)、皮膚、粘膜、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷包括對(duì)肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胃腸道、胸腺、骨髓、睪丸、附睪的損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷是放射治療、化療或放化療導(dǎo)致的一般健康狀況的下降，全身副作用和局部副作用，包括急性副作用、長期副作用和累積副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷相關(guān)病癥包括：粘膜潰瘍、免疫功能下降、骨髓抑制、消化功能障礙、心、肝、脾、肺、腎、卵巢、睪丸中毒性功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)中毒性功能障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可與一種或多種其它藥物或療法聯(lián)合施用，包括：抗癌藥物、抗感染藥物、免疫增強(qiáng)劑、止痛藥、營養(yǎng)劑和解毒劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者缺乏纖維蛋白溶酶或者纖維蛋白溶酶原。具體地，所述缺乏是先天的、繼發(fā)的和/或局部的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎(chǔ)上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個(gè)氨基酸，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原微纖維蛋白溶酶原、或其任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動(dòng)物或嚙齒類動(dòng)物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最優(yōu)選，本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療和/或消除受試者輻射損傷和化學(xué)損傷及其相關(guān)病癥的、包含纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶的制品或藥盒，以及用于預(yù)防和/或治療和/或消除受試者放射治療、化療或放化療引起的機(jī)體器官和組織損傷及其相關(guān)病癥的、包含纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶的制品或藥盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷包括對(duì)骨髓造血系統(tǒng)、皮膚、粘膜、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷包括對(duì)肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胃腸道、胸腺、骨髓、睪丸、附睪的損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷是放射治療、化療或放化療導(dǎo)致的一般健康狀況的下降，全身副作用和局部副作用，包括急性副作用、長期副作用和累積副作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷相關(guān)病癥包括：粘膜潰瘍、免疫功能下降、骨髓抑制、消化功能障礙、心、肝、脾、肺、腎、卵巢、睪丸中毒性功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)中毒性功能障礙。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可與一種或多種其它藥物或療法聯(lián)合施用，包括：抗癌藥物、抗感染藥物、免疫增強(qiáng)劑、止痛藥、營養(yǎng)劑和解毒劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制品或藥盒進(jìn)一步包含含有一種或多種其它的藥物的容器。該藥盒還可包含使用說明書，說明所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以用于預(yù)防和/或治療所述損傷及其相關(guān)病癥，并且可以進(jìn)一步說明，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以在其它藥物或療法施用之前，同時(shí)，和/或之后施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者缺乏纖維蛋白溶酶或者纖維蛋白溶酶原。具體地，所述缺乏是先天的、繼發(fā)的和/或局部的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎(chǔ)上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個(gè)氨基酸，并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、并且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原微纖維蛋白溶酶原、或其任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動(dòng)物或嚙齒類動(dòng)物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最優(yōu)選，本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

本發(fā)明明確涵蓋了屬于本發(fā)明實(shí)施方案之間的技術(shù)特征的所有組合，并且這些組合后的技術(shù)方案在本申請(qǐng)中已經(jīng)明確公開，就像上述技術(shù)方案已經(jīng)單獨(dú)且明確公開一樣。另外，本發(fā)明還明確涵蓋各個(gè)實(shí)施方案及其要素的所有亞組合，并且在本文中公開，就像每一個(gè)此類亞組合單獨(dú)且明確在本文中公開一樣。

發(fā)明詳述

“放射損傷”也稱“輻射損傷”是由放射線照射引起的機(jī)體全身或局部器官、組織損害(損傷)。一般來說，放射線是由天然或人工能源產(chǎn)生的高能電磁波或高能粒子。大劑量射線瞬間照射或低劑量射線長時(shí)間照射都可能引起器官、組織損傷?！盎瘜W(xué)損傷”是化學(xué)物接觸人體后產(chǎn)生的局部損害(損傷)或全身損害(損傷)。其損害程度與化學(xué)物的性質(zhì)、劑量、濃度、接觸時(shí)間及面積、處理是否及時(shí)及有效等因素有關(guān)。

輻射損傷和化學(xué)損傷可表現(xiàn)為機(jī)體器官、組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷，例如，骨髓造血系統(tǒng)生理結(jié)構(gòu)和功能的損傷、皮膚、粘膜的生理結(jié)構(gòu)和功能損傷、免疫系統(tǒng)的生理結(jié)構(gòu)和功能損傷和生殖系統(tǒng)的生理結(jié)構(gòu)和功能損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述損傷包括對(duì)肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胃腸道、胸腺、骨髓、睪丸、附睪的生理結(jié)構(gòu)和功能的損傷。所述損傷相關(guān)病癥表現(xiàn)為損傷器官和組織的功能障礙，例如粘膜潰瘍、免疫功能下降、骨髓抑制、消化功能障礙、心、肝、脾、肺、腎、卵巢、睪丸中毒性功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)中毒性功能障礙。

“放射治療”與“放療”可以互換使用?；瘜W(xué)藥物的治療通常簡(jiǎn)稱為“化療”。“放化療”指放療或化療二者的結(jié)合。臨床上，普遍使用放射治療或化療或兩者的結(jié)合用于治療或改善腫瘤和癌癥患者。其中，放療通常使用X射線、γ射線、中子和其它來源射線殺死癌細(xì)胞或破壞細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)。而化療通過單獨(dú)或組合使用細(xì)胞毒性藥物破壞癌細(xì)胞復(fù)制或增殖，而正常細(xì)胞在放療中也受損并無法自身修復(fù)。放療期可出現(xiàn)副作用，包括皮膚刺激、治療區(qū)域脫發(fā)，也可損傷骨髓。

“化療”是指單獨(dú)或聯(lián)合使用細(xì)胞毒性藥物，以殺死癌細(xì)胞。如放療一樣，癌細(xì)胞可被損傷并最終死亡，但是健康細(xì)胞在化療后的自我修復(fù)過程中受到影響。細(xì)胞毒性藥物通過干擾生長細(xì)胞的分化和增殖能力而起作用。因此，除癌細(xì)胞之外，其他正常快速分化和生長的細(xì)胞也會(huì)受到影響。例如，它們可影響骨髓的造血功能，引起骨髓抑制。此外，它們還可影響消化道、口腔內(nèi)壁和生殖系統(tǒng)的細(xì)胞、影響毛囊，造成腹瀉、口腔疼痛和脫發(fā)。

“放化療的副作用”是指與放化療有關(guān)，通常在不同階段出現(xiàn)的副作用，如出現(xiàn)在治療期間(急性副作用)，治療后數(shù)月或數(shù)年(長期副作用)，或重復(fù)治療后(累積副作用)。其性質(zhì)、嚴(yán)重性和副作用時(shí)間長短取決于接受治療的器官、治療本身(放射類型、劑量、分級(jí)、合并化學(xué)療法)和患者。

大多數(shù)副作用是可以預(yù)測(cè)和預(yù)期的。放療的副作用通常僅限于患者接受治療的局部區(qū)域?，F(xiàn)代放療方法的目標(biāo)旨在將副作用降至最小，并幫助患者了解和處理那些無法避免的副作用。

骨髓抑制是諸多放療和化療副作用之一。其結(jié)果是減少血細(xì)胞生成，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板。結(jié)果，患者由于貧血而疲勞，由于白血球減少癥而變得容易感染；由于血小板減少，當(dāng)有傷口時(shí)候，更容易出現(xiàn)瘀傷和出血更多。

“一般健康狀況”是一種健康標(biāo)準(zhǔn)，是指身體、相關(guān)組織和器官在沒有活動(dòng)性疾病、不適和不安的基礎(chǔ)上，個(gè)體能夠飲食、說話和參加社交，而有助于滿足基本康樂。一般健康的主要標(biāo)志包括生理健康和心理健康。

“纖溶酶”是存在于血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產(chǎn)物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據(jù)swiss prot中的序列，按含有信號(hào)肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列(序列4)計(jì)算由810個(gè)氨基酸組成，分子量約為92kD，主要在肝臟中合成并能夠在血液中循環(huán)的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于C末端的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域、N末端的Pan Apple(PAp)結(jié)構(gòu)域以及5個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號(hào)肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個(gè)氨基酸組成(不含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在體內(nèi)，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結(jié)構(gòu)的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域^[18,19]，有文獻(xiàn)報(bào)道了δ-纖溶酶原的氨基酸序列(序列8)^[19]，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻(xiàn)報(bào)道其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號(hào)肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[20]，其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，有文獻(xiàn)報(bào)道其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號(hào)肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)^[21]，也有專利文獻(xiàn)CN102154253A報(bào)道其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號(hào)肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始氨基酸)，本專利序列參考專利文獻(xiàn)CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本發(fā)明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在循環(huán)過程中，纖溶酶原采用封閉的非活性構(gòu)象，但當(dāng)結(jié)合至血栓或細(xì)胞表面時(shí)，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導(dǎo)下，其轉(zhuǎn)變?yōu)槌书_放性構(gòu)象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進(jìn)一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產(chǎn)物和D-二聚體，進(jìn)而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結(jié)構(gòu)域包含維持纖溶酶原處于非活性封閉構(gòu)象的重要決定簇，而KR結(jié)構(gòu)域則能夠與存在于受體和底物上的賴氨酸殘基結(jié)合。已知多種能夠作為纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段”是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結(jié)合并發(fā)揮蛋白水解功能的活性片段。本發(fā)明涉及纖溶酶原的技術(shù)方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術(shù)方案。本發(fā)明所述的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質(zhì)，優(yōu)選，本發(fā)明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、并且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。

目前，對(duì)于血液中纖溶酶原及其活性測(cè)定方法包括：對(duì)組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(cè)(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(cè)(t-PAAg)、對(duì)血漿組織纖溶酶原活性的檢測(cè)(纖溶酶原A)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(cè)(纖溶酶原Ag)、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測(cè)、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測(cè)、血漿纖溶酶-抗纖溶酶復(fù)合物檢測(cè)(PAP)。其中最常用的檢測(cè)方法為發(fā)色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發(fā)色底物，受檢血漿中的纖溶酶原在SK的作用下，轉(zhuǎn)變成PLM，后者作用于發(fā)色底物，隨后用分光光度計(jì)測(cè)定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化學(xué)法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴(kuò)散法等對(duì)血液中的纖溶酶原活性進(jìn)行測(cè)定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進(jìn)化而來的蛋白或基因。本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶包括人的天然纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶，還包括來源于不同物種的、具有纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶活性的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個(gè)給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質(zhì)或酶的整體構(gòu)象和功能，這包括但不限于以相似特性(如酸性，堿性，疏水性，等)的氨基酸取代親本蛋白質(zhì)中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質(zhì)的氨基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的堿性氨基酸并可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個(gè)蛋白或氨基酸序列的相似性可能會(huì)不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)?！氨Ｊ厝〈凅w”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達(dá)75％以上更好，最好能達(dá)85％以上，甚至達(dá)90％以上為最佳，并且與天然或親本蛋白質(zhì)或酶相比具有相同或基本相似的性質(zhì)或功能。

“分離的”纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶是指從其天然環(huán)境分離和/或回收的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶會(huì)純化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的純度(按重量計(jì))，如通過Lowry法所確定的，例如超過99％(按重量計(jì))，(2)至足以通過使用旋轉(zhuǎn)杯序列分析儀獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度，或(3)至同質(zhì)性，該同質(zhì)性是通過使用考馬斯藍(lán)或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶也包括通過生物工程技術(shù)從重組細(xì)胞制備，并通過至少一個(gè)純化步驟分離的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶。

術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經(jīng)修飾的肽主鏈的多肽。該術(shù)語包括融合蛋白，包括但不限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導(dǎo)序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關(guān)于參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)(％)”定義為在必要時(shí)引入缺口以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性后，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時(shí)，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。為測(cè)定百分比氨基酸序列同一性目的的對(duì)比可以以本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的多種方式實(shí)現(xiàn)，例如使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員能決定用于比對(duì)序列的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較序列全長實(shí)現(xiàn)最大對(duì)比需要的任何算法。然而，為了本發(fā)明的目的，氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)值是使用序列比較計(jì)算機(jī)程序ALIGN-2產(chǎn)生的。

在采用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情況中，給定氨基酸序列A相對(duì)于給定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對(duì)于、與、或針對(duì)給定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計(jì)算：

分?jǐn)?shù)X/Y乘100

其中X是由序列比對(duì)程序ALIGN-2在該程序的A和B比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對(duì)于B的％氨基酸序列同一性會(huì)不等于B相對(duì)于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計(jì)算機(jī)程序獲得的。

如本文中使用的，術(shù)語“治療”、“處理”和“消除”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀，和/或部分或完全治愈疾病和/或其癥狀，并且包括：(a)預(yù)防疾病在受試者體內(nèi)發(fā)生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其癥狀，即引起疾病和/或其癥狀消退。

術(shù)語“個(gè)體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動(dòng)物，包括但不限于鼠(大鼠，小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動(dòng)物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對(duì)哺乳動(dòng)物或其它受試者施用以治療疾病時(shí)足以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的所述預(yù)防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會(huì)根據(jù)所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其癥狀的嚴(yán)重程度以及年齡、體重等而變化。

本發(fā)明纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶的制備

纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可以從自然界分離并純化用于進(jìn)一步的治療用途，也可以通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)肽合成技術(shù)來合成。當(dāng)通過化學(xué)合成多肽時(shí)，可以經(jīng)液相或固相進(jìn)行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接著序貫添加序列中剩余的氨基酸)是適合纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶化學(xué)合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用于合成纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶。用于固相合成的技術(shù)描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein Pept Lett.12:723-8中。簡(jiǎn)言之，用其上構(gòu)建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯(lián)/去保護(hù)的重復(fù)循環(huán)后，將附接的固相游離N末端胺與單個(gè)受N保護(hù)的氨基酸單元偶聯(lián)。然后，將此單元去保護(hù)，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后將其切掉。

可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組方法來生產(chǎn)本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原。例如，將編碼纖維蛋白溶酶原的核酸插入表達(dá)載體中，使其與表達(dá)載體中的調(diào)控序列可操作連接。表達(dá)調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子(例如天然關(guān)聯(lián)的或異源的啟動(dòng)子)、信號(hào)序列、增強(qiáng)子元件、和轉(zhuǎn)錄終止序列。表達(dá)調(diào)控可以是載體中的真核啟動(dòng)子系統(tǒng)，所述載體能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞(例如COS或CHO細(xì)胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合于核苷酸序列的高水平表達(dá)及纖維蛋白溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達(dá)載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分復(fù)制。通常，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)志物(例如氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于對(duì)外源用期望的DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細(xì)胞的例子。適合于使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達(dá)載體，其通常會(huì)含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(例如復(fù)制起點(diǎn))。另外，會(huì)存在許多公知的啟動(dòng)子，諸如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)，β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)，或來自噬菌體λ的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子通常會(huì)控制表達(dá)，任選在操縱基因序列的情況中，并且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等，以啟動(dòng)并完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母也可用于表達(dá)。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細(xì)胞的例子，其中合適的載體根據(jù)需要具有表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子)、復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等。典型的啟動(dòng)子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導(dǎo)型酵母啟動(dòng)于特別包括來自醇脫氫酶、異細(xì)胞色素C、和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子。

在微生物外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如在體外細(xì)胞培養(yǎng)物中培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)也可以用于表達(dá)并生成本發(fā)明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CHO細(xì)胞系、各種Cos細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞系、和經(jīng)轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞或雜交瘤。用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體可以包含表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子(Queen等,Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位點(diǎn)，諸如核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA剪接位點(diǎn)，多聚腺苷酸化位點(diǎn)，和轉(zhuǎn)錄終止子序列。合適的表達(dá)控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒等衍生的啟動(dòng)子。參見Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化學(xué)或重組方式)，可以依照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱層析、高效液相層析(HPLC)、凝膠電泳等來純化本發(fā)明所述的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶。該纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶是基本上純的，例如至少約80％至85％純的，至少約85％至90％純的，至少約90％至95％純的，或98％至99％純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細(xì)胞碎片，除主題抗體以外的大分子，等等。

藥物配制劑

可以通過將具有所需純度的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶與可選的藥用載體、賦形劑，或穩(wěn)定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍干制劑或水溶液制備治療配制劑?？山邮艿妮d體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對(duì)受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化芐烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對(duì)羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少于約10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、巖藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。優(yōu)選凍干的抗-VEGF抗體配制劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。

本發(fā)明的配制劑也可含有需治療的具體病癥所需的一種以上的活性化合物，優(yōu)選活性互補(bǔ)并且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗腫瘤藥物、抗癌藥物、抗感染藥、免疫增強(qiáng)劑、止痛藥、營養(yǎng)劑和解毒劑等。

本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可包裹在通過諸如凝聚技術(shù)或界面聚合而制備的微膠囊中，例如，可置入在膠質(zhì)藥物傳送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術(shù)公開于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用于體內(nèi)給藥的本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶必需是無菌的。這可以通過在冷凍干燥和重新配制之前或之后通過除菌濾膜過濾而輕易實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶可制備緩釋制劑。緩釋制劑的適當(dāng)實(shí)例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質(zhì)，例如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實(shí)例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3773919,EP58,481)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers22:547(1983))、不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時(shí)間卻較短。可以根據(jù)相關(guān)機(jī)理來設(shè)計(jì)使蛋白穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機(jī)理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、采用合適的添加劑、和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，顱內(nèi)，鞘內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)(例如經(jīng)由頸動(dòng)脈)，肌內(nèi)，鼻內(nèi)，表面或皮內(nèi)施用或脊髓或腦投遞來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明藥物組合物的施用。氣溶膠制劑如鼻噴霧制劑包含活性劑的純化的水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。將此類制劑調(diào)節(jié)至與鼻粘膜相容的pH和等滲狀態(tài)。

用于胃腸外施用的制備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機(jī)酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內(nèi)媒介物包含液體和營養(yǎng)補(bǔ)充物、電解質(zhì)補(bǔ)充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫(yī)務(wù)人員會(huì)基于各種臨床因素確定劑量方案。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的，任一患者的劑量取決于多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數(shù)和路徑、總體健康、和同時(shí)施用的其它藥物。本發(fā)明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量范圍可以為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的范圍，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范圍的劑量也涵蓋在內(nèi)，特別是考慮到上述的因素。上述范圍中的中間劑量也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。受試者可以每天、隔天、每周或根據(jù)通過經(jīng)驗(yàn)分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續(xù)幾天1-10mg/kg。在本發(fā)明的藥物施用過程中需要實(shí)時(shí)評(píng)估、定期評(píng)估放射性和化學(xué)性損傷及其相關(guān)病癥的治療效果和安全性。

治療效力和治療安全性

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及使用纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶治療受試者后，對(duì)治療效力和治療安全性的判斷。其中對(duì)所述治療效力的判斷方法包括但不限于：1)免疫系統(tǒng)恢復(fù)的檢查，具體地，例如白細(xì)胞、血小板數(shù)量的恢復(fù)，預(yù)期受試者在接受本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶治療后上述檢測(cè)恢復(fù)至正常值范圍或得到改善，如白細(xì)胞恢復(fù)至4～10×10⁹/L，血小板恢復(fù)至100～300×10⁹/L；2)消化系統(tǒng)的不良表現(xiàn)得到改善，包括食欲不振、惡心嘔吐、腹瀉、便秘等癥狀具有改善；3)機(jī)體各器官功能的改善，包括肝功能如谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素水平、腎功能等的改善，具體地，預(yù)期受試者在接受本發(fā)明的纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶治療后上述檢測(cè)恢復(fù)至正常值范圍或得到改善，如例如，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)：0～40μ/L、總膽紅素：3.4～20.5μmol/L；4)靜脈炎、潰瘍等其他癥狀的改善。此外，本發(fā)明還涉及使用纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶對(duì)受試者進(jìn)行治療過程中和治療后，所述該治療方案安全性的判斷，包括但不限于對(duì)受試者的血清半衰期、治療半衰期、半數(shù)中毒量(TD50)、半數(shù)致死量(LD50)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，或?qū)υ谥委熯^程中或治療后發(fā)生的各種不良事件如致敏反應(yīng)進(jìn)行觀察。

制品或藥盒

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種制品或藥盒，其包含可用于治療放射性和化學(xué)性損傷及其相關(guān)病癥的本發(fā)明纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶。所述制品優(yōu)選包括一個(gè)容器，標(biāo)簽或包裝插頁。適當(dāng)?shù)娜萜饔衅孔?、小瓶、注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發(fā)明的疾病或病癥并具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內(nèi)溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶。所述容器上或所附的標(biāo)簽說明所述組合物用于治療本發(fā)明所述放射性和化學(xué)性損傷及其相關(guān)病癥。所述制品可進(jìn)一步包含含有可藥用緩沖液的第二容器，諸如磷酸鹽緩沖的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進(jìn)一步包含從商業(yè)和使用者角度來看所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述制品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示給予纖溶酶原對(duì)5.0Gy X射線輻射后小鼠體重的變化。

圖2顯示5.0Gy X射線輻射過的小鼠給予纖溶酶原10天后腎臟的HE染色觀察結(jié)果。

圖3顯示5.0Gy X射線輻射過的小鼠給予纖溶酶原10天后腎臟的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80免疫組化染色觀察結(jié)果。

圖4顯示5.0Gy X射線輻射過的小鼠給予纖溶酶原10天后十二指腸的HE染色觀察結(jié)果。

圖5顯示5.0Gy X射線輻射過的小鼠給予纖溶酶原10天后十二指腸巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80免疫組化染色觀察結(jié)果。

圖6顯示5.0Gy X射線輻射過的小鼠給予纖溶酶原10天后肝臟巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80免疫組化染色觀察結(jié)果。

圖7顯示5.0Gy X射線輻射過的小鼠給予纖溶酶原1、4、7、14天后肝臟HE染色觀察結(jié)果。

圖8顯示10mg/kg順鉑化療損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天后體重的變化。

圖9顯示10mg/kg順鉑化療損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天后腎臟HE染色觀察結(jié)果。

圖10顯示10mg/kg順鉑化療損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天后腎臟纖維蛋白免疫組化染色觀察結(jié)果。

圖11顯示10mg/kg順鉑化療損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天后腎臟Bcl-2免疫組化染色觀察結(jié)果。

圖12顯示10mg/kg順鉑化療損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天后肝臟的HE染色觀察結(jié)果。

圖13顯示10mg/kg順鉑化療損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天后肝臟纖維蛋白免疫組化染色觀察結(jié)果。

圖14顯示10mg/kg順鉑化療損傷模型小鼠給予纖溶酶原7天后睪丸和附睪的HE染色觀察結(jié)果。

實(shí)施例

材料與方法：

放射性損傷模型：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7-8周齡SPF級(jí)健康雄性C57小鼠用于5.0Gy照射后研究脾肝腎等器官的病理組織學(xué)改變。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分成三組，分別為空白對(duì)照組、單純輻照組和給纖溶酶原組。

實(shí)驗(yàn)方法：采用直線加速器6MV X射線5.0Gy小鼠全身單次均勻照射，吸收劑量率2.0Gy/min，吸收劑量為5.0Gy為亞致死量照射，用于研究脾肝腎等器官的病理組織學(xué)改變、造血和免疫功能及自由基檢測(cè)，源皮距100cm，照射面積30cm×30cm，正常對(duì)照組蓋以鉛塊保護(hù)。受照后給藥至小鼠死亡或特定時(shí)間處死，對(duì)照組給予相應(yīng)體積的溶媒。觀察受照小鼠大體情況、并在光鏡下觀察肝、腸組織、腎組織HE染色病理組織學(xué)改變以及F4/80的免疫組化染色。

觀察指標(biāo)：

1.肝、腸、腎病理組織學(xué)觀察：

小鼠摘眼球取血處死后取脾肝、腸、腎組織，用10％中性福爾馬林固定、經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟切片(片厚5μm)，常規(guī)HE染色后中性樹膠封片，鏡下觀察各組織病理學(xué)改變。

2.肝、腸、腎F4/80免疫組化染色觀察。

肝、腸、腎石蠟切片(片厚5μm)，免疫組化染色后鏡下觀察其在各組織中的表達(dá)情況。

化學(xué)性損傷模型：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7-8周齡SPF級(jí)健康雄性C57小鼠用于抗順鉑毒副作用效果觀察，動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后隨機(jī)分成三組，分別為空白對(duì)照組、單純模型組和給纖溶酶原組。

實(shí)驗(yàn)方法：

順鉑組：將順鉑針劑用生理鹽水配成質(zhì)量濃度為1mg/ml的水溶液，按3.5ml/kg體重經(jīng)腹腔注射給藥。對(duì)照組小鼠每次腹腔注射等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥5d造模，造模后治療組按1mg/只給予纖溶酶原，對(duì)照組和模型組給予同體積的溶媒，在給纖溶酶原后的第7天處死動(dòng)物。分別取血和腎組織等進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

觀察指標(biāo)：

1.體重變化曲線：每天在給藥前測(cè)量小鼠體重，觀察各組小鼠體重的變化。

2.腎臟系數(shù)：處死小鼠后，立即取腎組織，新鮮稱重，計(jì)算腎臟系數(shù)[腎臟系數(shù)Z(臟器質(zhì)量/體重)×100％]。

3.腎臟組織HE觀察：用10％中性福爾馬林固定、經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、石蠟切片(片厚5μm)，常規(guī)HE染色后中性樹膠封片，鏡下觀察各組織病理學(xué)改變。

4.動(dòng)物胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)：處死小鼠后，立即取胸腺和脾臟，新鮮稱重，計(jì)算胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)[臟器系數(shù)Z(臟器質(zhì)量/體重)×100％]。

5.睪丸和附睪重量：處死各組小鼠后，取材睪丸和附睪，稱重后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

6.睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察：睪丸組織經(jīng)常規(guī)固定、脫水、包埋、切片后，進(jìn)行HE染色觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)變化。

實(shí)施例1纖溶酶原對(duì)5.0Gy X射線輻射后小鼠體重的影響

給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，在第0、5、12、21天的體重?cái)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均無明顯差異(圖1)。說明X射線輻射和給藥處理不影響小鼠體重。

實(shí)施例2纖溶酶原對(duì)5.0Gy X射線輻射小鼠腎臟的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)使用6-8周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立放射損傷模型，采用直線加速器6MV X射線按5.0Gy對(duì)小鼠全身單次均勻照射，吸收劑量率2.0Gy/min，吸收劑量為5.0Gy(照射2.5分鐘)。建立模型后，3個(gè)小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始輻射處理并給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為10天給藥完成后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行停藥觀察11天，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期為21天。給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給藥，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。在第21天處死解剖小鼠并取腎臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的腎臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水并用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1％鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，并酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍觀察。

結(jié)果顯示，對(duì)于給溶媒PBS對(duì)照組(圖2A)，可見腎小球萎縮(*)，腎小管蛋白管型(◤)；而對(duì)于給纖溶酶原組(圖2B)，腎小球毛細(xì)血管腔通暢，球囊腔清晰可見。給纖溶酶原組腎臟的損傷明顯輕于給溶媒PBS對(duì)照組，說明注射纖溶酶原能夠促進(jìn)X射線輻射所致的腎損傷的修復(fù)。

實(shí)施例3纖溶酶原促進(jìn)5.0Gy X射線輻射小鼠腎臟炎癥的修復(fù)

本實(shí)驗(yàn)使用6-8周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立放射損傷模型，采用直線加速器6MV X射線按5.0Gy對(duì)小鼠全身單次均勻照射，吸收劑量率2.0Gy/min，吸收劑量為5.0Gy(照射2.5分鐘)。建立模型后，3個(gè)小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始輻射處理并給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為10天給藥完成后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行停藥觀察11天，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期為21天。給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給藥，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。在第21天處死解剖小鼠并取腎臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的腎臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水后水洗1次。Tris-EDTA修復(fù)30分鐘，室溫冷卻20分鐘后水輕柔沖洗。以3％雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10％的正常羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封閉1小時(shí)；時(shí)間到后，棄除羊血清液。兔抗小鼠F4/80抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時(shí)，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次后蘇木素復(fù)染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明并封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

F4/80巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，可以表示炎癥反應(yīng)的程度和階段。結(jié)果顯示，給溶媒PBS對(duì)照組(圖3A)的小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的表達(dá)量高于給纖溶酶原組(圖3B)，說明給纖溶酶原后，動(dòng)物腎臟組織的炎癥顯著減輕。定量分析結(jié)果與鏡檢觀察一致，且統(tǒng)計(jì)差異顯著(圖3C)，表明纖溶酶原能夠促進(jìn)X射線輻射所致的腎臟炎癥的修復(fù)。

實(shí)施例4纖溶酶原對(duì)5.0Gy X射線輻射小鼠十二指腸的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)使用6-8周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立放射損傷模型，采用直線加速器6MV X射線按5.0Gy對(duì)小鼠全身單次均勻照射，吸收劑量率2.0Gy/min，吸收劑量為5.0Gy(照射2.5分鐘)。建立模型后，3個(gè)小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始輻射處理并給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為10天給藥完成后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行停藥觀察11天，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期為21天。給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給藥，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。在第21天處死解剖小鼠并取十二指腸在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的十二指腸組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水并用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1％鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，并酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結(jié)果顯示，對(duì)于給溶媒PBS對(duì)照組(圖4A)，局部腸壁粘膜上皮脫離，變性壞死，脫落處正常粘膜層結(jié)構(gòu)消失；而對(duì)于給纖溶酶原組(圖4B)，可見紅染折光的紋狀緣，粘膜上皮可見杯狀細(xì)胞，絨毛中心為固有層，結(jié)構(gòu)清晰，層次分明。給纖溶酶原組十二指腸的損傷明顯輕于給溶媒PBS對(duì)照組，注射纖溶酶原能夠促進(jìn)X射線輻射所致的十二指腸損傷的修復(fù)。

實(shí)施例5纖溶酶原促進(jìn)5.0Gy X射線輻射小鼠十二指腸炎癥的修復(fù)

本實(shí)驗(yàn)使用6-8周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立放射損傷模型，采用直線加速器6MV X射線按5.0Gy對(duì)小鼠全身單次均勻照射，吸收劑量率2.0Gy/min，吸收劑量為5.0Gy(照射2.5分鐘)。建立模型后，3個(gè)小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始輻射處理并給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為10天給藥完成后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行停藥觀察11天，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期為21天。給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給藥，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。在第21天處死解剖小鼠并取十二指腸在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的十二指腸組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水后水洗1次。Tris-EDTA修復(fù)30分鐘，室溫冷卻20分鐘后水輕柔沖洗。以3％雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10％的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時(shí)；時(shí)間到后，棄除羊血清液。兔抗小鼠F4/80抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時(shí)，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次后蘇木素復(fù)染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明并封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結(jié)果顯示，給溶媒PBS對(duì)照組(圖5A)的小鼠F4/80表達(dá)量明顯高于給纖溶酶原組(圖5B)，說明給纖溶酶原后，十二指腸的炎癥顯著減輕，反映纖溶酶原能夠促進(jìn)X射線輻射所致的十二指腸炎癥的修復(fù)。

實(shí)施例6纖溶酶原促進(jìn)5.0GyX射線輻射小鼠肝臟炎癥的修復(fù)

本實(shí)驗(yàn)使用6-8周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立放射損傷模型，采用直線加速器6MV X射線按5.0Gy對(duì)小鼠全身單次均勻照射，吸收劑量率2.0Gy/min，吸收劑量為5.0Gy(照射2.5分鐘)。建立模型后，3個(gè)小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始輻射處理并給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為10天給藥完成后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行停藥觀察11天，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期為21天。給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給藥，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。在第21天處死解剖小鼠并取肝臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的肝臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水后水洗1次。Tris-EDTA修復(fù)30分鐘，室溫冷卻20分鐘后水輕柔沖洗。以3％雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10％的正常羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封閉1小時(shí)；時(shí)間到后，棄除羊血清液。兔抗小鼠F4/80抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時(shí)，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次后蘇木素復(fù)染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明并封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

F4/80免疫組化結(jié)果顯示，5.0Gy X射線照射造模后給溶媒PBS對(duì)照組(圖6A)的小鼠巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的表達(dá)量高于給纖溶酶原組(圖6B)。說明給纖溶酶原后，動(dòng)物肝臟組織的炎癥顯著減輕。、

實(shí)施例7纖溶酶原對(duì)5.0Gy X射線輻射小鼠肝臟的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)使用6-8周齡健康的雄性C57小鼠24只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各12只。分組完成后，建立放射損傷模型，采用直線加速器6MV X射線按5.0Gy對(duì)小鼠全身單次均勻照射，吸收劑量率2.0Gy/min，吸收劑量為5.0Gy(照射2.5分鐘)。建立模型后，3個(gè)小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原。給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給藥，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始輻射處理并給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為14天。照射后第1、4、7、14天，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只動(dòng)物，取小鼠肝臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的肝臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水并用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1％鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，并酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結(jié)果顯示，對(duì)于給溶媒PBS對(duì)照組(圖7a-d)第1天肝臟，肝索以中央靜脈為中心放射狀向四周擴(kuò)散，紋理規(guī)則，肝竇清晰，部分肝細(xì)胞變性壞死，核溶解，胞漿淡染(↓)；第4天肝竇內(nèi)輕度炎細(xì)胞浸潤()，肝竇變窄；第7天肝細(xì)胞壞死進(jìn)一步加重，并且肝細(xì)胞呈現(xiàn)了輕度水樣變性(◤)，胞漿溶解，肝索紊亂；第14天肝臟已有較大的好轉(zhuǎn)，肝索較規(guī)則，肝竇清晰，但仍在臨近中央靜脈處肝竇內(nèi)有少量炎細(xì)胞浸潤。

給纖溶酶原組(圖7e-g)第1天肝臟，肝索規(guī)則，肝竇清晰，有少量肝細(xì)胞壞死(↓)；第4天肝臟在中央靜脈周圍肝細(xì)胞出現(xiàn)了輕度的水樣變性(◤)；從第7天開始，肝臟病變開始好轉(zhuǎn)，肝索以中央靜脈為中心放射狀排列，肝竇清晰；第14天肝臟也呈現(xiàn)不斷好轉(zhuǎn)，壞死較第一天明顯減輕，肝索比之第7天也更加規(guī)則。

總而言之，PBS對(duì)照組從第1天至第7天，肝臟呈現(xiàn)漸進(jìn)性損傷，到了第14天才有好轉(zhuǎn)的趨勢(shì)；而給藥組雖然從第1天至第4天肝臟有損傷的趨勢(shì)，但是從第7天開始肝臟就已經(jīng)出現(xiàn)了較大幅度的好轉(zhuǎn)。說明纖溶酶原能夠促進(jìn)修復(fù)X射線輻射所致的肝臟損傷。

實(shí)施例8纖溶酶原對(duì)順鉑化療損傷模型小鼠體重的影響

實(shí)施例9纖溶酶原對(duì)順鉑化療損傷模型小鼠腎臟的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)使用8-9周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立化療損傷模型，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑。建立模型后，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天1mg/只/天經(jīng)尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始腹腔注射順鉑造模，造模后3小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取腎臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的腎臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水并用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1％鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，并酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

HE結(jié)果顯示，給溶媒PBS對(duì)照組(圖9A)出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞壞死(◤)，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(↓)；而給纖溶酶原組(圖9B)腎小管未有明顯壞死，僅伴有少量炎癥細(xì)胞的浸潤。說明纖溶酶原能夠減輕化療藥順鉑所致的腎臟損傷。

實(shí)施例10纖溶酶原促進(jìn)順鉑化療損傷模型小鼠腎臟纖維蛋白的降解

本實(shí)驗(yàn)使用8-9周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立化療損傷模型，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑。建立模型后，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始腹腔注射順鉑造模，造模后3小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取腎臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的腎臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水后水洗1次。檸檬酸修復(fù)30分鐘，室溫冷卻10分鐘后水輕柔沖洗。以3％雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10％的正常羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封閉1小時(shí)；時(shí)間到后，棄除羊血清液。兔抗小鼠纖維蛋白抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時(shí)，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次后蘇木素復(fù)染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明并封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機(jī)體對(duì)損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)，纖維蛋白原水解成纖維蛋白沉積在損傷部位^[22-24]。因此，可將損傷局部纖維蛋白水平作為損傷程度的一個(gè)標(biāo)志。

結(jié)果顯示，給溶媒PBS對(duì)照組(圖10A)纖維蛋白的陽性著色顯著深于給纖溶酶原組(圖10B)。說明纖溶酶原能夠顯著減輕化療藥物順鉑所致的纖維蛋白沉積，有助于化療藥物順鉑所致的腎臟損傷的修復(fù)。

實(shí)施例11纖溶酶原促進(jìn)順鉑化療損傷模型小鼠腎臟凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)使用8-9周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立化療損傷模型，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑。建立模型后，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始腹腔注射順鉑造模，造模后3小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取腎臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的腎臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟至水后水洗1次。檸檬酸修復(fù)30分鐘，室溫冷卻10分鐘后水輕柔沖洗。以3％雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10％的正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時(shí)；時(shí)間到后，棄除羊血清液。兔抗小鼠Bcl-2抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時(shí)，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次后蘇木素復(fù)染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明并封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

Bcl-2為細(xì)胞凋亡抑制蛋白，在凋亡刺激因子作用下會(huì)下調(diào)表達(dá)^[25,26]。結(jié)果顯示，給溶媒PBS對(duì)照組(圖11A)腎臟組織中Bcl-2的陽性著色明顯低于給纖溶酶原組(圖11B)。說明纖溶酶原能顯著提高化療藥物順鉑所致的腎臟組織中凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而有助于抑制腎臟組織細(xì)胞的凋亡。

實(shí)施例12纖溶酶原對(duì)順鉑化療損傷模型小鼠肝臟的保護(hù)作用

本實(shí)驗(yàn)使用8-9周C57小鼠10只，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組各5只。分組完成后，建立化療損傷模型，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑。建立模型后，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始腹腔注射順鉑并給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取肝臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的肝臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水并用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1％鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，并酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

HE結(jié)果顯示，給溶媒PBS組(圖12A)肝臟中央靜脈擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞壞死，周圍輕度炎細(xì)胞浸潤，還可見較大的炎性灶(↓)，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，核碎裂，胞漿淡染，肝索紊亂；而給纖溶酶組(圖12B)肝臟肝索以中央靜脈為中心向四周發(fā)散，肝竇清晰，胞漿紅染，肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤明顯減輕。說明纖溶酶原能夠顯著減輕化療藥順鉑所致的肝臟損傷。

實(shí)施例13纖溶酶原促進(jìn)順鉑化療損傷模型小鼠肝臟纖維蛋白的降解

本實(shí)驗(yàn)使用8-9周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立化療損傷模型，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑。建立模型后，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只/天經(jīng)尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始腹腔注射順鉑造模，造模后3小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取肝臟在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的肝臟組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水后水洗1次。檸檬酸修復(fù)30分鐘，室溫冷卻10分鐘后水輕柔沖洗。以3％雙氧水孵育15分鐘，用PAP筆圈出組織。10％的正常羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封閉1小時(shí)；時(shí)間到后，棄除羊血清液。兔抗小鼠纖維蛋白抗體(Abcam)4℃孵育過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時(shí)，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次后蘇木素復(fù)染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明并封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結(jié)果顯示，給溶媒PBS照組(圖13A)肝臟組織中纖維蛋白陽性著色明顯深于給纖溶酶原組(圖13B)。說明纖溶酶原能夠顯著減輕纖維蛋白的沉積，從而促進(jìn)化療藥順鉑所致的肝臟損傷的修復(fù)。

實(shí)施例14纖溶酶原降低順鉑處理對(duì)小鼠的生殖器官的毒性

本實(shí)驗(yàn)使用8-9周齡健康的雄性C57小鼠10只，隨機(jī)分為兩組，給溶媒PBS對(duì)照組和給纖溶酶原組，每組各5只。分組完成后，建立化療損傷模型，按10mg/Kg體重單次腹腔注射順鉑。建立模型后，給纖溶酶原組按1mg/0.1mL/只天經(jīng)尾靜脈注射給予纖溶酶原，給溶媒PBS對(duì)照組給予相同體積的PBS。實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天為第0天稱量體重并分組，第1天開始腹腔注射順鉑造模，造模3小時(shí)內(nèi)給予纖溶酶原或溶媒PBS，給藥期為7天。第8天處死小鼠，取睪丸和附睪在10％中性福爾馬林固定液中固定24-48小時(shí)。固定后的睪丸和附睪組織經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后進(jìn)行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟復(fù)水并用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1％鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，并酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。

結(jié)果顯示，溶媒PBS對(duì)照組附睪輸精管(圖14A)中精子數(shù)減少，并伴有附睪組織多處壞死，精子數(shù)目較之于給纖溶酶組明顯減少，睪丸(圖14C)間質(zhì)多處壞死()；與給溶媒PBS對(duì)照組相比，給纖溶酶原組附睪輸精管(圖14B)中精子數(shù)也明顯多于給溶媒PBS對(duì)照組，睪丸間質(zhì)(圖14D)壞死病灶(單處壞死病灶)也明顯減少。說明纖溶酶原能夠減輕化療藥順鉑所致的生殖器官毒性。

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序列表

<110> 深圳瑞健生命科學(xué)研究院有限公司

<120> 一種預(yù)防或治療放射性和化學(xué)性損傷的方法

<130> PCK02777

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信號(hào)肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620

tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信號(hào)肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)氨基酸序列

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<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信號(hào)肽的天然纖溶酶原（來源于swiss prot）的氨基酸序列

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