本發(fā)明涉及一種肝細(xì)胞癌的藥物及胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肝細(xì)胞癌(hcc)是第五大最常見的癌癥和全球癌癥死亡的第三大原因。流行病學(xué)研究表明，ii型糖尿病(t2d)與hcc的風(fēng)險(xiǎn)高3倍相關(guān)。重要的是，多種t2d相關(guān)的病理狀況，如高血糖，已被確定為hcc的重要誘導(dǎo)和預(yù)后因素。在發(fā)達(dá)國(guó)家，近10％的成年人患有糖尿病，且患病率每年都在增加。此外，69.5％的t2d患者具有非酒精性脂肪肝病(nafld)，其使患者易于形成hcc。nafld具有從脂肪變性，脂肪性肝炎(nash)，纖維化到肝硬化的廣泛的病理學(xué)譜。臨床研究報(bào)道約27％的nash相關(guān)性肝硬化進(jìn)一步發(fā)展為hcc。隨著nafld和糖尿病發(fā)病率在世界各地的穩(wěn)定增加，預(yù)計(jì)大量的人口將發(fā)生hcc的風(fēng)險(xiǎn)更高。

胰高血糖素樣肽-1(glp-1)是可通過(guò)二肽基肽酶-4(dpp-4)降解的腸降血糖素激素，可以改善t2d患者的系統(tǒng)性血糖控制。長(zhǎng)效glp-1r激動(dòng)劑艾塞那肽(ex-4)和dpp-4抑制劑已經(jīng)用于通過(guò)激活glp-1r信號(hào)傳導(dǎo)維持血糖穩(wěn)態(tài)。胰高血糖素樣肽-1受體(glp-1r)受多種t2d相關(guān)病理狀況調(diào)節(jié)，并且在許多組織如胰腺，結(jié)腸，乳腺，肝和肺中廣泛表達(dá)。以前的研究表明nash患者具有低肝臟水平的glp-1r，表明受損的glp-1r信號(hào)傳導(dǎo)。glp-1r的活化顯示降低肝脂質(zhì)含量，降低丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)水平，減少氧化應(yīng)激，從而減輕nafld。

隨著glp-1r基于藥物在臨床中的廣泛使用，對(duì)glp-1r活化和患者中不同癌癥的關(guān)聯(lián)的爭(zhēng)論越來(lái)越多。例如，據(jù)報(bào)道，glp-1r激動(dòng)劑和dpp-4抑制劑在β細(xì)胞中發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，并刺激胰腺炎，胰腺癌和甲狀腺癌。相反，其他研究顯示與glp-1r活化相關(guān)的胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有顯著升高，并且ex-4顯示抑制乳腺，前列腺和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。盡管糖尿病和hcc的顯著關(guān)聯(lián)，glp-1r活化在肝癌發(fā)生中的結(jié)果仍然未確定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種肝細(xì)胞癌的藥物及胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預(yù)防或治療肝細(xì)胞癌的藥物中的應(yīng)用、在制造用于肝移植手術(shù)后肝功能恢復(fù)的藥物中的應(yīng)用以及在制造用于預(yù)防肝移植手術(shù)后肝癌再發(fā)的藥物中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種治療肝細(xì)胞癌的藥物，該藥物包括胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑。

進(jìn)一步的，所述的胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑選自利拉魯肽、艾塞那肽中的任意一種或幾種。

進(jìn)一步的，所述的二肽基肽酶4抑制劑選自西格列汀、利拉利汀、沙格列汀和維格列汀的任意一種或幾種。

進(jìn)一步的，還包括藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預(yù)防或治療肝細(xì)胞癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于肝移植手術(shù)后肝功能恢復(fù)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預(yù)防肝移植手術(shù)后肝癌再發(fā)的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，該藥物被腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。

本發(fā)明的有益效果在于：胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑通過(guò)組織特異性方式施加差異效應(yīng)，抑制癌細(xì)胞增殖并增加癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)使肝細(xì)胞被保護(hù)免于凋亡，從而治療減弱肥胖依賴性和非依賴性肝癌發(fā)生。

附圖說(shuō)明

圖1表示ex-4處理在體內(nèi)抑制den誘導(dǎo)的hcc形成。

圖2表示ex-4處理降低腫瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)凋亡。

圖3表示ex-4刺激hcc中的glp-1r信號(hào)傳導(dǎo)。

圖4表示ex-4使來(lái)自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的腫瘤中的egfr-stat3信號(hào)傳導(dǎo)失活。

圖5表示ex-4抑制hepg2和huh7細(xì)胞生長(zhǎng)及其伴隨的egfr信號(hào)傳導(dǎo)。

圖6表示pka和egfr活性介導(dǎo)ex-4對(duì)stat3活化和肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。

具體實(shí)施方式

為詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖予以說(shuō)明。

腸促胰素治療藥物的以下兩類中：(1)胰高血糖素樣肽-1(glp-1)受體激動(dòng)劑，包括利拉魯肽(liraglutide)、艾塞那肽每日2次制劑和艾塞那肽每周1次制劑；(2)二肽基肽酶4(dpp-4)抑制劑，包括西格列汀(sitagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)和維格列汀(vildagliptin)，dpp-4抑制劑可限制內(nèi)源性glp-1的降解。這2類藥物具有某些共性，如葡萄糖依賴性刺激胰島素分泌，低血糖發(fā)生率低。

本發(fā)明提供一種治療肝細(xì)胞癌的藥物，該藥物包括胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑。

進(jìn)一步的，所述的胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑選自利拉魯肽、艾塞那肽中的任意一種或幾種。

進(jìn)一步的，所述的二肽基肽酶4抑制劑選自西格列汀、利拉利汀、沙格列汀和維格列汀的任意一種或幾種。

進(jìn)一步的，還包括藥學(xué)上可接受的載體。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預(yù)防或治療肝細(xì)胞癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于肝移植手術(shù)后肝功能恢復(fù)的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑在制造用于預(yù)防肝移植手術(shù)后肝癌再發(fā)的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，該藥物被腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。

以下實(shí)施例通過(guò)研究ex-4在消耗低脂低碳水化合物(lflc)或高脂高碳水化合物(hfhc)飲食的二乙基亞硝胺(den)處理的小鼠中的效果，證明了腸促胰素治療藥物中的胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑和/或二肽基肽酶4抑制劑可治療肝細(xì)胞癌。

實(shí)施例

為了檢查hcc中g(shù)lp-1r活化的影響，我們?cè)谛∈笾薪⒘薶cc模型，其中施用den用于hcc誘導(dǎo)，并且飼喂低脂和低碳水化合物(lflc)或高脂和高碳水化合物(hfhc)飲食用于nash發(fā)展，旨在模擬從nash到hcc的病理進(jìn)展。hfhc和den治療的小鼠具有臨床相關(guān)性，因?yàn)樗玫牟±頎顩r高度類似于人類糖尿病和hcc。在這里我們發(fā)現(xiàn)，ex-4治療的glp-1r激活顯著降低lflc和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中的hcc多重性。特別感興趣的是，ex-4以組織特異性方式施加差異效應(yīng)，其由多種信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)介導(dǎo)。這些信息定義了glp-1r激活在保護(hù)肝臟免于發(fā)展hcc中的關(guān)鍵作用，并且提供了基于這種腫瘤抑制效應(yīng)的新的機(jī)械學(xué)見解。

將雄性c57bl/6n小鼠在22～24℃下在12小時(shí)光-暗循環(huán)下飼養(yǎng)。在出生后第14天的小鼠腹膜內(nèi)注射單劑量的den(5mg/kg體重)。在10周齡時(shí)，將小鼠分成2組，并喂食lflc或hfhc飲食。hfhc飲食由高脂肪飲食(研究飲食d12331,58％kcal來(lái)自脂肪)和高碳水化合物飲料(42g/l碳水化合物，55％果糖和45％蔗糖)組成，其被證明誘導(dǎo)nash。為了激活glp-1r信號(hào)傳導(dǎo)，以10nmol/kg體重的劑量或等量體積的(磷酸鹽緩沖液)pbs作為對(duì)照從3個(gè)月齡到處死每日腹膜內(nèi)注射ex-4(wako)。為了監(jiān)測(cè)ex-4的抗糖尿病作用，如前所述進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(ogtt)。在處死前，將小鼠用氯胺酮和xyline安樂(lè)死，并通過(guò)心臟穿刺放血。分離腫瘤，計(jì)數(shù)并稱重。將解剖組織在液氮中快速冷凍或固定在福爾馬林中用于組織學(xué)分析。

免疫組化染色增殖和凋亡

肝切片中的增殖細(xì)胞如先前所述通過(guò)ki67抗體(labvision)染色。通過(guò)tunel染色(roche)分析凋亡。使用光學(xué)顯微鏡(zeiss)獲得圖像。在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)imagej計(jì)數(shù)在至少四個(gè)獨(dú)立視野中的陽(yáng)性染色的細(xì)胞，并計(jì)算增殖或凋亡指數(shù)作為針對(duì)總肝細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞(每組n＝5)。

實(shí)時(shí)pcr和western印跡

從肝組織提取總rna并轉(zhuǎn)錄成cdna。使用sybrgreenmix(takara)，使用特異性引物制備實(shí)時(shí)pcr。在appliedbiosystems7900htfastreal-timepcrsystem(appliedbiosystems)上進(jìn)行pcr。在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的ripa裂解緩沖液中提取蛋白質(zhì)。裂解的蛋白質(zhì)變性，分離并轉(zhuǎn)移到pvdf膜。用于檢測(cè)的抗體在補(bǔ)充方法中列出。通過(guò)imagej定量條帶的強(qiáng)度。

體外細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定和分子信號(hào)分析

hepg2和huh7細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs，青霉素和鏈霉素的高葡萄糖dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2h-四唑溴化物(mtt)測(cè)定(sigma)測(cè)定具有指定治療的活細(xì)胞數(shù)。對(duì)于分子實(shí)驗(yàn)，將人egfr基因克隆并插入cmv啟動(dòng)子下游的表達(dá)質(zhì)粒pcdna3.1(+)中。使用(polyplus轉(zhuǎn)染)通過(guò)egfr質(zhì)粒的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)體外egfr過(guò)表達(dá)。h89(calbiochem)用于在體外研究中抑制pka活性。通過(guò)如手冊(cè)中所述的單獨(dú)的商業(yè)試劑盒(arbor測(cè)定)測(cè)量camp含量或pka活性。

統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(sem)。組之間的差異通過(guò)anova，隨后是學(xué)生t檢驗(yàn)來(lái)確定。與p<0.05的比較被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。

結(jié)果

(1)ex-4治療減弱肥胖依賴性和非依賴性肝癌發(fā)生

鑒于ex-4在減輕糖尿病癥狀以及t2d和hcc形成的密切關(guān)聯(lián)方面的已證明的功效，我們假設(shè)ex-4可能對(duì)肥胖癥誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生發(fā)揮保護(hù)作用。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們檢查了在用hfhc飲食喂養(yǎng)的den注射的c57bl/6n小鼠中ex-4的體內(nèi)功能(圖1a)。這種動(dòng)物模型可以模擬人類中糖尿病相關(guān)hcc的自然發(fā)展，因?yàn)閐en是肝癌的一種已經(jīng)確定的致癌物，并且hfhc飲食先前已顯示在小鼠中誘導(dǎo)脂肪性肝炎和纖維化。同時(shí)，另一組注射den的小鼠被給予lflc飲食用于肥胖和瘦模型之間的比較。

我們首先評(píng)估不同組的小鼠使用ogtt的飲食相關(guān)血糖反應(yīng)。簡(jiǎn)言之，記錄刺激后血糖濃度的時(shí)間依賴性變化(圖1b)，并且將各個(gè)測(cè)量曲線下的面積用于直接比較(圖1c)。在pbs治療的對(duì)照中，hfhc喂養(yǎng)的小鼠的血糖水平可以高于lflc喂養(yǎng)的小鼠的血糖水平。雖然ex-4不干擾lflc喂養(yǎng)的小鼠中的葡萄糖體內(nèi)平衡，但它顯著降低了喂食hfhc的小鼠中的血糖水平(圖1b-c，p<0.01)。此外，與lflc喂養(yǎng)組相比，ex-4還顯著降低了hfhc喂養(yǎng)的小鼠中血清甘油三酯，膽固醇和空腹胰島素的水平(圖1d，p<0.05)。在35周齡時(shí)，處死所有小鼠并檢查體重和肝重量。與lflc飲食相比，hfhc飲食顯著增加pbs處理的小鼠的身體和肝臟質(zhì)量(圖1e，白色條，p<0.001和p<0.05)。值得注意的是，這種hfhc依賴性體重增加和肝腫大基本上被ex-4處理所消除(圖1e，黑色柱，p<0.001和p<0.05)。另外，ex-4處理顯著降低了hfhc引起的肝臟中的甘油三脂和脂肪酸含量(圖1f，黑色柱，p<0.001和p<0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明了ex-4抑制hfhc誘導(dǎo)的肥胖的有效性，這與ex-4在糖尿病患者中的輔助作用一致。

我們接下來(lái)檢查用于den誘導(dǎo)的hcc的解剖的小鼠肝臟(圖1f)，并且量化單獨(dú)組中的腫瘤多樣性和質(zhì)量(圖1g)。在pbs處理的小鼠中，den的致癌作用被hfhc飲食顯著增強(qiáng)，所得腫瘤數(shù)量和重量分別比lflc飼養(yǎng)小鼠中發(fā)現(xiàn)的腫瘤數(shù)量和重量高3至6倍(圖1g，白色條，p<0.001和p<0.05)。與之形成鮮明對(duì)比的是，在ex-4處理的小鼠中，hfhc飲食僅將hcc豐度增加到有限程度(圖1g，黑色柱)。重要的是，當(dāng)與pbs處理的對(duì)照相比時(shí)，在lflc-和hfhc-喂養(yǎng)的小鼠中，ex-4使hcc多樣性顯著降低高達(dá)78％(圖1f-gp<0.01和p<0.0001)。與這些結(jié)果一致，ex-4還在另一個(gè)den處理的m/db瘦小鼠模型中將hcc發(fā)病率限制45％，在hbx轉(zhuǎn)基因小鼠模型中將58％限制在其中病毒蛋白hbx可誘導(dǎo)hcc形成的補(bǔ)充圖1)。這種體內(nèi)信息證明了ex-4對(duì)肥胖相關(guān)和不相關(guān)的肝癌發(fā)生的強(qiáng)抑制功能。

(2)ex-4抑制細(xì)胞增殖并增加hcc中的凋亡

為了描述ex-4在hcc中的抗腫瘤發(fā)生作用，我們比較了解剖的小鼠肝臟的非腫瘤和腫瘤組織中生長(zhǎng)和垂死細(xì)胞的比例。通過(guò)染色對(duì)于細(xì)胞增殖的核標(biāo)記物ki67，我們發(fā)現(xiàn)在lflc-和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中，ex-4處理顯著地將增殖的腫瘤細(xì)胞的百分比降低高達(dá)3倍(圖2a，p<0.05和p<0.05)。值得注意的是，ex-4沒(méi)有改變?nèi)魏我粋€(gè)飲食組的非腫瘤組織中的肝細(xì)胞增殖。接下來(lái)，我們使用tunel試劑盒測(cè)量相同組織中的細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果表明，在lflc-和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中，ex-4使凋亡腫瘤細(xì)胞的數(shù)量顯著增加高達(dá)2.7倍(圖2b，p<0.01和p<0.05)。有趣的是，ex-4的作用在非腫瘤組織中也是不同的，其中肝細(xì)胞被保護(hù)免于細(xì)胞凋亡。總之，我們的數(shù)據(jù)表明ex-4通過(guò)限制細(xì)胞增殖和驅(qū)動(dòng)凋亡來(lái)抵消肝癌的發(fā)生。

(3)glp-1r表達(dá)在來(lái)自小鼠hcc模型和人肝癌細(xì)胞的腫瘤中上調(diào)

鑒于ex-4的上述組織特異性功能，我們進(jìn)一步檢查了在相同的小鼠肝樣品中g(shù)lp-1r的非腫瘤和腫瘤表達(dá)，glp-1r是ex-4的體內(nèi)分子靶標(biāo)和功能性介質(zhì)。qrt-pcr分析顯示，在lflc和hfhc喂養(yǎng)的小鼠中，腫瘤組織中的glp-1r轉(zhuǎn)錄物水平比非腫瘤組織中的glp-1r轉(zhuǎn)錄物水平高>2倍(圖3a，p<0.05和p<0.05)，表明在hcc細(xì)胞中對(duì)ex-4治療的更大易感性。值得注意的是，在用lflc或hfhc飲食喂養(yǎng)的ex-4處理的小鼠中，在腫瘤組織中的這種glp-1r誘導(dǎo)不太明顯(圖3a)，顯示glp-1r表達(dá)以及致瘤性在長(zhǎng)期處理實(shí)施例4。此外，我們對(duì)兩個(gè)永生化人正常肝細(xì)胞系(miha和lo2)和六個(gè)人類hcc細(xì)胞系(bel7402，hep3b，hepg2，huh7，plc5和sk-hep1)進(jìn)行了相同的qrt-pcr分析。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照相比，glp-1r在hcc中顯著上調(diào)(圖3b，全部p<0.05)。結(jié)果表明相對(duì)于正常對(duì)應(yīng)物，glp-1r在hcc細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。

先前的研究已經(jīng)證明glp-1r的活化與camp-pka信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。為了確定在hcc中由glp-1r激活產(chǎn)生的分子反應(yīng)，我們測(cè)量了肝組織中的細(xì)胞內(nèi)camp含量和pka活性。由于我們對(duì)肥胖相關(guān)的hcc和來(lái)自lflc喂養(yǎng)的小鼠的腫瘤樣品不足的主要興趣，我們使用來(lái)自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的組織樣品用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示在腫瘤組織中ex-4上調(diào)camp含量26％，pka活性50％(圖3c，p<0.05和p<0.01)，而在非腫瘤組織中未檢測(cè)到顯著變化來(lái)自相同的小鼠(圖3d)。為了證實(shí)這些結(jié)果，我們進(jìn)一步檢查了pka最佳活性所需的pka催化亞基(pka-c)的磷酸化狀態(tài)(27)。如圖所示。3e，ex-4與pbs處理的對(duì)照相比顯著增強(qiáng)了腫瘤中的pka-c磷酸化(p<0.05)。與camp和pka活性結(jié)果(圖3c和d)一致，ex-4對(duì)非腫瘤組織中的pka-c磷酸化沒(méi)有顯著影響(圖3f)。這些實(shí)驗(yàn)證明ex-4，glp-1r，camp和pka在hcc中的陽(yáng)性結(jié)合。

(4)ex-4在體內(nèi)減弱egfr-stat3信號(hào)傳導(dǎo)

鑒于glp-1r信號(hào)傳導(dǎo)的激活，我們接下來(lái)試圖確定肝癌發(fā)生中camp-pka信號(hào)傳導(dǎo)的下游的分子途徑。以前的報(bào)告表明，pka磷酸化絲氨酸殘基的egfr以降低其激酶活性，如通過(guò)減少y1173自磷酸化所示，并導(dǎo)致stat3的去磷酸化。當(dāng)egfr的停靠位點(diǎn)(y1068)被磷酸化時(shí)，egfr可以在y705募集并磷酸化stat3以刺激其下游信號(hào)傳導(dǎo)(30-32)。我們確定相對(duì)于來(lái)自pbs處理的小鼠的非腫瘤，腫瘤中egfr(y1068/1173)以及其靶stat3(y705)的磷酸化水平顯著增強(qiáng)(圖4a，p<0.05，p<0.05和p<0.05)，表明hcc中egfr-stat3通路的活化。引人注目的是，與pbs處理的對(duì)照相比，ex-4顯著減少了egfr(y1068/1173)磷酸化，并且消除了腫瘤中的stat3(y705)磷酸化(圖4b，p<0.01，p<0.01和p<0.05)與camp-pka的ex-4依賴性誘導(dǎo)(圖3c和e)并行。重要的是，在相同的腫瘤組織中，包括c-myc，細(xì)胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-xl的stat3-調(diào)節(jié)的基因的蛋白和轉(zhuǎn)錄水平一致地被ex-4抑制(圖4c，p<0.05)，說(shuō)明ex-4在轉(zhuǎn)錄水平的多種功能效應(yīng)。除了egfr-stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，我們還檢查了ex-4在由erk1/2，mtor，β-連環(huán)蛋白和炎癥細(xì)胞因子tnf-α和il-6調(diào)節(jié)的自噬和其它致癌途徑中的潛在作用。然而，在腫瘤樣品或人肝癌hepg2細(xì)胞中未檢測(cè)到顯著的ex-4依賴性變化。共同地，這些體內(nèi)數(shù)據(jù)表明ex-4關(guān)閉egfr-stat3調(diào)節(jié)的級(jí)聯(lián)以抑制hcc形成。

(5)ex-4以劑量和時(shí)間依賴性方式滅活egfr/stat3

為了研究hcc中ex-4的時(shí)間作用和有效濃度，我們?cè)趦煞N肝癌細(xì)胞模型，hepg2和huh7中評(píng)估了ex-4的體外功能，其在我們的篩選中表達(dá)最高水平的glp-1r(圖2)。使用mtt測(cè)定，我們發(fā)現(xiàn)ex-4顯著降低hepg2和huh7細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，并且生長(zhǎng)減少的程度與藥物劑量(圖5a)和治療時(shí)間(圖5b)正相關(guān)。然后我們檢查ex-4是否影響這兩種hcc細(xì)胞系中的egfr(y1173)磷酸化及其靶stat3(y705)磷酸化。類似于mtt結(jié)果(圖5a-b)，egfr(y1173)和stat3(y705)的酪氨酸磷酸化水平以劑量和時(shí)間依賴性方式被ex-4顯著下調(diào)(圖5c-d)。這些體外結(jié)果與我們的體內(nèi)證據(jù)高度一致(圖2和4)，證實(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯和egfr/stat3失活的相關(guān)性。

(6)pka和egfr信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)ex-4的腫瘤抑制作用

為了評(píng)估camp/pka在ex-4的抗腫瘤發(fā)生作用中的強(qiáng)制作用，我們用pka特異性抑制劑h89，與或不與ex-4一起處理hepg2和huh7細(xì)胞，然后通過(guò)mtt測(cè)定。在dmso處理的hepg2細(xì)胞中，ex-4的應(yīng)用減少了egfr(y1173)和stat3(y705)的酪氨酸磷酸化(圖6a，p<0.05)，這在期望的范圍內(nèi)。相比之下，在h89處理的hepg2細(xì)胞中，磷酸化egfr(y1173)和stat3(y705)的基礎(chǔ)水平顯著增加，并且對(duì)ex-4處理變得不敏感(圖6a，p<0.05)。這種對(duì)egfr和stat3的h89依賴性作用也在huh7細(xì)胞中保守(圖6b，p<0.05)。在功能重要性方面，在hepg2和huh7細(xì)胞中，h89顯著降低了細(xì)胞生長(zhǎng)的ex-4-依賴性抑制(圖6c)。這些結(jié)果清楚地證明了pka在介導(dǎo)ex-4功能中的上游和關(guān)鍵作用。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ex-4作用中egfr/stat3信號(hào)傳導(dǎo)的必要性，我們?cè)谑褂没虿皇褂胑x-4處理的情況下在hepg2和huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)egfr，然后通過(guò)相同的mtt測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)。在空載體(pcdna)轉(zhuǎn)染的hepg2細(xì)胞中，ex-4以預(yù)期的方式抑制egfr(y1173)和stat3(y705)的酪氨酸磷酸化(圖6d，p<0.05)。相反，在egfr轉(zhuǎn)染的hepg2細(xì)胞中，無(wú)論ex-4處理如何，egfr(y1173)和stat3(y705)的磷酸化均適度增加(圖6d，p<0.05)。在huh7細(xì)胞中也獲得了一致的結(jié)果(圖6e，p<0.05)。egfr的這種異位過(guò)表達(dá)隨后減少了ex-4在hepg2和huh7細(xì)胞中的抗增殖作用(圖6f)，證實(shí)了egfr在ex-4效應(yīng)中的強(qiáng)制性作用。

幾乎沒(méi)有實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄glp-1r活化和癌癥的關(guān)系，并且結(jié)果主要來(lái)自裸鼠中的體外研究或異種移植模型(19-22)。在這項(xiàng)研究中，我們調(diào)查通過(guò)激動(dòng)劑ex-4施用在致癌誘導(dǎo)和hfhc飼養(yǎng)的小鼠hcc模型中的glp-1r活化的影響，其概括了肥胖和人類hcc的大多數(shù)臨床特征)。在這里我們第一次報(bào)告ex-4治療可以有效抑制hcc發(fā)展(圖1)，其通過(guò)抑制細(xì)胞增殖并在腫瘤而非非腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)(圖2)。機(jī)制上，ex-4治療靶向glp-1r上調(diào)camp依賴性pka活性(圖3)，這繼而導(dǎo)致egfr和stat3的失活，并最終導(dǎo)致多種效應(yīng)基因的下調(diào)，包括c-myc，細(xì)胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-x1(圖4)。這種體內(nèi)模型來(lái)源的調(diào)節(jié)機(jī)制(圖6g)是固體，因?yàn)樵趦煞N人肝癌細(xì)胞模型中分別驗(yàn)證了在ex-4處理后pka和egfr的不可或缺的作用和功能效應(yīng)(圖5-6)?？傊?，我們的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了ex-4在肥胖相關(guān)的hcc中的有效抑制作用，說(shuō)明了基于腸降血糖素的治療作為治療糖尿病和hcc的新的藥理學(xué)方法的潛在臨床應(yīng)用。

由于t2d成為多種癌癥(包括hcc，前列腺癌和胰腺癌)的重要危險(xiǎn)因素，更多的研究集中在抗糖尿病藥物的腫瘤調(diào)節(jié)功能。例如，二甲雙胍(t2d治療的一線藥物)據(jù)報(bào)道降低hcc風(fēng)險(xiǎn)，并發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮可降低t2d患者的肝癌和結(jié)腸直腸癌發(fā)病率。在這里，我們集中于t2d相關(guān)的hcc，并且顯示ex-4在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出抗腫瘤發(fā)生作用(圖1-2,5a-b)。盡管已知ex-4可改善糖尿病并發(fā)癥，但應(yīng)注意，ex-4的腫瘤抑制效應(yīng)不僅僅依賴于致腫瘤發(fā)生的代謝狀況如高血糖和肝脂肪變性的抑制。這一觀點(diǎn)得到我們的體內(nèi)數(shù)據(jù)的支持，ex-4治療也減弱了lflc喂養(yǎng)的小鼠中的腫瘤發(fā)展，而沒(méi)有顯著改變它們的葡萄糖耐量(圖1b-c)。此外，我們還確定ex-4在den誘導(dǎo)的hcc(m/db瘦小鼠)和hbx誘導(dǎo)的hcc(hbx-轉(zhuǎn)基因小鼠)中的腫瘤抑制效應(yīng)(補(bǔ)充圖1)。此外，在沒(méi)有另外的脂質(zhì)補(bǔ)充物的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hepg2和huh7細(xì)胞也響應(yīng)于ex-4，并顯示顯著降低的增殖(圖5a-b)。這些數(shù)據(jù)顯示ex-4可以在高血糖肥胖和正常血糖貧乏條件下抑制肝癌發(fā)生。

hcc形成是細(xì)胞增殖和凋亡失調(diào)的結(jié)果。在這里我們確定ex-4以組織特異性方式影響這兩種細(xì)胞過(guò)程。我們的體內(nèi)數(shù)據(jù)清楚地證明了ex-4在腫瘤中而不在非腫瘤組織中的抗增殖和促凋亡作用(圖2)。我們假設(shè)ex-4的這種腫瘤特異性功能歸因于glp-1r在不同組織中的差異表達(dá)。基于以前的研究，glp-1r在人體中廣泛表達(dá)，但其在肝中的表達(dá)仍在爭(zhēng)論中。enref_38我們進(jìn)行qrt-pcr以檢查glp-1r的mrna表達(dá)，在肝癌組織和細(xì)胞系中g(shù)lp-1r的高表達(dá)(圖3a-b)。與我們的假設(shè)一致，與glp-1r缺陷型bel-7402和plc5細(xì)胞(數(shù)據(jù))相比，ex-4的抗腫瘤作用在glp-1r豐富的hepg2和huh7細(xì)胞中最突出(圖5-6)未示出)。雖然腫瘤樣品具有更高的glp-1r表達(dá)，但是應(yīng)該注意到，在沒(méi)有ex-4處理的情況下，glp-1r相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)在腫瘤中沒(méi)有顯著活化，如通過(guò)非腫瘤和腫瘤組織(圖3c-d)。這些集體的結(jié)果表明ex-4的抗腫瘤活性由glp-1r介導(dǎo)，其可以作為預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)ex-4在糖尿病hcc患者中的反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

以前的研究報(bào)道了camp和pka在不同癌癥中的多效性作用。盡管細(xì)胞內(nèi)camp含量顯示抑制hcc發(fā)展(38)，但是pkc在hcc中的功能仍然是有爭(zhēng)議的。據(jù)報(bào)道，pka的上調(diào)可抑制hcc形成(39)。然而，其他研究顯示pka的抑制減少了前列腺素e2誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的粘附和遷移率。pka在癌癥發(fā)展中的不同作用可能是由于在亞細(xì)胞微區(qū)中分離的pka的不均勻活化通過(guò)pka錨定蛋白。在這項(xiàng)研究中，我們確定了pka活性的ex-4依賴性上調(diào)與其上游因子camp的誘導(dǎo)(圖3c)，并且這兩種事件與體內(nèi)腫瘤多樣性的減少相關(guān)(圖3，1f-g)。特別重要的是，對(duì)camp和pka活性的ex-4的刺激限于腫瘤而不是非腫瘤組織(圖3c-f)，證明了ex-4的腫瘤特異性效應(yīng)。這個(gè)信息與先前報(bào)道的camp在hcc中的抗腫瘤發(fā)生作用一致，并且支持pka保護(hù)肝臟抵抗hcc形成的觀念。

egfr被發(fā)現(xiàn)是突變體組成型活性致癌v-erbb酪氨酸激酶的原癌基因。臨床研究先前已證明egfr在40％至70％的hcc患者中的上調(diào)，并且egfr抑制劑顯示在人肝癌細(xì)胞和大鼠肝癌發(fā)生模型中發(fā)揮強(qiáng)拮抗作用。我們的研究提供了體內(nèi)和體外證據(jù)，egfr-stat3失活有助于ex-4的抗腫瘤作用(圖4-6)?；虮磉_(dá)分析顯示ex-4處理的小鼠具有多個(gè)stat3調(diào)節(jié)的基因(例如c-myc，細(xì)胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-xl)的較低表達(dá)。這些基因與肝癌預(yù)后差，臨床病理特征和存活率高度相關(guān)。egfr-stat3-bcl-xl軸的功能重要性已經(jīng)通過(guò)在頸部和頭部癌癥的鱗狀細(xì)胞癌中聯(lián)合靶向這三種分子的增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)來(lái)證明。這些基因的抑制與ex-4的抗腫瘤效應(yīng)和由ex-4調(diào)節(jié)的stat3信號(hào)傳導(dǎo)證實(shí)。

總之，我們已經(jīng)確定ex-4在肥胖依賴性和非依賴性hcc中的保護(hù)作用，其中ex-4調(diào)節(jié)camp-pka-egfr-stat3分子軸以組織特異性方式抵消肝癌發(fā)生。鑒于這些重要的發(fā)現(xiàn)和ex-4在糖尿病患者中的良好確立的益處，未來(lái)的研究有必要驗(yàn)證ex-4治療與降低的hcc風(fēng)險(xiǎn)在不同臨床隊(duì)列中的關(guān)聯(lián)。此外，精益小鼠hcc模型中ex-4的分子表征是必要的，以描繪glp-1r激活在無(wú)糖尿病hcc中的抗腫瘤機(jī)制，這將有助于確定glp-1r激動(dòng)劑作為新型hcc-靶向藥物。

以下為上述實(shí)施例的附圖說(shuō)明。

圖1-ex-4處理在體內(nèi)抑制den誘導(dǎo)的hcc形成。(a)實(shí)驗(yàn)方案。(b)ex-4改善了用hfhc飲食喂養(yǎng)的小鼠的血糖控制，如ogtt結(jié)果所示。(c)計(jì)算ogtt曲線下面積(auc)，并以平均值±sem表示。(d)ex-4處理改善了血清甘油三酯，膽固醇和空腹胰島素水平。(e)ex-4減弱hfhc誘導(dǎo)的體重增加和肝腫大。(f)代表性圖片顯示在ex-4處理的小鼠的肝臟中較少的腫瘤結(jié)節(jié)。(g)在具有l(wèi)flc或hfhc飲食的小鼠中，ex-4減少了腫瘤數(shù)目和總腫瘤重量。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。(b-c)，每組n＝7。(d-g)n＝10/組。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

圖2-ex-4處理降低腫瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)凋亡。(a)ki67染色和(b)tunel染色在具有不同飲食和處理的小鼠的非腫瘤(nt)和腫瘤(t)切片上進(jìn)行。陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比表示為平均值±sem。*p<0.05；*p<0.01。

圖3-ex-4刺激hcc中的glp-1r信號(hào)傳導(dǎo)。(a)與非腫瘤(nt)樣品相比，腫瘤(t)樣品中g(shù)lp-1r表達(dá)增強(qiáng)。(b)2個(gè)永生化肝細(xì)胞(白色柱)和6個(gè)肝癌細(xì)胞系(黑色柱)中的glp-1rmrna水平。通過(guò)lo2和個(gè)體hcc細(xì)胞系之間的比較計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。(c-d)ex-4僅在(c)腫瘤而非(d)非腫瘤中激活c-amp和pka信號(hào)傳導(dǎo)。結(jié)果表示為camp含量或pka活性對(duì)蛋白質(zhì)量。(e)腫瘤(t)和(f)非腫瘤(nt)裂解物中不同的(e-f)ex-4調(diào)節(jié)的pka催化亞基(pka-c)。代表性印跡顯示在左圖中，并且?guī)?qiáng)度定量表示為在右圖中的磷酸化對(duì)總蛋白(p/t)比。數(shù)據(jù)以平均值±sem表示。(a)每組n＝10。(b)在每個(gè)hcc細(xì)胞系中一式三份。(c-f)n＝4或5每組。*p<0.05，**p<0.01。

圖4-ex-4使來(lái)自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的腫瘤中的egfr-stat3信號(hào)傳導(dǎo)失活。(a)與非腫瘤組織相比，腫瘤中egfr-stat3信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)。左圖中顯示了來(lái)自hfhc喂養(yǎng)的小鼠的配對(duì)的非腫瘤(nt)和腫瘤(t)樣品中的egfr(y1173，y1068)和stat3(y705)磷酸化的代表性蛋白質(zhì)印跡，并且?guī)?qiáng)度定量表示為磷酸化總蛋白(p/t)比率。(b)ex-4降低y1173和y1068處的egfr磷酸化，以及腫瘤裂解物中y705處的stat3磷酸化。(c)在腫瘤樣品(pbs組中n＝10；ex-4組中n＝7)中，stat3靶向基因的蛋白和mrna表達(dá)水平被ex-4抑制，數(shù)據(jù)顯示為平均值±sem。*p<0.05；**p<0.01。

圖5-ex-4治療停止hepg2和huh7細(xì)胞生長(zhǎng)伴隨egfr信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。(a-b)ex-4處理以mtt測(cè)定顯示的(a)劑量和(b)時(shí)間依賴性方式降低hepg2或huh7細(xì)胞數(shù)目。(c)劑量-和(d)時(shí)間依賴性ex-4處理后，(c-d)egfr(y1173)和stat3(y705)磷酸化被抑制。定量條帶強(qiáng)度，相對(duì)于總蛋白的水平標(biāo)準(zhǔn)化，并且表示為與空白或時(shí)間零組相比的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為來(lái)自三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±sem。*p<0.05；**p<0.01。

圖6-pka和egfr活性介導(dǎo)ex-4對(duì)stat3活化和肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。(a-b)通過(guò)h89處理的pka的失活減弱了hepg2和huh7細(xì)胞中egfr(y1173)和stat3(y705)磷酸化的ex-4-依賴性抑制。(c)通過(guò)h89處理減弱ex-4處理的活細(xì)胞減少。將結(jié)果計(jì)算為與dmso處理的細(xì)胞相比的細(xì)胞生長(zhǎng)的百分比，并且表示為來(lái)自三個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)的平均值±sem。(d-e)在hepg2和huh7細(xì)胞中egfr過(guò)表達(dá)消除了ex-4對(duì)stat3磷酸化的抑制。(f)ex-4處理的活細(xì)胞減少在egfr過(guò)表達(dá)的hepg2和huh7細(xì)胞中減弱。(g)描述了ex-4在肝臟中的抗腫瘤發(fā)生作用的示意圖。*p<0.05；**p<0.01。

綜上所述，本發(fā)明的有益效果在于：施用ex-4在瘦和肥胖den處理的小鼠中顯著降低hcc多樣性，其中抑制的增殖和誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡被限制于腫瘤細(xì)胞。ex-4的抗腫瘤發(fā)生作用與glp-1r的高表達(dá)和camp和pka的活化有關(guān)。重要的是，ex-4也下調(diào)egfr和stat3，其位于camp-pka信號(hào)傳導(dǎo)的下游，導(dǎo)致包括c-myc，細(xì)胞周期蛋白d1，存活蛋白，bcl-2和bcl-x1的多個(gè)stat3靶向基因的抑制。ex-4的生長(zhǎng)抑制作用在glp-1r豐富的肝癌細(xì)胞系hepg2和huh7中一致，其中pka和egfr兩者在介導(dǎo)ex-4功能中發(fā)揮必要的作用?？傊?，ex-4通過(guò)camp-pka-egfr-stat3信號(hào)傳導(dǎo)引起針對(duì)肥胖依賴性和非依賴性hcc的保護(hù)功能，表明其作為減少糖尿病患者中的hcc風(fēng)險(xiǎn)的新方法的施用。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書內(nèi)容所作的等同變換，或直接或間接運(yùn)用在相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。