本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗及其制備方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：一、病原微生物與疫苗能引起人體或動物體發(fā)生傳染病的微生物，稱為病原微生物或致病微生物。傳染是指病原微生物侵入機體后，在一定的部位生長、繁殖，并引起一系列病理生理的過程。當(dāng)病原微生物侵入機體后，病原微生物與機體互相作用，互相改變對方的活性與功能，因此能否引起傳染病，一方面取決于病原微生物的致病能力即致病性或毒力，另方面還取決于機體的抵抗力即免疫力。病原性細菌引起傳染的能力大小，就是細菌的毒力或致病性。細菌毒力的有無和毒力的強弱主要取決于它的侵襲力、產(chǎn)毒素性和引起超敏反應(yīng)的能力。細菌產(chǎn)生的毒素可分為外毒素和內(nèi)毒素兩大類。外毒素是病原菌在生長繁殖期間分泌到周圍環(huán)境種的一種代謝產(chǎn)物，主要由革蘭氏陽性菌產(chǎn)生，少數(shù)革蘭氏陰性菌也能產(chǎn)生。其化學(xué)組成是蛋白質(zhì)，抗原性強，毒性也強，但極不穩(wěn)定，對熱和某些化學(xué)物質(zhì)敏感，容易受到破壞。常見的如：白喉棒桿菌產(chǎn)生的白喉外毒素、破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素、霍亂弧菌產(chǎn)生的腸毒素、肉毒梭菌產(chǎn)生的肉毒毒素等。大多數(shù)革蘭氏陰性細菌能產(chǎn)生內(nèi)毒素，實際上它存在于細菌細胞壁的外層，屬于細胞壁的組成部分，一般情況下并不分泌到環(huán)境中，只有當(dāng)細菌溶解后才釋放出來，因而稱為內(nèi)毒素，其毒性比外毒素要低，抗原性也弱。同種生物的不同個體，當(dāng)它們與病原菌接觸后，有的患病，有的則安然無恙，原因在于不同個體的免疫力不同。免疫就是指機體識別和排除抗原異物(如病原微生物等)的一種保護性反應(yīng)。一般來講，它對機體是有利的，在異常條件下，也可能損害機體。人體的免疫分為非特異性免疫和特異性免疫。其中特異性免疫是指機體針對某一種或某一類微生物或產(chǎn)物所產(chǎn)生的特異抵抗力。而疫苗即是科學(xué)家研制出來使機體產(chǎn)生特異性免疫抵抗病原微生物對人體侵害的生物制品，通常由病原微生物本身加以制備而成的。細菌、病毒和立克次氏體等病原微生物制成疫苗，注射機體后，使機體產(chǎn)生特異性或致敏性淋巴細胞，分泌抗體，達到特異性免疫效果。而疫苗又分為治療性和預(yù)防性兩種，通過治療性疫苗治療疾病，并通過預(yù)防性疫苗保護人體不受致病性微生物的侵害。經(jīng)過多年的努力，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)開發(fā)出各種不同的疫苗用以預(yù)防，諸如細菌、病毒和真菌等，感染造成的各種疾病，極大地提高了人類的健康水平。生物技術(shù)的不斷發(fā)展，促進了疫苗品種的多樣化。用以預(yù)防病毒導(dǎo)致的傳染病有滅活病毒技術(shù)開發(fā)出來的疫苗，如乙腦疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、流感疫苗等；減毒病毒技術(shù)開發(fā)出來的減毒活疫苗，如輪狀病毒疫苗、口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、風(fēng)疹病毒疫苗和水痘疫苗等。用以預(yù)防細菌性傳染病的有用蛋白和多糖等生物大分子純化技術(shù)開發(fā)出來的細菌類疫苗，如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素及其亞細胞組分、流行性腦膜炎球菌多糖和23價肺炎球菌多糖等。更先進的有用半化學(xué)結(jié)合技術(shù)開發(fā)出來的預(yù)防腦膜炎和肺炎的細菌疫苗，如流行性嗜血桿菌b型多糖-蛋白綴合疫苗、7價或10價肺炎球菌多糖-蛋白綴合疫苗以及4價腦膜炎球菌多糖-蛋白綴合疫苗。通過對生物技術(shù)的不斷改進，能夠開發(fā)出更多的新型疫苗產(chǎn)品來應(yīng)付不同的病原微生物對人類健康的挑戰(zhàn)。二、呼吸道疾病及免疫概述呼吸系統(tǒng)是所有動物與環(huán)境進行氧氣和二氧化碳交換的器官對于哺乳動物來說是指從鼻腔和咽喉開始直到肺葉的部分。呼吸道感染是臨床常見的病癥通常從感染發(fā)生到出現(xiàn)臨床癥狀再到入院治療的過程中宿主免疫系統(tǒng)己經(jīng)處在免疫調(diào)理期間。在這個過程中最先起作用的固有免疫體系已經(jīng)不足以清除病原體從而適應(yīng)性免疫體系進一步跟進。導(dǎo)致呼吸道感染的病原體主要有病毒和細菌，以往研究表明當(dāng)病毒和細菌同時感染宿主時通常導(dǎo)致嚴(yán)重肺炎具有較高的病死率。而多種呼吸道病毒同時感染時宿主免疫系統(tǒng)將不能有效清除病原體并能在感染發(fā)生的期間引發(fā)多種并發(fā)癥。由于直接與外界接觸，因此極易直接接觸外界環(huán)境中的各類抗原，從而引發(fā)各類的呼吸道疾病。各類型的呼吸道疾病在各個國家各類醫(yī)院中都是最為常見的疾病，并且呼吸道由于涉及的組織多，組織環(huán)境復(fù)雜，易受外界影響，因此各類呼吸道疾病的預(yù)防就顯得尤為關(guān)鍵。呼吸道感染是臨床常見疾病，在眾多病原體中能導(dǎo)致呼吸道急性炎癥并具有較高致病率和致死率的兩個病毒是流感病毒(influenzavirus，orflu)和呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，orrsv)。呼吸道傳染病至今仍然是世界上導(dǎo)致死亡的主要原因之一，而呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)、腺病毒、副流感、流感病毒則是重要的呼吸道病原體。臨床結(jié)果顯示，在呼吸道感染發(fā)生的肺炎、支氣管炎和哮喘病人中rsv占首位，嚴(yán)重影響了人類健康和生命安全。在呼吸道致病病原體中，其中所占比例最高的是病毒引起，在病毒性呼吸道疾病中，又以流感和呼吸道合胞病毒為主，如在臨床1個月至5歲的嬰幼兒，6歲至24歲的青少年，以及25歲至65歲人群感冒樣病例中，由病毒引起的病例約占化％，在共感染2種以上呼吸道病毒的人群中，rsv檢測陽性的人群比例約為50％，其次是a型和b型流感病毒，分別為9.84％和10.巧％，由于呼吸道病毒的傳播范圍廣，引起的急性呼吸道炎癥比較嚴(yán)重，流感病毒和呼吸道合胞病毒的感染人群幾乎覆蓋了所有年齡階段，況且這兩種病毒都沒有可以大規(guī)模使用的有效疫苗，且在感染后對人類社會造成的危害和損失是不可估量的，在送樣的情況下，開展對這兩個病毒的研究是必須和必然的。三、季節(jié)流感及其流行病學(xué)流感病毒為正粘病毒科，為分節(jié)段負鏈rna病毒。根據(jù)病毒的核蛋白(np)和基質(zhì)蛋白(m)不同分為甲型、乙型、丙型。甲型流感具有高度變異、廣泛的感染宿主范圍，對公眾健康的威脅最大。根據(jù)病毒表面的血凝素(ha)甲型流感病毒又分為ha1-16亞型，依據(jù)神經(jīng)氨酸酶na分為na1-9亞型。目前在人群中流行的甲型流感病毒主要有h1、h2、h3及n1、n2亞型，近年來感染人的新型流感病毒2009h1n1、h7n9禽流感病毒，前者造成流感大流行，后者的致死率達27.2％。a型流感病毒和b型流感病毒都含有8節(jié)段的負極性單鏈rna。a型流感病毒基因組至少編碼11個多肽。節(jié)段1-3編碼3個多肽，組成病毒rna依賴的rna聚合酶。節(jié)段1編碼聚合酶復(fù)合物蛋白pb2。另外的聚合酶蛋白pb1和pa分別由節(jié)段2和節(jié)段3編碼。另外，某些a型流感病毒株的節(jié)段1還編碼一個小蛋白pb1-f2，是由pb1編碼區(qū)內(nèi)的另一個閱讀框架產(chǎn)生的。節(jié)段4編碼血凝素(ha)表面糖蛋白，參與細胞粘附以及使病毒在感染期內(nèi)進入細胞。節(jié)段5編碼核殼體核蛋白(np)多肽，這是一種與病毒rna相連的主要結(jié)構(gòu)蛋白。節(jié)段6編碼神經(jīng)酰胺酶(na)包膜糖蛋白。節(jié)段7編碼兩種基質(zhì)蛋白，被稱為m1和m2，是由經(jīng)不同方式剪接的mrna翻譯的。節(jié)段8編碼ns1和ns2(nep)，這是兩種非結(jié)構(gòu)蛋白，由經(jīng)其他方式剪接的mrna翻譯的。ha、na糖蛋白在病毒感染、復(fù)制過程中起著重要作用，也是重要抗原，能刺激機體產(chǎn)生中和性保護抗體?？筯a抗體是目前用于評估流感疫苗有效性的重要指標(biāo)，盡管抗na抗體能減輕臨床癥狀，但既往基于β甲醛丙酮酸的生色反應(yīng)，由于使用試劑有毒、操作繁瑣，適合大批量篩查，因而抗na抗體檢測未被廣泛推廣。1990年，clauder.lambré報道基于花生四烯酸結(jié)合半乳糖基團檢測的酶鏈免疫檢測法，隨后發(fā)現(xiàn)抗ha抗體如與病毒相互作用，該作用也能構(gòu)象上影響與na的結(jié)合，從而出現(xiàn)抗na抗體假陽性。2009年，sandbultemr研究團隊使用僅含流感病毒na的病毒樣顆粒(vlp)用于抗na抗體檢測，該方法已申請專利，因制備的vlp產(chǎn)量受限，體系中也可能有桿狀病毒，對vlp技術(shù)缺乏掌握的實驗室或疫苗廠家難以開展。血凝素(ha)和神經(jīng)氨酸酶(na)是流感病毒粒子表面的2種纖突樣糖蛋白，ha大約含550個氨基酸，以同源三聚體形式存在于囊膜表面，是被宿主中抗體識別的主要抗原，它在流感病毒入侵前識別宿主細胞受體并與其結(jié)合以利于病毒的吸附與穿膜，ha前體被宿主蛋白酶裂解，流感病毒才具有感染性。接種疫苗是預(yù)防流感發(fā)生與傳播的最有效方式。目前市場應(yīng)用的流感疫苗主要有三種：全病毒滅活疫苗、裂解疫苗、亞單位疫苗。這些疫苗對同亞型流感病毒感染預(yù)防有效，但在不同亞型病毒之間的保護效果較弱。此外，流感病毒的變異速度非?？欤鞲幸呙缑磕甓家鼡Q，給疫苗的生產(chǎn)制備造成了諸多不便。世界衛(wèi)生組織是依據(jù)當(dāng)年全世界范圍流感病毒變化情況來預(yù)測并推薦下一年流感疫苗生產(chǎn)用組分的，預(yù)測的準(zhǔn)確度將會直接影響疫苗的保護效率，如預(yù)測失敗將造成流感爆發(fā)流行的潛在威脅。因此，研制出一種具有廣泛保護作用的通用型疫苗對于應(yīng)對流感病毒突變后的突然爆發(fā)，迅速建立人群免疫屏障，阻斷流感大流行蔓延，降低其危害性方面具有極其重要的實際意義。flumist是一種減毒活疫苗，可保護兒童和成人不患流感。flumist疫苗株含有來源于當(dāng)前流行的野生型病毒株的ha和na基因節(jié)段及來源于普通主供體病毒(commonmasterdonorvirus)(mdv)的六個基因節(jié)段：pb1、pb2、pa、np、m和ns。flumist的a型流感病毒株的mdv(mdv-a)是在連續(xù)降低溫度的條件下在原代雞腎組織培養(yǎng)物中通過野生型a/annarbor/6/60病毒株(a/aa/6/60)的系列傳代而得到的。mdv-a可在25℃時有效復(fù)制(ca，冷適應(yīng))，但是其生長在38℃和39℃時受到抑制(ts，溫敏)。另外，這種病毒在被感染的雪貂肺內(nèi)不能復(fù)制(att，減毒的)。這種溫敏表型相信是限制其在人呼吸道內(nèi)最冷區(qū)域之外的部位復(fù)制而導(dǎo)致其毒性減弱的原因。動物模型試驗和臨床試驗表明這種特性是相當(dāng)穩(wěn)定的。與通過化學(xué)誘變制備的流感病毒株的這種ts表型不同，mdv-a的ts特性通過在感染的倉鼠內(nèi)傳代或從兒童中分離出的經(jīng)傳代的分離株的這種特性不會還原。流感病毒由于其變異率高，宿主廣泛。目前應(yīng)用的流感疫苗的有效率在60％～85％之間，其主要抗原成份為流感病毒膜蛋白ha和na。而由于流感病毒為rna病毒，其變異率為105～103之間，這導(dǎo)致流感疫苗病毒株每年都需更換，為流感疫苗的制備帶來不便。流感病毒一般由于接觸到宿主的鼻腔及呼吸道黏膜后，進入宿主細胞，完成病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。因此作為人體免疫的第一道防線，黏膜免疫的及時激活對于防治流感等疾病具有重要的現(xiàn)實意義。四、呼吸道合胞病毒及其流行病學(xué)呼吸道傳染病至今仍然是世界上導(dǎo)致死亡的主要原因之一，而流感病毒(influenzavirus，flu)和呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)則是重要的呼吸道病原體。目前，流感已有安全有效的不同類型疫苗，為流感的防控提供了保證。而rsv由于自身免疫特性，投入臨床的疫苗很少，為其防控提出了挑戰(zhàn)。至今僅有美國medimmune公司研制生產(chǎn)的流感三價減毒活疫苗通過fda審批。rsv是嬰幼兒下呼吸道感染最重要的病原，也是造成老年人和免疫缺陷成人住院和肺炎死亡的重要原因。據(jù)統(tǒng)計，6個月以內(nèi)的嬰幼兒因rsv感染導(dǎo)致住院達70％，2周歲以內(nèi)的兒童甚至高達99％。rsv因其致病范圍廣，病情高發(fā)，且會引起嚴(yán)重的并發(fā)癥等，給人類健康和生命安全造成了嚴(yán)重威脅。世界衛(wèi)生組織已將rsv疫苗定為優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。rsv屬副粘病毒科肺病毒屬的非節(jié)段性單股負鏈rna病毒，含a、b兩個血清型。rsv基因組全長約15kb，編碼10種主要蛋白，分別由三個跨膜蛋白(g、f和sh)、兩個基質(zhì)蛋白(m和m2)、三個核衣殼蛋白(n、p和l)及兩個非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1和ns2)構(gòu)成，其中融合蛋白f(fusionprotein，f)和附著蛋白g(attchmentprotein，g)是rsv激發(fā)機體產(chǎn)生保護性抗體最重要的病毒蛋白。g蛋白易變異，并非感染和細胞融合所必須的；f蛋白能夠穩(wěn)定遺傳，單獨的f蛋白就可引起細胞融合病變。針對rsvf和g糖蛋白的全身性中和抗體能有效防止rsv再感染，因此rsvf和g蛋白已作為公認(rèn)的保護性抗原和毒力致病分子。對于rsv而言，20世紀(jì)60年代，fulginitiva等研制的福爾馬林滅活疫苗(fi-rsv)由于誘發(fā)th2型免疫過激導(dǎo)致2名兒童死亡和80％住院以失敗告終。目前rsv疫苗的研究主要集中在載體疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、dna疫苗、vlp疫苗，已有多種疫苗類型正在研制，但至今無獲批的rsv疫苗可用。rsv疫苗的研究一直是國際社會關(guān)注的焦點，從已有的研制中的rsv疫苗可見，注射免疫不能產(chǎn)生有效的粘膜和細胞免疫反應(yīng)且免疫保護效果受限、dna疫苗存在潛在安全性以及全長f、g蛋白疫苗存在潛在th1/th2失平衡等瓶頸問題亟待解決。近年來，隨著流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)日亦成熟及流感病毒載體等多種蛋白載體的日漸成熟，以載體蛋白作為遞送系統(tǒng)成功研發(fā)的rsv疫苗候選株能夠產(chǎn)生雙重免疫保護效果，且安全性高、易于操作，具有廣闊的發(fā)展前景，有望為rsv疫苗研究提供新的思路。美國medimmune公司研制生產(chǎn)的帕麗珠(palivizumab)主要針對rsva型f蛋白抗原表位ii中263-275位氨基酸，作為全球第一支特異性針對rsvf蛋白中和表位的人源化單克隆抗體，帕麗珠證實可以顯著降低接種人群的自然感染率，在rsv的預(yù)防和早期干預(yù)過程中發(fā)揮重要作用。目前已通過fda批準(zhǔn)，成功上市，在全球范圍內(nèi)率先結(jié)束了rsv無苗可防，無藥可治的局面。五、納米顆粒及其在免疫學(xué)中的應(yīng)用概況納米顆粒是指任何小于100～1000nm的顆粒，納米顆粒大小與細胞組分相近，能夠利用細胞內(nèi)吞作用進入細胞。納米顆粒的作用主要包括以下幾方面：1、負載多種理化性質(zhì)不同的抗原，保護抗原不被降解；2、促進樹突狀細胞(dendriticcell，dc)等抗原呈遞細胞對抗原疫苗的攝取和呈遞；3、調(diào)控抗原在細胞和組織中的輸運和釋放；4、部分納米材料還能誘導(dǎo)dc等抗原呈遞細胞活化。聚合物納米顆粒具有較大的比表面積，能夠較好地負載疫苗而發(fā)揮疫苗的免疫效力。因此，基于納米材料尤其是聚合物納米顆粒的新型疫苗載體系將成為突破瓶頸的重要技術(shù)手段。隨著納米顆粒的深入研究，以及不斷出現(xiàn)的新的以納米顆粒為載體的疫苗的成功問世，為申請人研究流感-rsv疫苗提供了研究思路。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗及其制備方法。本發(fā)明的第一個目的在于提供一種經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗，采用的技術(shù)方案如下：經(jīng)修飾的季節(jié)流感-呼吸道合胞病毒(rsv)聯(lián)合疫苗，包括：流感病毒蛋白抗原、rsv蛋白抗原及納米顆粒載體，納米顆粒載體表面羥基化，流感病毒蛋白抗原和rsv蛋白抗原與納米顆粒載體表面的羥基反應(yīng)，連接在納米顆粒表面。優(yōu)選地，流感病毒蛋白包括包括但不限于血凝素ha、神經(jīng)氨酸酶na、核蛋白np、基質(zhì)蛋白m(m1+m2)、非結(jié)構(gòu)蛋白ns、聚合酶蛋白(pb2、pb1、pa)中的一種或多種。優(yōu)選地，rsv蛋白包括f蛋白、g蛋白、f優(yōu)勢表位、g優(yōu)勢表位或其組合。更優(yōu)選地，流感病毒蛋白抗原和/或rsv蛋白抗原為經(jīng)基因工程重組后純化的蛋白或蛋白片段。本發(fā)明中采用流感病毒蛋白抗原與rsv蛋白抗原進行納米載體的連接反應(yīng)，但流感病毒與rsv的抗原不應(yīng)限定于此，任何可以引起流感病毒和rsv免疫反應(yīng)的抗原、任何來源的此類抗原均應(yīng)認(rèn)為落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明主要的目的是提供一種經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗，當(dāng)然本發(fā)明中提到的納米載體可連接的蛋白范圍不應(yīng)限定于此，采用本發(fā)明中的納米顆粒載體，可以連接任何理論上可以進行氨基羥基反應(yīng)的物質(zhì)。納米顆粒載體包括非生物原的納米顆?；蛏镌募{米顆粒，非生物原的納米顆粒包括樹狀分子、碳富勒烯、固體脂質(zhì)納米顆粒、納米乳劑、可生物降解的聚丙交酯-乙交酯；生物原的納米顆粒包括寡核苷酸、多糖以及可作為抗原、變應(yīng)原、病原體分子。優(yōu)選地，非生物原納米顆粒為硅基納米顆粒。更優(yōu)選地，硅基顆粒為硅酸鹽納米顆粒。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種制備上述經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗的制備方法，制備方法包括如下步驟：s1：將硅酸放入無水乙醇中，形成濃度為0.1～0.5mol/l的硅酸醇液，加入分散劑，加入后分散劑在體系中的含量為硅酸的0.1～1.2，密封超聲反應(yīng)并攪拌，反應(yīng)時間為30～60min；s2：通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將s1的懸濁液進行減壓蒸餾，直至形成粘稠狀漿液，然后將粘稠狀漿液進行微超聲，直至完全蒸干，形成分散性顆粒；s3：將分散性顆粒中加入至反應(yīng)釜中，加入催化劑與氨水，密封反應(yīng)3～8h，然后梯度升溫反應(yīng)2～4h，自然冷卻；加入發(fā)泡材料，密封反應(yīng)溫度為30～50℃，梯度升溫反應(yīng)，最終溫度為130～150℃，并持續(xù)30min以上；s4：將s3得到反應(yīng)顆粒與多肽類陽離子聚合物混合10～15min，密封黑暗條件下恒溫攪拌12～15h，經(jīng)冷凍干燥即可羥基修飾的納米顆粒；s5：選擇a型流感病毒的通過基因工程手段或其他生物手段得到的流感病毒蛋白片段，和rsv蛋白，取凍干的蛋白用注射用水復(fù)溶；干燥后的納米顆粒用水復(fù)溶；s6：溶于復(fù)溶后以每種蛋白與納米顆粒以體積比為1：2～10進行混合，加入催化劑進行脫水反應(yīng)，混合均勻后黑暗攪拌24h以上，離心。優(yōu)選地，s1中涉及的各試劑和參數(shù)具體為：將硅酸放入無水乙醇中，形成濃度為0.1～0.5mol/l的硅酸醇液，加入醫(yī)用級聚乙烯吡咯烷酮，加入后分散劑在體系中的含量為硅酸的0.1～1.2，密封超聲反應(yīng)并攪拌，超聲頻率10-15khz，反應(yīng)時間為30～60min。優(yōu)選地，s2中涉及的各試劑和參數(shù)具體為：通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將s1的懸濁液進行減壓蒸餾，壓力為0.03～0.05mpa，直至形成粘稠狀漿液，然后將粘稠狀漿液進行水浴低頻率超聲，頻率為1.3-2.5khz，60℃以下超聲，直至完全蒸干，形成分散性顆粒。優(yōu)選地，s3中涉及的各試劑和參數(shù)具體為：將分散性顆粒中加入至反應(yīng)釜中，加入氧化鋁與氨水，密封反應(yīng)3～8h，然后梯度升溫反應(yīng)2～4h，自然冷卻；加入發(fā)泡材料，密封反應(yīng)溫度為30～50℃，梯度升溫反應(yīng)要求最后溫度為130～150℃，并持續(xù)30min以上。更優(yōu)選地，氧化鋁為采用二氧化鈦負載量為1～3％的氧化鋁。優(yōu)選地，s4中涉及的各試劑和參數(shù)具體為：將s3得到反應(yīng)顆粒與多肽類陽離子聚合物混合10～15min，密封黑暗條件下恒溫攪拌12～15h，恒溫20～30℃，攪拌速度300～500r/min。氨基與羥基在催化劑的催化下脫水縮合反應(yīng)是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，在此不做贅述。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用納米顆粒作為新型蛋白載體，高效穩(wěn)定的連接抗原蛋白，通過成功構(gòu)建同時具有流感病毒抗原及rsv抗原的納米顆粒，經(jīng)小鼠實驗證明，可以引起良好的系統(tǒng)免疫反應(yīng)，可作為新型疫苗推廣使用。納米顆粒作為載體可重復(fù)合成，穩(wěn)定性好，不僅可以抵抗體內(nèi)各種酶的消化，而且具有耐受高壓滅菌等眾多優(yōu)點。采用納米顆粒作為新型蛋白載體，方法簡單，操作簡便，可連接多種蛋白和多糖抗原，無需過多修飾，產(chǎn)生的疫苗無需進行再處理，不會由于疫苗的生產(chǎn)過程導(dǎo)致接種者產(chǎn)生各類不適反應(yīng)，降低了不良反應(yīng)的發(fā)生率，并且可以同時連接至少一種抗原，接種后可同時產(chǎn)生免疫反應(yīng)。本發(fā)明中的經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗可根據(jù)需要制備各種劑型，接種方式簡便高效，大大減輕了患者的身體及經(jīng)濟負擔(dān)。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料如無特殊說明，均為市場購買得到。實施例1：一、硅酸鹽納米顆粒的制備納米顆粒種類繁多，本實施例中選用其中一種的制備工藝進行說明。硅酸鹽納米顆粒，原料易得，制備工藝較為簡單，便于修飾后作為載體使用。本發(fā)明中硅酸鹽的制備過程具體如下：s1：將硅酸放入無水乙醇中，形成濃度為0.3mol/l的硅酸醇液，然后加入分散劑醫(yī)用級聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，加入后分散劑在體系中的含量為硅酸的0.8，超聲攪拌，超聲頻率15khz，超聲攪拌采用密封超聲反應(yīng)，反應(yīng)時間為60min；將分散劑加入乙醇中能夠具有良好的溶解性，同時硅酸在乙醇內(nèi)呈懸濁狀，兩者結(jié)合的情況下，硅酸分散性更佳；超聲反應(yīng)能夠在硅酸表面形成醇活化，超聲的離合能也會分解pvp，同時pvp無毒，是良好的分散劑材料。s2：通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將s1的懸濁液進行減壓蒸餾，壓力為0.05mpa，直至形成粘稠狀漿液，然后將粘稠狀漿液進行微超聲，直至完全蒸干，形成分散性顆粒；微超生選擇水浴低頻超聲，超聲頻率為2.0hz，分散時溫度不能過高，本實施例中溫度為50℃。這樣的實驗條件可以保證硅酸表面的醇活化效果，便于后續(xù)的實驗，以及官能團的轉(zhuǎn)化。s3：將分散性顆粒中加入至反應(yīng)釜中，加入催化劑與氨水，密封反應(yīng)3h，然后梯度升溫反應(yīng)4h，自然冷卻；加入發(fā)泡材料，密封反應(yīng)溫度為50℃，梯度升溫反應(yīng)要求最后溫度為150℃，并持續(xù)30min以上；催化劑采用二氧化鈦負載量為1～3％的氧化鋁，催化劑先進行紫外光照進行二氧化鈦活化，大大提高反應(yīng)深度與反應(yīng)速率；反應(yīng)釜中進行的反應(yīng)均以有機溶劑作為溶劑，包括乙醇、乙酸乙酯等，且溶劑不需要加水稀釋。梯度升溫除了反應(yīng)需要外，120℃以上能夠?qū)⒐杷崾D(zhuǎn)化為二氧化硅，得到反應(yīng)顆粒。s4：將s3得到反應(yīng)顆粒與多肽類陽離子聚合物混合15min，密封黑暗條件下恒溫攪拌15h，恒溫30℃，攪拌速度300r/min，經(jīng)冷凍干燥即可羥基修飾的納米顆粒。二、納米顆粒連接蛋白選擇a型流感病毒的通過基因工程手段或其他生物手段得到的流感病毒蛋白片段，包括但不限于血凝素ha、神經(jīng)氨酸酶na、核蛋白np、基質(zhì)蛋白m(m1+m2)、非結(jié)構(gòu)蛋白ns、聚合酶蛋白(pb2、pb1、pa)中的一種或多種，本實施例中選擇a型流感病毒a/california/07/2009(h1n1)菌株本身表達的ha與na蛋白進行連接。選擇呼吸道荷包病毒rsva型的通過基因工程手段或其他生物手段得到的rsv蛋白，包括但不限于f蛋白、g蛋白、f優(yōu)勢表位、g優(yōu)勢表位或其組合，本實施例中選擇rsv病毒表達的f蛋白和g蛋白進行連接。取凍干的蛋白用注射用水復(fù)溶，復(fù)溶后的蛋白溶液濃度為0.5mg/ml；干燥后的納米顆粒用水溶解，溶解后的納米顆粒濃度為2mg/ml。溶于復(fù)溶后以每種蛋白與納米顆粒以體積比為1：4進行混合，加入催化劑，混合均勻后黑暗攪拌24h以上。使蛋白的氨基與納米顆粒的表面羥基充分反應(yīng)?；旌虾?0000rpm離心10min，沉淀即為裝載后的產(chǎn)物。沉淀加入pbs緩沖液(ph＝5.0)溶解，溶解后濃度為0.5mg/ml，即為本實施例中制備的經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗原液。三、經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗的抗體滴度檢驗取20只balb/c小鼠隨機分為4組，第一至第四組分別是聯(lián)合疫苗免疫組、市售流感疫苗免疫組、rsv疫苗免疫組及陰性對照組。市售流感疫苗選擇孚洛克(流感病毒亞單位疫苗，批號20110801)由天士力金納生物技術(shù)(天津)有限公司生產(chǎn)，rsv疫苗選擇解放軍微生物流行病研究所實驗室重組的f-g蛋白亞單位疫苗，陰性對照為pbs與佐劑的混合對照。首次免疫時每只小鼠腹腔注射200μl；同時用pbs經(jīng)腹腔注射對照組小鼠，每只200μl；首次免疫后第二周和第三周，再次進行腹腔注射，每只200μl。于末次免疫一周后經(jīng)小鼠眼眶取血，分離血清；用pbs將各組小鼠血清從1：10000開始倍比稀釋至1：5120000，間接elisa檢測抗體效價。腹腔免疫檢測血清igg滴度(幾何平均值)。檢測結(jié)果見表1，其中第一組至第四組檢測血清igg滴度(1：)。表1腹腔免疫后小鼠抗體滴度表平行1平行2平行3平行4平行5第一組2089823145257792099328621第二組2775528476288302653226770第三組2680326577287192576126879第四組00000實施例2本實施例與實施例1的區(qū)別在于，納米顆粒載體的制備條件和蛋白抗原不同，具體如下：s1：將硅酸放入無水乙醇中，形成濃度為0.5mol/l的硅酸醇液，然后加入分散劑醫(yī)用級聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，加入后分散劑在體系中的含量為硅酸的0.3，超聲攪拌，超聲頻率10khz，超聲攪拌采用密封超聲反應(yīng)，反應(yīng)時間為45min；s2：通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將s1的懸濁液進行減壓蒸餾，壓力為0.03mpa，直至形成粘稠狀漿液，然后將粘稠狀漿液進行60℃1.5hz微超聲，直至完全蒸干，形成分散性顆粒；s3：將分散性顆粒中加入至反應(yīng)釜中，加入催化劑與氨水，密封反應(yīng)5h，然后梯度升溫反應(yīng)2h，自然冷卻；加入發(fā)泡材料，密封反應(yīng)溫度為30℃，梯度升溫反應(yīng)要求最后溫度為130℃，并持續(xù)40min以上；催化劑采用二氧化鈦負載量為3％的氯化鋁，反應(yīng)釜中進行的反應(yīng)均以乙醇作為溶劑，且溶劑不需要加水稀釋。s4：將s3得到反應(yīng)顆粒與多肽類陽離子聚合物混合12min，密封黑暗條件下恒溫攪拌15h，恒溫20℃，攪拌速度500r/min，經(jīng)冷凍干燥即可羥基修飾的納米顆粒。選擇流感病毒m蛋白、rsvf蛋白凍干粉，注射用水復(fù)溶，復(fù)溶后的蛋白溶液濃度為0.5mg/ml；干燥后的納米顆粒用水溶解，溶解后的納米顆粒濃度為2mg/ml。溶于復(fù)溶后以每種蛋白與納米顆粒以體積比為1：2進行混合，加入催化劑，混合均勻后黑暗攪拌24h以上。使蛋白的氨基與納米顆粒的表面羥基充分反應(yīng)?；旌虾?0000rpm離心10min，沉淀即為裝載后的產(chǎn)物。沉淀加入pbs緩沖液(ph＝5.0)溶解，溶解后濃度為0.5mg/ml，即為本實施例中制備的經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗原液。本實施例中得到的經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗原液腹腔免疫小鼠，得到的免疫結(jié)果如表2所示。表2腹腔免疫后小鼠抗體滴度表平行1平行2平行3平行4平行5第一組1899325245218321986220191第二組2821525326228902413220123第三組1765522348286112466122479第四組00000由表1和表2可以看出，人工合成的經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗與市售疫苗相比，可以引起同等滴度的免疫反應(yīng)，且免疫效果良好。不同的蛋白抗原之間引起免疫反應(yīng)的差異僅有蛋白性質(zhì)帶來。四、經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗的穩(wěn)定性檢驗修飾后的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗在4℃12個月或37℃保存4周，外觀檢查和鑒別試驗未見異常，ph值和抗原含量保持相對穩(wěn)定，進行小鼠試驗也未發(fā)現(xiàn)抗體水平發(fā)生明顯差異。說明經(jīng)修飾的季節(jié)流感-rsv聯(lián)合疫苗在4℃12個月或37℃保存4周的穩(wěn)定性良好。最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁12