本發(fā)明涉及一種魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物的制備方法。

背景技術(shù)：

肝素是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，作為抗凝血藥己廣泛應(yīng)用于臨床。此外，肝素還具有抗平滑肌細(xì)胞增殖、抗炎、抗腫瘤及抗病毒等多種生物活性，尤其在改善腫瘤患者生活質(zhì)量、提高生存期等方面起著積極作用¨'2肝素。研究表明，肝素能與細(xì)胞外基質(zhì)中的各種生物活性分子結(jié)合：如與血管生長(zhǎng)因子結(jié)合后能明顯抑制血管的生成，從而抑瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；與選擇素、整合素和(或)趨化因子結(jié)合而阻斷腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板的相互黏附，從而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移¨肝素。此外，Berry等報(bào)道游離肝素分子在細(xì)胞內(nèi)能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法發(fā)揮作用，從而直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。然而，由于其特殊的硫酸化圖案，肝素自身很難直接通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。因此，實(shí)現(xiàn)游離肝素向細(xì)胞內(nèi)的有效傳遞將有助于其更好地發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)促凋亡的作用，從而拓寬肝素在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用。肝素的生物學(xué)活性有賴于其負(fù)載高密度負(fù)電荷的糖鏈結(jié)構(gòu)，亦是其難以直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要原因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物的制備方法。

一種魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

（1）取魚精蛋白、DOCA、鈉鹽、四唑藍(lán)備用；

（2）將DOCA肝素3．54肝素g、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)2．40肝素g和Ⅳ．羥基琥珀酰亞胺(NHS)1．48肝素g混合；

（3）加入THF肝素30肝素ml制得懸濁液，于室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)12肝素h，過(guò)濾去除產(chǎn)生的白色沉淀(二環(huán)己基脲)，濾液經(jīng)過(guò)量正丁烷洗滌，沉淀，得羧基被活化的DOCA，即琥珀酰化去氧膽酸；

（4）將魚精蛋白5肝素g溶于含8肝素mol／L的硼酸緩沖液中，加入步驟（2）所述琥珀酰化去氧膽酸，以及摩爾量分別為魚精蛋白的5-15倍的THF溶液30ml；

（5）在25℃反應(yīng)1．5肝素h，反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚洗滌、超純水透析，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到白色粉末狀固體，即為魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物。

優(yōu)選地，所述硼酸緩沖液pH9，加入量是70肝素ml。

優(yōu)選地，所述THF溶液的摩爾量為魚精蛋白的10倍。

本發(fā)明所述方法制備的魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物，經(jīng)過(guò)疏水修飾后，可有效增強(qiáng)載體與細(xì)胞膜的融合能力，從而提高載體攜帶DNA或藥物進(jìn)入細(xì)胞的效率，本發(fā)明所述方法步驟簡(jiǎn)單，可工業(yè)化生產(chǎn)，實(shí)用性強(qiáng)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1。

一種魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

（4）取魚精蛋白、DOCA、鈉鹽、四唑藍(lán)備用；

（5）將DOCA肝素3．54肝素g、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)2．40肝素g和Ⅳ．羥基琥珀酰亞胺(NHS)1．48肝素g混合；

（6）加入THF肝素30肝素ml制得懸濁液，于室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)12肝素h，過(guò)濾去除產(chǎn)生的白色沉淀(二環(huán)己基脲)，濾液經(jīng)過(guò)量正丁烷洗滌，沉淀，得羧基被活化的DOCA，即琥珀酰化去氧膽酸；

（4）將魚精蛋白5肝素g溶于含8肝素mol／L的硼酸緩沖液中，加入步驟（2）所述琥珀?；パ跄懰?，以及摩爾量分別為魚精蛋白的5-15倍的THF溶液30ml；

（5）在25℃反應(yīng)1．5肝素h，反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚洗滌、超純水透析，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到白色粉末狀固體，即為魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物。

實(shí)施例2。

一種魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

（1）取魚精蛋白、DOCA、鈉鹽、四唑藍(lán)備用；

（2）將DOCA肝素3．54肝素g、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)2．40肝素g和Ⅳ．羥基琥珀酰亞胺(NHS)1．48肝素g混合；

（3）加入THF肝素30肝素ml制得懸濁液，于室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)12肝素h，過(guò)濾去除產(chǎn)生的白色沉淀(二環(huán)己基脲)，濾液經(jīng)過(guò)量正丁烷洗滌，沉淀，得羧基被活化的DOCA，即琥珀?；パ跄懰?；

（4）將魚精蛋白5肝素g溶于含8肝素mol／L的硼酸緩沖液中，加入步驟（2）所述琥珀酰化去氧膽酸，以及摩爾量分別為魚精蛋白的5-15倍的THF溶液30ml；

（5）在25℃反應(yīng)1．5肝素h，反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚洗滌、超純水透析，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到白色粉末狀固體，即為魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物。

本實(shí)施例所述硼酸緩沖液pH9，加入量是70肝素ml。

實(shí)施例3。

一種魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

（4）取魚精蛋白、DOCA、鈉鹽、四唑藍(lán)備用；

（5）將DOCA肝素3．54肝素g、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)2．40肝素g和Ⅳ．羥基琥珀酰亞胺(NHS)1．48肝素g混合；

（6）加入THF肝素30肝素ml制得懸濁液，于室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)12肝素h，過(guò)濾去除產(chǎn)生的白色沉淀(二環(huán)己基脲)，濾液經(jīng)過(guò)量正丁烷洗滌，沉淀，得羧基被活化的DOCA，即琥珀?；パ跄懰?；

（4）將魚精蛋白5肝素g溶于含8肝素mol／L的硼酸緩沖液中，加入步驟（2）所述琥珀?；パ跄懰幔约澳柫糠謩e為魚精蛋白的5-15倍的THF溶液30ml；

（5）在25℃反應(yīng)1．5肝素h，反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚洗滌、超純水透析，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到白色粉末狀固體，即為魚精蛋白-去氧膽酸納米復(fù)合物。

本實(shí)施例所述硼酸緩沖液pH9，加入量是70肝素ml；所述THF溶液的摩爾量為魚精蛋白的10倍。