本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水包油型疫苗佐劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

疫苗是具有免疫原性又不至于導(dǎo)致機(jī)體患病的預(yù)防性生物制品。疫苗的抗原物質(zhì)多取自致病微生物的滅活產(chǎn)物或減毒產(chǎn)物，滅活抗原單獨(dú)免疫動(dòng)物時(shí)，不足以產(chǎn)生免疫原性，特別是免疫原性低、分子量小的抗原。因此需要用不同種類的佐劑來增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答。

佐劑又稱非特異性免疫增強(qiáng)劑，本身不具抗原性，是一類先于抗原或與抗原同時(shí)作用，能非特異性地改變或增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型。免疫佐劑的主要生物作用包括以下幾個(gè)方面：抗原物質(zhì)混合佐劑注入機(jī)體后，改變了抗原的物理性狀，可使抗原物質(zhì)緩慢地釋放，延長了抗原的作用時(shí)間；佐劑吸附了抗原后，增加了抗原的表面積，使抗原易于被抗原稱帝細(xì)胞吞噬；佐劑能刺激抗原呈遞細(xì)胞對抗原的處理；佐劑可促進(jìn)淋巴細(xì)胞之間的接觸，增強(qiáng)輔助t細(xì)胞的作用；可刺激致敏淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。理想的免疫佐劑應(yīng)該能滿足以下條件：在有效劑量內(nèi)無毒或毒性極小；能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)大的體液免疫和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答；具有持久的免疫力；不誘導(dǎo)自身免疫；無致突變、致癌、致畸形作用等。

現(xiàn)有技術(shù)中，用于動(dòng)物疫苗的佐劑種類繁多，但仍未獲得一種兼具上述優(yōu)點(diǎn)的理想佐劑?，F(xiàn)有技術(shù)的疫苗佐劑主要有三種劑型：油包水(w/o)型、水包油包水(w/o/w)型和水包油(w/o)型。其中w/o/w免疫活性較強(qiáng)，但熱穩(wěn)定性差、保存期短；o/w毒副作用小甚至沒有、熱穩(wěn)定性好，但是市面上的水包油佐劑制備的疫苗免疫活性較弱。與上述二者相比，w/o的免疫活性最強(qiáng)，但毒副反應(yīng)大、注射困難；已研究發(fā)現(xiàn)，加入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┠芴岣咚鸵呙缱魟┑拿庖呋钚约懊庖叱掷m(xù)期，對疫苗抗體水平有不同程度的影響。但是目前尚無性能穩(wěn)定的水包油型疫苗佐劑上市，此外，現(xiàn)有技術(shù)的水包油型佐劑由于配方成分、制備工藝不夠合理，因此在使用環(huán)節(jié)仍存在免疫效力較低等的缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種水包油型疫苗佐劑及其制備方法以解決現(xiàn)有技術(shù)的水包油型疫苗佐劑穩(wěn)定性不佳的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的水包油型疫苗佐劑對疫苗的免疫促進(jìn)作用較低。

本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)的水包油型疫苗佐劑易對機(jī)體產(chǎn)生刺激作用。

本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是如何進(jìn)一步提升上述水包油型疫苗佐劑的免疫促進(jìn)效果。

本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是如何提升上述水包油型疫苗佐劑的制備效率。

為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種水包油型疫苗佐劑，包括以下重量百分比的成分：表面活性劑5-8％，穩(wěn)定劑0.2～5％，礦物油86-92％，增溶劑0.05～1％。

作為優(yōu)選，表面活性劑由親水表面活性劑和親油表面活性劑組成。

作為優(yōu)選，所述親水表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：月桂基葡萄糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠。

作為優(yōu)選，所述親油表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：單硬脂酸甘油酯、脂肪酸甲酯、聚乙二醇雙油酸酯。

作為優(yōu)選，親水表面活性劑與親油表面活性劑的質(zhì)量百分比為3:7～6:4；更優(yōu)的，該質(zhì)量百分比是4:6～5:5。

作為優(yōu)選，所述親油性表面活性劑的親水親油平衡值是3～8。

作為優(yōu)選，所述穩(wěn)定劑選自以下成分的一種或幾種：丙二醇脂肪酸酯、d-甘露糖醇、海藻酸丙二醇酯、聚葡萄糖。

作為優(yōu)選，所述礦物油是白油。

作為優(yōu)選，所述增溶劑是葡萄糖和甘氨酸。

一種上述水包油型疫苗佐劑的制備方法，包括以下步驟：

1)取配方量的表面活性劑均勻分散在礦物油中，得到含表面活性劑的油相；

2)分別取配方量的穩(wěn)定劑和增溶劑，依次加入至步驟1)所述含表面活性劑的油相中，得到乳濁液；

3)再以600～2000bar的壓力均質(zhì)處理，而后過濾除菌，即得到所述水包油型疫苗佐劑。

作為優(yōu)選，所述均質(zhì)處理的循環(huán)次數(shù)為2～8次。

按照本方法制得的疫苗佐劑，宜充氮灌裝，可室溫下放置。

本發(fā)明提供了一種水包油型疫苗佐劑及其制備方法，該技術(shù)方案優(yōu)選了表面活性劑的類別及構(gòu)成，通過一步法制備穩(wěn)定的水包油佐劑，增強(qiáng)疫苗本身的細(xì)胞及體液免疫刺激能力，尤其是該疫苗佐劑還能同時(shí)含有適用于提高疫苗效力的其它水性佐劑成份，進(jìn)一步提高滅活疫苗的攻毒保護(hù)效力，解決目前水包油型疫苗免疫活性低及免疫持續(xù)期短的技術(shù)問題。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于采用含有免疫增強(qiáng)劑的水包油型納米乳，可與疫苗的混合使用，與現(xiàn)有的普通水包油型滅活疫苗相比，能夠取得以下有益效果：

1、本發(fā)明的納米疫苗佐劑，可以顯著增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞及體液免疫刺激能力，提高滅活疫苗的攻毒保護(hù)效力。以豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗為例，目前市場上預(yù)防該病的疫苗仍然不能達(dá)到令人滿意的完全保護(hù)的效果。采用本發(fā)明提供的疫苗佐劑，能明顯提高免疫應(yīng)答效果。

2、本發(fā)明提供的納米疫苗佐劑稀釋豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗的效果，相較于油包水型豬繁殖與呼吸綜合征沒活疫苗對小鼠的免疫作用更明顯，增強(qiáng)了疫苗的效價(jià)，節(jié)約了成本。

3、本發(fā)明的納米疫苗佐劑制備方法，工藝簡單，成本低，得到的劑型穩(wěn)定。制備水包油型納米乳劑，穩(wěn)定期長，易儲(chǔ)存，免疫效果好，保護(hù)期延長，易于注射，副反應(yīng)很小。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1所制備的疫苗佐劑、常規(guī)疫苗佐劑以及對照組注射小鼠后對小鼠體重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(圖中橫坐標(biāo)是時(shí)間，單位是h；縱坐標(biāo)是體重，單位是g)。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1～5所制備的疫苗佐劑的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下將對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。

以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。

除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

以下實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)中的百分比均采用質(zhì)量百分比，所述白油采用天津佐沐生物科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為vaccute-l。

實(shí)施例1

一種水包油型疫苗佐劑，由以下成分組成：月桂基葡萄糖苷2.5g，聚乙烯吡咯烷酮2.3g，單硬脂酸甘油酯1.1g，聚乙二醇雙油酸酯2.1g，白油vaccute-l89g，丙二醇脂肪酸酯1.5g，聚葡萄糖1.0g吐溫800.5g。

選擇體重18～22g的spf級(jí)的balb/c小鼠雌雄各10只分為三組，選擇以上制備的疫苗佐劑為實(shí)驗(yàn)組，生理鹽水組為空白對照組，法國賽比克公司出品的seppic水包油型疫苗佐劑為標(biāo)準(zhǔn)對照組，通過體重?fù)Q算，每份用0.5ml肌肉注射，連續(xù)觀察2周。分別進(jìn)行體重變化測定、是否有中毒癥狀分析、是否有不良反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重增長曲線與空白對照組高度吻合，增長速度與增長量均顯著優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)對照組，這表明本實(shí)施例所制備的疫苗佐劑對小鼠生長不存在負(fù)面影響。

進(jìn)一步的，選擇體重18～22g的balb/c小鼠72只分為4組，每組18只，雌雄各半。選擇實(shí)施例1制備的納米疫苗佐劑，各組按照表1進(jìn)行免疫，通過體重?fù)Q算，每份用0.5ml佐劑或生理鹽水稀釋，免疫途徑均采取肌肉注射免疫，兩周后用同樣劑量進(jìn)行第二次免疫。

表1不同佐劑對疫苗免疫效力促進(jìn)作用的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中分組方式及注射劑量

通過上述方法注射后，6周采血分析，比較不同組別抗體水平，結(jié)果顯示本實(shí)施例所制備的佐劑疫苗組誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體最快，體液免疫應(yīng)答效果最佳。

實(shí)施例2

一種水包油型疫苗佐劑，由以下成分組成：聚乙烯吡咯烷酮3.5g，瓜爾膠1.3g，脂肪酸甲酯2.0g，聚乙二醇雙油酸酯1.2g，白油vaccute-l88g，d-甘露糖醇1.5g，海藻酸丙二醇酯1.5g，司班801g。

實(shí)施例3

一種水包油型疫苗佐劑，由以下成分組成：月桂基葡萄糖苷1.93g，瓜爾膠2.45g，單硬脂酸甘油酯1.7g，脂肪酸甲酯1.22g，白油vaccute-l92g，丙二醇脂肪酸酯0.1g，d-甘露糖醇0.1g，吐溫800.5％(w/w)。

實(shí)施例4

一種水包油型疫苗佐劑，由以下成分組成：月桂基葡萄糖苷1.4g，脂肪酸甲酯3.4g，聚乙二醇雙油酸酯3.2g，白油vaccute-l86g，海藻酸丙二醇酯3g聚葡萄糖2g，司班801g。

實(shí)施例5

一種水包油型疫苗佐劑，由以下成分組成：聚乙烯吡咯烷酮1.2g，單硬脂酸甘油酯1.8g，脂肪酸甲酯2g，白油vaccute-l92g，海藻酸丙二醇酯1g，d-甘露糖醇1g，司班801g。

實(shí)施例6

本實(shí)施例用以驗(yàn)證上述實(shí)施例1～5所制備的疫苗佐劑的化學(xué)穩(wěn)定性。所述化學(xué)穩(wěn)定性以疫苗佐劑穩(wěn)定性參數(shù)ke進(jìn)行表征。

穩(wěn)定性常數(shù)的計(jì)算公式如下：ke-(a0-a)/a0*100％/(0＜ke＜1)。式中a0為乳劑的稀釋液在設(shè)定波長處測得的吸光度；a為經(jīng)離心后離心管底部乳劑的稀釋液在同一波長處測得的吸光度。穩(wěn)定性常數(shù)ke越小，說明乳劑在離心前后變化越小，乳劑越穩(wěn)定。

分別取乳劑5ml置于10ml離心管中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，以超純水為空白，在可見區(qū)波長500nm處測定吸光度。同法將未離心的乳劑用微量進(jìn)樣器精密量取試管底部樣品50ul置于10ml刻度試管中，同法測定，計(jì)算ke。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2、圖2所示。

表2實(shí)施例1～5所制備的疫苗佐劑的化學(xué)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)結(jié)果

通過上述實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，以上實(shí)施例1～5所制備的疫苗佐劑，其化學(xué)穩(wěn)定性均處于較高水平。這表明本發(fā)明所提供的疫苗佐劑相對于現(xiàn)有技術(shù)的佐劑而言化學(xué)穩(wěn)定性更加突出，同時(shí)，其穩(wěn)定性水平較為均一。

實(shí)施例7

一種水包油型疫苗佐劑，由以下重量百分比的成分組成：表面活性劑8％，穩(wěn)定劑0.2％，礦物油86％，增溶劑1％，水余量。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

表面活性劑由親水表面活性劑和親油表面活性劑組成。所述親水表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：月桂基葡萄糖苷、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠。所述親油表面活性劑選自以下成分的一種或幾種：單硬脂酸甘油酯、脂肪酸甲酯、聚乙二醇雙油酸酯。親水表面活性劑與親油表面活性劑的質(zhì)量比為3:7。

所述親油性表面活性劑的親水親油平衡值是3。

所述穩(wěn)定劑選自以下成分的一種或幾種：丙二醇脂肪酸酯、d-甘露糖醇、海藻酸丙二醇酯、聚葡萄糖。

所述礦物油是白油。

上述水包油型疫苗佐劑的制備方法，包括以下步驟：

1)取配方量的表面活性劑均勻分散在礦物油中，得到含表面活性劑的油相；

2)分別取配方量的穩(wěn)定劑和增溶劑，依次加入至步驟1)所述含表面活性劑的油相中，得到乳濁液；

3)再以600bar的壓力均質(zhì)處理，而后過濾除菌，即得到所述水包油型疫苗佐劑。

實(shí)施例8

一種水包油型疫苗佐劑，由以下重量百分比的成分組成：表面活性劑5％，穩(wěn)定劑5％，礦物油89％，增溶劑1％。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

表面活性劑由親水表面活性劑和親油表面活性劑組成。親水表面活性劑與親油表面活性劑的質(zhì)量比為6:4。

所述親油性表面活性劑的親水親油平衡值是8。

上述水包油型疫苗佐劑的制備方法，包括以下步驟：

1)取配方量的表面活性劑均勻分散在礦物油中，得到含表面活性劑的油相；

2)分別取配方量的穩(wěn)定劑和增溶劑，依次加入至步驟1)所述含表面活性劑的油相中，得到乳濁液；

3)再以2000bar的壓力均質(zhì)處理，而后過濾除菌，即得到所述水包油型疫苗佐劑。

以上對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。