相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2009年4月1日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/165,732的優(yōu)先權(quán)。本申請(qǐng)要求此在先專利申請(qǐng)的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用納入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明更具體涉及誘導(dǎo)對(duì)象中免疫應(yīng)答的疫苗、組合物和方法。
背景技術(shù)：
：通過使用疫苗預(yù)防微生物感染和致病過程被認(rèn)為是抵御疾病的最有效和理想過程。在感染或疾病前以刺激宿主生物中免疫應(yīng)答的方式將抗原或免疫原引入生物。然而，傳統(tǒng)的疫苗策略不能有效增強(qiáng)保護(hù)抵御許多病原或癌癥。在超過100種病原中，通過傳統(tǒng)疫苗策略僅制成約20種成功的疫苗。在誘導(dǎo)高細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)反應(yīng)的那些疫苗中，一些疫苗常由于免疫原性較弱、免疫回避機(jī)制和假性印跡而顯示中等的目標(biāo)反應(yīng)率。目前的疫苗遞送方法在誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答方面成功率中等，因?yàn)樗鼈儾徽T導(dǎo)強(qiáng)“危險(xiǎn)信號(hào)”，它們啟動(dòng)作為反饋機(jī)制的抑制反應(yīng)且它們遞送抗原給非專職性抗原呈遞細(xì)胞(apc)。例如，目前的癌癥疫苗即使在產(chǎn)生高ctl反應(yīng)時(shí)，也僅顯示中等(2.6％)目標(biāo)反應(yīng)率。它們有許多缺點(diǎn)，包括免疫原性差和免疫回避機(jī)制。此外，最具前景的癌癥疫苗(基于樹突細(xì)胞和基于g-vax)非常昂貴且這些疫苗的制備很復(fù)雜(例如需要個(gè)人化和gmp生產(chǎn))。基因疫苗或基因免疫涉及將遺傳物質(zhì)引入哺乳動(dòng)物宿主以產(chǎn)生抗原，其被視作包括癌癥疫苗在內(nèi)的疫苗可能途徑。遞送的編碼所述感興趣抗原的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體引起體內(nèi)表達(dá)和隨后發(fā)生的抗原特異反應(yīng)。此外，基因是帶負(fù)電的聚合物，不能跨細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞核以表達(dá)感興趣蛋白?；蛎庖咛峁┰S多優(yōu)點(diǎn)，包括產(chǎn)生體內(nèi)表達(dá)的全譜天然表位、相較給予體外表達(dá)重組蛋白可獲得天然構(gòu)象的蛋白、誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答、無需昂貴且往往挑戰(zhàn)性的抗原生產(chǎn)步驟。然而，基因疫苗有一些缺點(diǎn)，包括破壞對(duì)自體抗原的耐受性、體內(nèi)遞送核酸到細(xì)胞和核較差、缺乏對(duì)特定細(xì)胞類型的特異性、和免疫應(yīng)答較弱。其他疫苗形式也有缺點(diǎn)。例如，病毒遞送基因產(chǎn)生對(duì)病毒載體的強(qiáng)免疫應(yīng)答且涉及安全問題。從細(xì)菌中純化蛋白和生產(chǎn)用作抗原的肽花費(fèi)較大且耗時(shí)。目前，沒有可靶向apc以生成特異和較強(qiáng)免疫應(yīng)答而副作用沒有或很少的經(jīng)濟(jì)、有效疫苗形式。因此，非常需要靶向?qū)Ｂ歛pc并引發(fā)較強(qiáng)和特異細(xì)胞和抗體反應(yīng)且安全、經(jīng)濟(jì)、易用的疫苗。發(fā)明概述本文描述了基于納米顆粒的組合物、藥盒和方法及平臺(tái)，用于體內(nèi)遞送抗原或編碼抗原的核酸到專職性apc(papc)以產(chǎn)生對(duì)該抗原的較強(qiáng)和特異免疫應(yīng)答。本文還描述了基于納米顆粒的組合物、藥盒、方法和平臺(tái)，用于遞送sirna給papc和遞送核酸、肽或蛋白給細(xì)胞(例如表達(dá)mhcii型的腫瘤細(xì)胞)。目前疫苗策略的一個(gè)主要缺陷在于其誘導(dǎo)包括調(diào)節(jié)t細(xì)胞在內(nèi)的抑制細(xì)胞。已知將抗原靶向遞送給papc可減少或阻止抑制機(jī)制激活，特別是調(diào)節(jié)t細(xì)胞的抑制機(jī)制。所述組合物、藥盒和方法包括聯(lián)用mhc靶向和免疫原性肽(例如padre、ha)與帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物(例如pamam和其他枝狀物)作為靶向遞送核酸、肽或多肽給特定細(xì)胞的載體，從而產(chǎn)生基于納米顆粒的新方法用于基因或蛋白免疫。本文所述的典型疫苗包括帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)mhc靶向和免疫原性肽如t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)、至少一種多肽抗原或編碼所述至少一種抗原的核酸、和任選的聚i-c。本文所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物有效結(jié)合帶負(fù)電的生物分子，包括dna、rna和其他。偶聯(lián)t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)的帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物提供了由于遞送特異抗原給papc而提高功效的疫苗。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，顯示首次使用padre以通過其結(jié)合mhcii型分子而靶向papc。本文所述實(shí)驗(yàn)描述了2種不同靶向肽的有效使用，所述肽的獨(dú)特特征是結(jié)合mhcii型。因此，本文所述疫苗、方法和組合物涵蓋所有mhcii型結(jié)合肽。本文所述疫苗、藥盒和組合物提供了體內(nèi)特異且有效轉(zhuǎn)染papc、和普遍的內(nèi)置通用t輔助活性，其引起自體papc成熟并因而產(chǎn)生較強(qiáng)和特異免疫應(yīng)答。枝狀物由于提供對(duì)大小和形狀的結(jié)構(gòu)性控制(負(fù)荷空間)而成為理想的dna遞送候選物，它們?yōu)樯锵嗳菪?無毒性和無免疫原性)，具有精確支架特性，具有針對(duì)特定靶向部分的明確表面可修飾功能，具有細(xì)胞粘附和內(nèi)吞作用及遞送到細(xì)胞質(zhì)或核的能力，具有可接受的生物降解性(在體內(nèi)安全降解的能力)，能簡單和持續(xù)地可重復(fù)(臨床級(jí))合成。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，偶聯(lián)dna、sirna、肽或多肽的帶正電、高度分支的聚合枝狀物包括在人和小鼠中都靶向apc并激活t輔助細(xì)胞的肽(例如padre肽或流感ha)。所述padre肽具有2個(gè)主要功能：因其結(jié)合papc上存在的mhcii型而護(hù)送dna到papc且它刺激t輔助細(xì)胞，該細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞毒性t細(xì)胞生成和抗體反應(yīng)所需的類型轉(zhuǎn)換。此新型納米構(gòu)建物具有基因和肽遞送及免疫的獨(dú)特性質(zhì)。本文所述實(shí)驗(yàn)也顯示偶聯(lián)padre的帶正電、高度分支的聚合枝狀物(pamam枝狀物)在治療性設(shè)定中使b16/lu8小鼠中已建立且高侵入性黑素瘤延遲生長并使其尺寸減小50％，在b16/ova預(yù)防性設(shè)定中顯示腫瘤100％消除，誘導(dǎo)針對(duì)免疫所用基因產(chǎn)物的強(qiáng)免疫應(yīng)答，證明在小鼠和人apc中的轉(zhuǎn)染效率提至2或3倍，體內(nèi)遞送編碼gfp的質(zhì)粒從而產(chǎn)生引流淋巴結(jié)，有效遞送sirna到人b細(xì)胞、t細(xì)胞、和鼠巨噬細(xì)胞。本文所述組合物和疫苗是特制的理想免疫平臺(tái)，因?yàn)樗鼈儼邢騧hcii型陽性細(xì)胞，其中所有或幾乎所有都是papc。然而，同樣重要的是mhcii型陽性細(xì)胞表達(dá)很重要的抑制或促進(jìn)t細(xì)胞激活的共抑制和共刺激分子(包括但不限于cd80、cd86、b7-h1、b7-h4、b7-dc、cd137、ox40、foxp3和其推定共刺激受體)。靶向調(diào)控這些途徑中相關(guān)分子的表達(dá)可用于i)癌癥、傳染病的免疫治療/接種或者其他新疫苗方法如針對(duì)成癮或不孕或中和對(duì)象中疾病誘導(dǎo)劑的疫苗接種，以及控制自身免疫。本文所述的將疫苗靶向遞送給apc通過產(chǎn)生強(qiáng)許多的免疫應(yīng)答、減少抑制/反饋機(jī)制、和降低疫苗劑量從而預(yù)防毒性，為與目前疫苗策略相關(guān)的挑戰(zhàn)提供解決方法。因此，本文所述疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種t輔助肽和編碼至少一種抗原的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和核酸的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種抗原的免疫應(yīng)答。在疫苗中，所述至少一種枝狀物能結(jié)合聚肌胞苷酸。該實(shí)施方式可包括藥學(xué)上可接受載體和/或油包水乳液。在一種實(shí)施方式中，所述至少一種t輔助肽是pan-dr表位(padre)，例如各具有seqidno:1所示氨基酸序列的2個(gè)padre表位。所述至少一種t輔助肽也可以是流感ha。所述核酸可以是表達(dá)載體且所述至少一種抗原可以是癌抗原或來自傳染性病原體的抗原。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物。本文還描述以下疫苗：該疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種t輔助肽和至少一種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。在一種實(shí)施方式中，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還偶聯(lián)不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。所述疫苗還可包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其上偶聯(lián)至少一種t輔助肽和不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述第二種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可結(jié)合聚肌胞苷酸。所述疫苗還可包括藥學(xué)上可接受載體和/或油包水乳液。所述至少一種t輔助肽可以是pan-dr表位，例如各具有seqidno:1所示氨基酸序列的2個(gè)pan-dr表位。在另一實(shí)施方式中，所述至少一種t輔助肽是流感ha。所述至少一種肽或多肽抗原可以是癌抗原或來自傳染性病原體的抗原。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物。本文還描述了將抗原遞送給哺乳動(dòng)物并誘導(dǎo)該哺乳動(dòng)物中生成針對(duì)所述抗原的單克隆抗體的方法。所述方法包括以下步驟：將含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種t輔助肽和至少一種肽或多肽抗原或所述至少一種抗原的編碼核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物、和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答，所述組合物的量有效誘導(dǎo)mhcii型介導(dǎo)的t輔助細(xì)胞激活，其中將所述組合物給予所述哺乳動(dòng)物導(dǎo)致生成針對(duì)所述至少一種肽或多肽抗原的單克隆抗體。在所述哺乳動(dòng)物患有癌癥的一種實(shí)施方式中，所述至少一種肽或多肽抗原是癌抗原，所述組合物是癌癥疫苗。通常，給予所述組合物在所述哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生局部不良反應(yīng)。在所述哺乳動(dòng)物患有傳染病的另一個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種肽或多肽抗原來自傳染性病原體，所述組合物是所述傳染性病原體的疫苗，通常在所述哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生局部不良反應(yīng)。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可結(jié)合聚肌胞苷酸和/或可包括一個(gè)藥學(xué)上可接受載體和/或油包水乳液。在本方法的一種實(shí)施方式中，所述至少一種t輔助肽是padre表位，例如各具有seqidno:1所示氨基酸序列的2個(gè)padre表位。所述至少一種t輔助肽也可以是流感ha。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還可偶聯(lián)不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。所述組合物還可包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種t輔助肽和不同于所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述第二種肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。在一個(gè)生產(chǎn)和收獲抗體的實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物可以是嚙齒類動(dòng)物或兔并從所述哺乳動(dòng)物中收獲單克隆抗體。在此實(shí)施方式中，所述單克隆抗體通過以下步驟制備：從所述哺乳動(dòng)物中收獲所述抗體，確定所述抗體效價(jià)，從所述哺乳動(dòng)物中取出脾，與骨髓瘤融合。所述抗體可人源化處理。本文還描述以下組合物：該組合物包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種t輔助肽和至少一種sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種sirna偶聯(lián)于所述帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是padre，所述sirna可針對(duì)例如ctla-4、foxp3、cd28、ido或精氨酸酶1。本文進(jìn)一步描述將sirna遞送給專職抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括以下步驟：提供含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種t輔助肽和至少一種sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種sirna偶聯(lián)于所述帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞；將所述組合物在一定條件下給予哺乳動(dòng)物對(duì)象，所述條件下偶聯(lián)至少一種t輔助肽和至少一種sirna的所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物結(jié)合專職抗原呈遞細(xì)胞且所述sirna進(jìn)入所述專職抗原呈遞細(xì)胞。所述帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre，所述sirna可針對(duì)例如ctla-4、foxp3、cd28、ido或精氨酸酶1。在一種實(shí)施方式中，所述sirna防止所述專職抗原呈遞細(xì)胞中的ctla-4、foxp3、cd28、ido或精氨酸酶1表達(dá)。本文還描述了在哺乳動(dòng)物中抑制mhcii型腫瘤細(xì)胞(例如淋巴瘤或淋巴瘤的部分)增殖或誘導(dǎo)mhcii型腫瘤細(xì)胞凋亡的方法。此方法包括以下步驟：將含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種t輔助肽且結(jié)合編碼蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯(lián)并結(jié)合于所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合mhcii型腫瘤細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物、和所述核酸或由核酸編碼的蛋白的組合抑制mhcii型腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)mhcii型腫瘤細(xì)胞凋亡。所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是例如pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre。然而，可使用任何適當(dāng)?shù)膸д?、高度分支的聚合枝狀物和t輔助肽。本文所述的遞送核酸給細(xì)胞的方法包括使所述細(xì)胞接觸含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)至少一種t輔助表位和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助表位和所述核酸偶聯(lián)于至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助表位特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種t輔助表位、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)化。在此方法中，所述肽或蛋白通常在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。盡管可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物和t輔助肽，所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是例如pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre。本文所述的用于遞送核酸給細(xì)胞的組合物包括至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)至少一種t輔助肽和和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)在化。所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre。然而，可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物和t輔助肽。除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的同樣含義。如本文所用，“核酸”或“核酸分子”指具有2個(gè)或更多核苷酸如rna(核糖核酸)和dna(脫氧核糖核酸)和化學(xué)修飾核苷酸的鏈?！凹兓焙怂岱肿釉谔烊划a(chǎn)生該核酸的細(xì)胞或生物中的其他核酸序列基本彼此分離(例如，30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、100％無污染物)。所述術(shù)語包括例如納入載體、質(zhì)粒、病毒或者原核或真核生物基因組的重組核酸分子。純化核酸的例子包括cdna、基因組核酸片段、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)生成的核酸、通過限制性酶處理基因組核酸形成的核酸、重組核酸、和化學(xué)合成的核酸分子?！爸亟M”核酸分子是通過人工組合原本獨(dú)立的2種序列區(qū)段制成，例如通過化學(xué)合成或通過遺傳工程技術(shù)操作分離的核酸區(qū)段。涉及肽、寡肽或蛋白中的氨基酸殘基時(shí)，術(shù)語“氨基酸殘基”、“氨基酸”和“殘基”可互換使用，且如本文所用指經(jīng)酰胺鍵或模擬酰胺鍵與至少一種其他氨基酸或氨基酸模擬物共價(jià)連接的氨基酸或氨基酸模擬物。如本文所用，“蛋白”和“多肽”同義使用，指任何氨基酸的肽接鏈，無論其長度或翻譯后修飾，例如糖基化或磷酸化。涉及核酸分子、多肽或傳染性病原體時(shí)，術(shù)語“天然”指自然產(chǎn)生的(例如野生型(wt))核酸、多肽或傳染性病原體。如本文所用，術(shù)語“抗原”或“免疫原”指由抗體特異性識(shí)別和結(jié)合的分子。涉及表位(例如t輔助表位)時(shí)，生物活性指能夠結(jié)合適當(dāng)mhc分子，且在肽用于刺激ctl反應(yīng)的情況下誘導(dǎo)針對(duì)靶抗原或抗原模擬物的t輔助反應(yīng)和ctl反應(yīng)。術(shù)語“特異結(jié)合”和“特異性結(jié)合”指在成對(duì)物質(zhì)如酶/底物、受體/激動(dòng)劑、抗體/抗原等之間發(fā)生的結(jié)合，所述結(jié)合可由共價(jià)或非共價(jià)相互作用或者共價(jià)和非共價(jià)相互作用的組合來介導(dǎo)。當(dāng)2種物質(zhì)相互作用產(chǎn)生非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物時(shí)，所述發(fā)生的結(jié)合通常是靜電、氫鍵或親脂相互作用的結(jié)果。因此，在產(chǎn)生結(jié)合復(fù)合物的2種物質(zhì)間的相互作用具有抗體/抗原或酶/底物相互作用的特征時(shí)，成對(duì)物質(zhì)間發(fā)生“特異結(jié)合”。具體地，所述特異結(jié)合的特征是配對(duì)的一個(gè)成員結(jié)合一種特定物質(zhì)且不結(jié)合該結(jié)合成員對(duì)應(yīng)物所屬化合物家族內(nèi)的其他物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“pan-dr表位”、“pan-hla-dr結(jié)合表位”、““padre”和““padre肽”指約4到約20個(gè)殘基的肽，其能以高親和力結(jié)合12個(gè)最常見dr等位基因(dr1、2w2b、2w2a、3、4w4、4w14、5、7、52a、52b、52c和53)中的至少約7個(gè)。“高親和力”在本文中定義為ic50％小于200nm的結(jié)合。例如，高親和力結(jié)合包括ic50％小于3100nm的結(jié)合。對(duì)于結(jié)合mhcii型，結(jié)合親和力閾值通常為1,000nm，結(jié)合親和力小于100nm一般被視作高親和力。美國專利號(hào)5,736,142詳述了padre肽的構(gòu)建和應(yīng)用，其通過引用納入本文。本文使用的“t輔助肽”指由t輔助細(xì)胞的t細(xì)胞受體識(shí)別的肽。例如，本文所述的padre肽是t輔助肽。如本文所用，術(shù)語“枝狀物”指帶電(例如，帶正電、帶負(fù)電)、大致呈球形的高度分支聚合大分子。帶正電、高度分支的聚合枝狀物的一個(gè)示例是pamam枝狀物。術(shù)語“pamam枝狀物”和“聚酰胺-胺枝狀物”指叔胺位于分支點(diǎn)且通過酰胺官能團(tuán)形成結(jié)構(gòu)層間連接的枝狀物類型。術(shù)語“pamam枝狀物”和“聚酰胺-胺枝狀物”指叔胺位于分支點(diǎn)且通過酰胺官能團(tuán)形成結(jié)構(gòu)層間連接的枝狀物類型。pamam枝狀物的表面顯示許多正電荷。術(shù)語“衍生枝狀物”指其表面偶聯(lián)一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的枝狀物?！皃adre衍生枝狀物”或“padre-枝狀物”是納米構(gòu)建物，其中一個(gè)或多個(gè)padre肽共價(jià)結(jié)合于帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如pamam枝狀物)表面的官能團(tuán)。術(shù)語“偶聯(lián)”指一個(gè)分子或試劑物理或化學(xué)連接或附于另一分子或試劑。偶聯(lián)的示例包括共價(jià)連接和靜電復(fù)合。術(shù)語“復(fù)合”、“與之復(fù)合”和“偶聯(lián)”在本文中可互換使用。如本文所用，短語“序列同一性”指對(duì)齊2種序列(例如，核酸序列、氨基酸序列)以最大化亞基匹配即考慮缺口和插入時(shí)，所述2種序列中對(duì)應(yīng)位置的相同亞基百分?jǐn)?shù)?？捎眯蛄蟹治鲕浖?例如加利福尼亞州圣地亞哥的accelryscgc公司的序列分析軟件包)測量序列同一性。短語“分離”或“生物純”指物質(zhì)幾乎或基本沒有其天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的正常伴隨成分。如本文所用，術(shù)語“納米顆粒”指大小以納米計(jì)的微觀粒子。例如，納米顆粒是padre-枝狀物偶聯(lián)物或是結(jié)合多個(gè)padre-枝狀物偶聯(lián)物與核酸或氨基酸物質(zhì)的顆粒，其總直徑范圍在約2-500nm范圍內(nèi)。術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體(mab)、嵌合抗體、人源化抗體、針對(duì)能以可溶或結(jié)合形式標(biāo)記的抗體的抗獨(dú)特型(抗id)抗體、以及其片段、區(qū)域或衍生物，其通過任何已知技術(shù)提供，例如但不限于酶切割、肽合成或重組技術(shù)。如本文所用，術(shù)語“佐劑”指可調(diào)節(jié)增強(qiáng)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“展示”或“表面暴露”視作同義詞，指抗原或其他分子存在于某一結(jié)構(gòu)如納米顆粒(例如padre-枝狀物)的外表面(例如易為免疫位點(diǎn)識(shí)別)。術(shù)語“多價(jià)”指納米顆粒上展示超過一個(gè)拷貝或類型的抗原或分子。如本文所用，“疫苗”包括所有預(yù)防和治療性疫苗。本文所述疫苗組合物適于以生物相容形式體內(nèi)給予對(duì)象。本文使用的表述“適于體內(nèi)給予的生物相容形式”指待給予的物質(zhì)形式，該形式的治療效果勝過任何毒性效果。所述物質(zhì)可給予任何動(dòng)物，例如人。在一些實(shí)施方式中，將本文所述的疫苗給予哺乳動(dòng)物例如嚙齒類動(dòng)物或兔，用于產(chǎn)生針對(duì)特定抗原的單克隆抗體。短語“免疫應(yīng)答”指誘導(dǎo)特異性針對(duì)一種或幾種抗原的抗體和/或免疫細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答取決于許多因素，包括受攻擊生物的免疫原性構(gòu)成、該抗原的化學(xué)組成和構(gòu)型、該抗原的給予方式和時(shí)間段。免疫應(yīng)答有許多面，其中一些由免疫系統(tǒng)細(xì)胞表現(xiàn)(例如b淋巴細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞)。免疫系統(tǒng)細(xì)胞可通過與抗原或免疫系統(tǒng)其他細(xì)胞的相互作用、釋放細(xì)胞因子和對(duì)所述細(xì)胞因子反應(yīng)而參與免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答一般分成2種主要類別—體液和細(xì)胞介導(dǎo)。免疫應(yīng)答的體液部分包括生成特異于抗原的抗體。細(xì)胞介導(dǎo)部分包括產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的遲發(fā)型超敏和細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞。短語“治療有效量”和“有效劑量”指足以產(chǎn)生治療上(例如臨床上)所需結(jié)果的量；所述結(jié)果的具體性質(zhì)根據(jù)治療疾病的性質(zhì)而變化。例如，待治療的疾病是癌癥時(shí)，所述結(jié)果可以是消除包括癌癥腫瘤在內(nèi)的癌細(xì)胞。本文所述的組合物和疫苗可以每天一次或多次到每周一次或多次給予。技術(shù)人員應(yīng)理解某些因素可影響有效治療對(duì)象所需的劑量和時(shí)間，包括但不限于疾病或紊亂的嚴(yán)重性、先前的治療、對(duì)象的總體健康和/或年齡、和存在的其他疾病。此外，用治療有效量的本發(fā)明組合物或疫苗治療對(duì)象可包括單一治療或系列治療。如本文所用，術(shù)語“治療”定義為將本文所述或由本文所述方法鑒定的治療劑施用于或給予患者，或?qū)⑺鲋委焺┦┯糜诨蚪o予患者的分離組織或細(xì)胞系，所述患者患有疾病、有疾病癥狀或易染病，目的是治愈、痊愈、緩解、減輕、改變、醫(yī)治、改良、改善或影響疾病、疾病癥狀或易染病傾向。術(shù)語“患者”、“對(duì)象”和“個(gè)體”在本文中可互換使用，指待治療的哺乳動(dòng)物對(duì)象，優(yōu)選人患者。在一些情況下，本發(fā)明的方法用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、獸醫(yī)應(yīng)用、開發(fā)疾病的動(dòng)物模型，包括但不限于嚙齒類動(dòng)物(包含小鼠、大鼠和倉鼠)以及非人靈長類動(dòng)物。下文描述合適的疫苗、組合物、藥盒和方法，但與本文所述相似或等同的疫苗、組合物、藥盒和方法也可用于本發(fā)明的實(shí)施或測試。本文述及的所有出版物、專利申請(qǐng)和專利都通過引用全文納入本文。如有沖突，以本說明書為準(zhǔn)，包括定義。下面討論的具體實(shí)施方式僅是說明性，并非旨在限制。附圖簡要說明圖1是padre-枝狀物的一對(duì)示意圖，所述枝狀物可混合質(zhì)粒或者連接肽或多肽抗原以靶向apc。圖1顯示本文所述的padre-枝狀物提供可納入任意感興趣抗原或編碼任意感興趣抗原的核酸的平臺(tái)。本文所述的padre-枝狀物是設(shè)計(jì)成被專職apc捕獲的先天免疫激活劑。圖2是一系列人b細(xì)胞的流式細(xì)胞分析點(diǎn)圖，顯示與紅色熒光標(biāo)記的短核酸序列復(fù)合的padre-枝狀物的體外遞送。此核酸是紅色標(biāo)記的dsrna寡聚物，設(shè)計(jì)用于rnai分析以促進(jìn)對(duì)sirna寡核苷酸遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的評(píng)估和優(yōu)化。細(xì)胞與padre-枝狀物/多核苷酸復(fù)合物或?qū)φ展才囵B(yǎng)4小時(shí)，然后去除培養(yǎng)基并加入新鮮培養(yǎng)基。所述圖像顯示用alexafuor標(biāo)記的dsrna寡聚物遞送到純化人b細(xì)胞內(nèi)。第4列最下方圖像顯示寡聚物遞送到約92％的細(xì)胞中。圖3是顯示體內(nèi)dna遞送padre-枝狀物的系列照片。將padre-枝狀物/gfp質(zhì)粒復(fù)合物注入皮膚(5μg總質(zhì)粒)和角膜(1μg/角膜)。拍攝活的麻醉小鼠的立體熒光顯微圖像。左圖顯示皮膚中的gfp表達(dá)，右圖顯示角膜中的gfp表達(dá)。圖4顯示治療小鼠中已建立的腫瘤。c57bl小鼠用編碼gfp(一次)或ova(二次)的質(zhì)粒皮下免疫。收集3只小鼠的血清并進(jìn)行elisa(左)或flisa(右)。圖5是顯示padre-枝狀物治療已建立腫瘤的一對(duì)圖。植入b16黑素瘤細(xì)胞(頂部)或tsa(底部)的小鼠在腫瘤移植后第2天或3天接種疫苗，接著在一周后加強(qiáng)免疫。圖6的流式細(xì)胞分析系列直方圖顯示與復(fù)合有padre-枝狀物的gfp質(zhì)粒(5μg)共培養(yǎng)后的gfp表達(dá)，下圖是人外周血單核細(xì)胞(pbmc)，上圖是人b細(xì)胞。左側(cè)直方圖為枝狀物/gfp質(zhì)粒復(fù)合物用作對(duì)照。圖7的流式細(xì)胞分析系列點(diǎn)圖顯示通過pdd體外遞送蛋白：白蛋白-fitc到人b細(xì)胞。左側(cè)圖像顯示pdd/白蛋白-fitc遞送到純化的人b細(xì)胞內(nèi)。收集人純化b細(xì)胞并與pdd/白蛋白-fitc共培養(yǎng)。左側(cè)直方圖顯示在pdd/白蛋白-fitc加入人b細(xì)胞后的早晨，人b細(xì)胞內(nèi)的白蛋白-fitc遞送。頂部直方圖顯示單獨(dú)的b細(xì)胞，中部直方圖顯示枝狀物/白蛋白-fitc復(fù)合物加入人b細(xì)胞，底部直方圖顯示pdd/白蛋白-fitc復(fù)合物加入人b細(xì)胞的結(jié)果。右側(cè)圖是加入pdd/白蛋白-fitc復(fù)合物1小時(shí)后b細(xì)胞攝取白蛋白的熒光顯微圖像。圖8的流式細(xì)胞分析系列點(diǎn)圖顯示淋巴結(jié)中體內(nèi)靶向dc。左圖示意顯示注入和取出淋巴結(jié)和分析的時(shí)間軸，右圖顯示對(duì)pdd/gfp質(zhì)?；蛑钗?gfp質(zhì)粒注射位點(diǎn)相鄰淋巴結(jié)細(xì)胞相對(duì)原初淋巴結(jié)所得數(shù)據(jù)分析的一對(duì)流式細(xì)胞分析點(diǎn)圖。這些圖像顯示淋巴結(jié)相鄰注射位點(diǎn)中padre-枝狀物體內(nèi)靶向小鼠dc和b細(xì)胞。淋巴細(xì)胞用cd11c(dc標(biāo)記)、mhcii型和cd20(b細(xì)胞標(biāo)記物)染色。右上方直方圖顯示注入枝狀物/gfp質(zhì)粒在約6％dc中引起gfp表達(dá)，而下方點(diǎn)圖清晰顯示注入pdd/gfp質(zhì)粒在>70％dc中引起gfp表達(dá)。圖9顯示帶有不同t輔助表位的枝狀物drha在淋巴結(jié)中體內(nèi)靶向dc，表明drha促進(jìn)gfp轉(zhuǎn)染到dc內(nèi)。此實(shí)驗(yàn)類似圖8所述，差異在于balb/c小鼠與偶聯(lián)iad限制性ha肽的枝狀物聯(lián)用。在注入drha/gfp質(zhì)?；蛑钗?gfp質(zhì)粒后第5天取出毗鄰drha/gfp質(zhì)?；蛑钗?gfp質(zhì)粒注射位點(diǎn)的淋巴結(jié)和原初淋巴結(jié)。所述圖表顯示針對(duì)dc用cd11c(dc標(biāo)記)染色后獲自淋巴結(jié)細(xì)胞的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。上圖顯示如所述處理的小鼠引流淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)的gfp陽性的dc數(shù)量。下圖顯示dc內(nèi)gfp的平均熒光強(qiáng)度。這些結(jié)果清楚表明drha不僅增加體內(nèi)轉(zhuǎn)染的dc數(shù)量，還提高進(jìn)入所述細(xì)胞的質(zhì)粒分子數(shù)。圖10是用與紅色(alexafluor)標(biāo)記dsrna寡聚物復(fù)合的padre-枝狀物轉(zhuǎn)染的人b細(xì)胞的顯微圖。圖11是用與紅色(alexafluor)標(biāo)記dsrna寡聚物復(fù)合的枝狀物轉(zhuǎn)染的狒狒pbmc(左圖)和用與紅色(alexafluor)標(biāo)記dsrna寡聚物復(fù)合的padre-枝狀物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(右圖)的一對(duì)顯微圖。在加入pdd/dsrna-alexa-fluor或?qū)φ諒?fù)合物到狒狒pbmc2小時(shí)后拍攝熒光顯微圖像。所述圖像顯示通過pdd靶向遞送多核苷酸到猴pbmc的高效性。圖12是用與gfp編碼質(zhì)粒復(fù)合的枝狀物轉(zhuǎn)染的狒狒pbmc(左圖)和用與gfp編碼質(zhì)粒復(fù)合的padre-枝狀物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(右圖)的一對(duì)顯微圖。用與gfp質(zhì)粒復(fù)合的枝狀物轉(zhuǎn)染狒狒pbmc(左圖)和用與gfp質(zhì)粒復(fù)合的padre-枝狀物轉(zhuǎn)染細(xì)胞(右圖)。在加入pdd/gfp質(zhì)?；?qū)φ諒?fù)合物到狒狒pbmc后1天拍攝熒光顯微圖像。所述圖像顯示通過pdd靶向遞送質(zhì)粒和質(zhì)粒所編碼基因表達(dá)的高效性。圖13的結(jié)果顯示用與質(zhì)粒(drp-ova質(zhì)粒)復(fù)合的padre-枝狀物單次dna免疫優(yōu)于質(zhì)粒(ep-ova質(zhì)粒)的體內(nèi)電穿孔。圖14是用免疫小鼠血清的in-cellwestern分析中多孔板的一對(duì)照片，顯示用pdd/質(zhì)粒-pcard抗原2次免疫后小鼠中誘導(dǎo)的高效價(jià)抗體反應(yīng)。多孔板含有用抗原編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞(左圖)和用對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的cos-7(右圖)。圖15是用免疫小鼠血清的in-cellwestern分析中多孔板的圖和系列照片，顯示用pdd/質(zhì)粒2次免疫后小鼠中誘導(dǎo)的高效價(jià)抗體反應(yīng)。還顯示了用與編碼gfp或ova的質(zhì)粒復(fù)合的padre-枝狀物免疫一次或者用與編碼ccr5、vgpcr、cathl或p2的質(zhì)粒復(fù)合的padre-枝狀物免疫二次后的in-cellwesternflisa結(jié)果。圖16是用免疫小鼠血清的in-cellwestern分析中多孔板的一對(duì)照片，顯示用pdd/質(zhì)粒-vgpcr免疫一次的小鼠中誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)在用pdd/質(zhì)粒-vgpcr第二次免疫后進(jìn)一步增強(qiáng)。這些結(jié)果顯示用pdd/質(zhì)粒-vgpcr單次免疫產(chǎn)生的抗體反應(yīng)在加強(qiáng)免疫時(shí)提高。圖17顯示g5枝狀物、偶聯(lián)物和肽的紫外可見光譜。圖18顯示在預(yù)防性設(shè)定中通過本文所述疫苗(padre-枝狀物/ova質(zhì)粒)消除b16/ova腫瘤。發(fā)明詳述本文描述了基于納米顆粒的疫苗、組合物、藥盒和方法，用于有效體內(nèi)遞送一種或多種免疫用抗原和生成抗體(例如單克隆抗體)，以及用于有效遞送肽、蛋白、sirna、rna或dna到papc或mhcii型陽性細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)。在典型疫苗或組合物中，帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物偶聯(lián)mhc靶向和免疫原性肽如t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha等)且與至少一個(gè)分子偶聯(lián)或結(jié)合以誘導(dǎo)對(duì)象中對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答。所述分子可以是細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物或病毒來源的蛋白或肽，或衍生自這些抗原的片段、碳水化合物、或碳水化合物模擬肽。所述分子也可包括用于治療自身免疫病的自體抗原。另外，所述抗原分子也可含有一種或多種核酸，包括哺乳動(dòng)物質(zhì)粒中編碼至少一種抗原的的核酸。例如，抗原可以是引起對(duì)象(例如哺乳動(dòng)物)中一種或多種免疫原性蛋白表達(dá)和誘導(dǎo)針對(duì)所表達(dá)蛋白的強(qiáng)烈和特異免疫應(yīng)答的一種或多種核酸。在另一個(gè)示例中，抗原也可以是經(jīng)加工并呈遞的免疫原性肽或多肽。帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物可偶聯(lián)二種或更多不同抗原，且類似地可偶聯(lián)各編碼不同抗原的二種或更多核酸。本文所述的疫苗或其他組合物可包括與一種抗原偶聯(lián)的多個(gè)帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如，與5拷貝特定抗原偶聯(lián)的5個(gè)枝狀物)，或與多個(gè)不同抗原偶聯(lián)的多個(gè)帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如，與5種不同抗原偶聯(lián)的5個(gè)枝狀物)。所述枝狀物基于該枝狀物(正電)與抗原(負(fù)電)的相反電荷而形成與抗原(核酸或蛋白)的復(fù)合物(偶聯(lián)物)，或所述偶聯(lián)可以是共價(jià)化學(xué)連接。在一種實(shí)施方式中，本文所述的基于納米顆粒體內(nèi)遞送抗原的方法包括注射疫苗，所述疫苗由與帶電(例如帶正電)的高度分支聚合枝狀物(例如padre衍生枝狀物(pdd))結(jié)合的抗原編碼dna質(zhì)粒、或與該枝狀物偶聯(lián)的抗原肽或多肽組成，所述枝狀物還偶聯(lián)mhc靶向和免疫原性肽如t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha等)。帶負(fù)電的質(zhì)粒自然結(jié)合帶正電的padre-枝狀物，而肽或多肽抗原若非帶負(fù)電則可化學(xué)連接padre-枝狀物。在其他實(shí)施方式中，枝狀物帶負(fù)電以結(jié)合帶正電的蛋白和肽。表面暴露的抗原或編碼抗原的核酸可通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法與所述枝狀物偶聯(lián)。偶聯(lián)方法包括離子或非離子性質(zhì)的化學(xué)復(fù)合、靜電結(jié)合或共價(jià)結(jié)合。如本文所述偶聯(lián)t輔助表位的枝狀物可以是多價(jià)的；它可在其表面呈遞超過一個(gè)拷貝或種類的抗原或核酸。呈遞多價(jià)或凝聚抗原(或編碼抗原的核酸)可改善對(duì)象的免疫應(yīng)答。一個(gè)或多個(gè)拷貝或種類的抗原或核酸可通過2個(gè)或更多單獨(dú)接頭或間隔件或者通過共同接頭或間隔件與枝狀物結(jié)合。本文所述組合物、藥盒和疫苗具有預(yù)防和治療性應(yīng)用，即可用作預(yù)防劑防止對(duì)象中疾病或病癥發(fā)生，以及治療患病或有病癥的對(duì)象。本文所述疫苗可用于產(chǎn)生免疫應(yīng)答抵御任何傳染性病原體或癌癥。本文所述治療劑可用于靶向單核細(xì)胞，特別是b細(xì)胞，且可用于治療并發(fā)的b細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤。本文所述的納米顆粒(例如padre衍生枝狀物)與治療劑(例如藥物)的組合可以多種形式使用，例如納米顆粒與治療劑的混合物，靜電結(jié)合以形成復(fù)合物，化學(xué)偶聯(lián)所述治療劑與納米顆粒等。治療劑的示例包括但不限于毒素、irna、sirna、微小rna、質(zhì)粒(例如編碼腫瘤抑制基因)、自殺基因(例如tk)或者阻斷或改變腫瘤增殖和/或存活的任何基因、(紫杉醇)(百時(shí)美施貴寶公司(bristol-myerssquibb))、抗體、美法侖、強(qiáng)的松、薩力多胺(mpt)、(硼替佐米)(千年制藥公司(milleniumpharmaceuticals))、來那度胺和地塞米松或這些試劑的任意組合。類似地，本文所述組合物和方法可用于治療自身免疫失調(diào)，其中所述治療劑到達(dá)(遞送到)免疫細(xì)胞，所述免疫細(xì)胞包括單核細(xì)胞、dc、t細(xì)胞或b細(xì)胞。本文所述組合物可與佐劑例如(但不限于)聚i:c一起使用，其帶負(fù)電且如本文所述與納米顆粒平臺(tái)形成復(fù)合物。下述優(yōu)選實(shí)施方式描述了這些組合物、疫苗、藥盒和方法的適應(yīng)性變化。然而，通過這些實(shí)施方式的描述，可基于下面描述形成和/或?qū)嵤┍景l(fā)明的其他方面。生物學(xué)方法本文描述了涉及常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)的方法。這類技術(shù)在本領(lǐng)域公知且在方法學(xué)專著中有詳述，如molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)第3版，第1-3卷，sambrook等編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，紐約州冷泉港，2001；currentprotocolsinmolecularbiology(《新編分子生物學(xué)操作》)，ausubel等編,紐約格林出版社和韋利科學(xué)出版社(greenepublishingandwiley-interscience)，1992(定期更新)。免疫學(xué)技術(shù)在本領(lǐng)域公知且在方法學(xué)專著中有詳述，如immunology(《免疫學(xué)》)第93卷，frederickw.alt編，學(xué)術(shù)出版公司(academicpress,inc.)，馬薩諸塞州伯靈頓，2007；makingandusingantibodies:apracticalhandbook(《抗體制作與使用：實(shí)用手冊(cè)》)，garyc.howard和matthewr.kaser編，crc出版社(crcpress)，佛羅里達(dá)州波卡拉頓，2006；medicalimmunology(《醫(yī)學(xué)免疫學(xué)》)第6版，gabrielvirella編，健康信息出版公司(informahealthcarepress)，英國倫敦，2007；harlow和lane的antibodies:alaboratorymanual(《抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約州冷泉港，1988。基因轉(zhuǎn)移和基因治療的常規(guī)方法也可調(diào)整用于本發(fā)明。參見例如genetherapy:principlesandapplications(《基因治療：原理和應(yīng)用》)，t.blackenstein編，施普林格出版公司(springerverlag)，1999；genetherapyprotocols(methodsinmolecularmedicine)(《基因治療方案(分子醫(yī)學(xué)方法)》)p.d.robbins編，美國休曼出版社(humanapress)，1997。生產(chǎn)疫苗和給予疫苗的方法也在本領(lǐng)域公知且詳述于例如vaccineprotocols(methodsinmolecularmedicine)(《疫苗方案(分子醫(yī)學(xué)方法)》)，andrewrobinson、martinp.cranage和michaelj.hudson，第2版，美國休曼出版社，新澤西州托托華，2003；vaccineadjuvantsanddeliverysystems(《疫苗佐劑和遞送系統(tǒng)》)，manmohansingh，第1版，約翰韋利公司，新澤西州霍伯肯，2007；arvina.m.和greenbergh.b.，virology344:240-249,2006；和r.morenweiser,genetherapy增刊1:s103-s110,2005。構(gòu)建和使用疫苗以及pamam枝狀物也描述于例如arashkia等，virusgenes40(1):44-52,2010；velders等，jimmunol.166:5366–5373,2001；和s.chauhan,n.k.jain,p.v.diwan.(2009)pre-clinicalandbehaviouraltoxicityprofileofpamamdendrimersinmice(“pamam枝狀物在小鼠中的臨床前和行為毒性分布”)，proceedingsoftheroyalsocietya:mathematical,physicalandengineeringsciences(《皇家學(xué)會(huì)論文集a：數(shù)學(xué)、物理和工程科學(xué)》)(在線出版日期：2009年12月3日)。偶聯(lián)核酸、肽或多肽的枝狀物的合成枝狀物作為支架集中dna，為和帶負(fù)電的dna或rna發(fā)生強(qiáng)靜電作用優(yōu)選完全帶正電的枝狀物。例如，所得枝狀物/t輔助表位/dna復(fù)合物具有的凈電荷取決于可調(diào)整的n/p比例(胺與磷酸根或電荷比)。本文所述枝狀物偶聯(lián)t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)和抗原、編碼抗原的核酸、或sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述抗原、核酸、或sirna偶聯(lián)于所述枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合papc。在一種實(shí)施方式中，枝狀物偶聯(lián)至少一個(gè)padre肽(例如2、3、4、5個(gè)等)和肽或多肽抗原。在此實(shí)施方式中，枝狀物通常偶聯(lián)或結(jié)合(例如通過靜電結(jié)合)多個(gè)所述肽或多肽抗原。當(dāng)抗原是小抗原(特別是小肽或碳水化合物)時(shí)，偶聯(lián)或結(jié)合數(shù)個(gè)抗原(例如多個(gè)相同抗原)可能特別有用，因?yàn)樾】乖ǔＳ捎诎肟乖嚓P(guān)大小問題而不能引發(fā)有效免疫應(yīng)答。因此在本文所述枝狀物/t輔助肽/核酸偶聯(lián)物中包括多拷貝的抗原可提高所述抗原的免疫原性。在另一實(shí)施方式中，枝狀物偶聯(lián)padre肽且結(jié)合編碼抗原的核酸。在另一實(shí)施方式中，枝狀物偶聯(lián)padre肽且結(jié)合針對(duì)感興趣基因的sirna。在這些實(shí)施方式中，可用任何合適方法制備所述枝狀物并偶聯(lián)t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)及結(jié)合核酸(例如dna、sirna)或肽或多肽。生成和使用枝狀物的方法在本領(lǐng)域熟知且已有描述，例如zhangj-t等，macromol.biosci.2004,4,575–578及美國專利號(hào)4,216,171和5,795,582，其都通過引用納入本文。也參見：d.a.tomalia,a.m.naylor和w.a.goddardiii，starburstdendrimers:molecular-levelcontrolofsize,shape,surfacechemistry,topology,andflexibilityfromatomstomacroscopicmatter(“星形枝狀物：分子水平控制大小、形狀、表面化學(xué)、拓?fù)鋵W(xué)和從原子到宏觀物質(zhì)的靈活性”)，angew.chem.int.ed.engl.29(1990)，138-175。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，使用pamam枝狀物。然而，可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物。其他帶正電、高度分支的聚合枝狀物的示例包括聚(丙烯亞胺)(ppi)枝狀物，或更普遍的是其表面具有伯胺基的任何其他枝狀物。本文所述padre枝狀物(padre衍生枝狀物)可通過任何合適方法制備。制作和使用padre的方法在本領(lǐng)域已知。參見例如美國專利號(hào)5,736,142。為生成美國專利號(hào)5,736,142所述padre肽，使用最初由jardetzky等(emboj.9:1797-1083,1990)描述的策略，將含有mhc結(jié)合關(guān)鍵側(cè)鏈的錨定殘基插入13個(gè)殘基的聚丙氨酸肽。例如，padre肽可根據(jù)美國專利號(hào)5,736,142所述方法制得，或可購得(例如來自anaspec公司，加利福尼亞州佛利蒙市)。由于尺寸相對(duì)較小，所述padre肽可根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中或固體支持物上合成。多種自動(dòng)化合成儀有市售且能根據(jù)已知操作使用?；蛘?，可使用重組dna技術(shù)，其中將編碼t輔助表位的核苷酸序列插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適宿主細(xì)胞中且在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)。這些過程在本領(lǐng)域公知，由sambrook等(同上)所綜述，其通過引用納入本文。本文所述padre肽可包括n和c末端殘基的修飾。技術(shù)人員應(yīng)理解可修飾n和c末端以改變所述肽的物理或化學(xué)性質(zhì)，例如用于影響結(jié)合、穩(wěn)定、生物利用度、易于連接性等。本文所述padre肽可以多種方式修飾以提供所需特性，例如改善藥理學(xué)特征，而同時(shí)保持未修飾肽的幾乎所有生物學(xué)活性。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，通過所述padre肽的–cooh末端與所述枝狀物某一胺基間的簡單酰胺偶聯(lián)來制成所述padre-枝狀物偶聯(lián)物。所述padre肽(ac-d-ala-lys-cha-val-ala-ala-trp-thr-leu-lys-ala-ala-ala-d-ala-ahx-cys-oh)(seqidno:1，ac＝乙?；?；d-ala＝d-丙氨酸；cha＝環(huán)己基丙氨酸；ahx＝氨基已酸)以乙?；问劫徸詀naspec公司(加利福尼亞州佛利蒙市)以保護(hù)胺基末端并防止其反應(yīng)。購買的肽具有95％的最小純度。所述酰胺偶聯(lián)反應(yīng)在dmf溶液中以標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行(參見圖1，底部示意圖)。為控制附于各枝狀物表面的padre表位數(shù)量，反應(yīng)中使用2:1的肽/枝狀物攻擊比，嘗試每個(gè)枝狀物僅結(jié)合幾個(gè)肽以使大部分胺基保持游離從而在該枝狀物上有大量正電荷。在典型實(shí)施方式中，本文所述的多個(gè)padre-枝狀物偶聯(lián)物是其上附有0、1、2、3個(gè)等padre(或其他肽)的枝狀物分布。預(yù)期相對(duì)群體遵循泊松分布。padre(akxvaawtlkaaa，seqidno:2)以高或中等親和力(ic50<1,000nm)結(jié)合16個(gè)最常見hla-dr分子中的15個(gè)((kawashima等，humanimmunology59:1-14(1998)；alexander等，immunity1:751-761(1994))。然而，在大多數(shù)人中還結(jié)合mhcii型并激活cd4t輔助細(xì)胞的其他肽也可用于標(biāo)記所述枝狀物。肽的示例包括但不限于破傷風(fēng)類毒素(tt)肽830-843；panina-bordignon等(eur.j.immunology19:2237-2242(1989))描述的“通用”表位；和與大部分人hla及許多小鼠的mhcii型反應(yīng)的以下肽：akfvaawtlkaaa(seqidno:3)、akyvaawtlkaaa(seqidno:4)、akfvaaytlkaaa(seqidno:5)、akxvaaytlkaaa(seqidno:6)、akyvaaytlkaaa(seqidno:7)、akfvaahtlkaaa(seqidno:8)、akxvaahtlkaaa(seqidno:9)、akyvaahtlkaaa(seqidno:10)、akfvaantlkaaa(seqidno:11)、akxvaantlkaaa(seqidno:12)、akyvaantlkaaa(seqidno:13)、akxvaawtlkaaa(seqidno:2)、akfvaawtlkaaa(seqidno:14)、akyvaawtlkaaa(seqidno:15)、akfvaaytlkaaa(seqidno:16)、akxvaaytlkaaa(seqidno:17)、akyvaaytlkaaa(seqidno:18)、akfvaahtlkaaa(seqidno:19)、akxvaahtlkaaa(seqidno:20)、akyvaahtlkaaa(seqidno:21)、akfvaantlkaaa(seqidno:22)、akxvaantlkaaa(seqidno:23)、和akyvaantlkaaa(seqidno:24)(a＝d-丙氨酸，x＝環(huán)己基丙氨酸)。可用表位的另一示例是結(jié)合小鼠balb/cmhcii型iad的ha肽序列sferfeifpke(seqidno:25)(來自前病毒pr8病毒ha)。所述產(chǎn)物通過相對(duì)純水透析來純化至少24小時(shí)且隨后在真空下干燥。通過1hnmr、紫外-可見光譜和maldi-tof質(zhì)譜鑒定所收集產(chǎn)物，清油。所述padre-枝狀物偶聯(lián)物的nmr譜顯示對(duì)應(yīng)于該枝狀物質(zhì)子的大峰和對(duì)應(yīng)所述肽質(zhì)子的一小組峰。所述padre-枝狀物偶聯(lián)物的maldi-tof質(zhì)譜在m/z比枝狀物自身觀察所得峰高約3,000個(gè)單位處顯示峰。超出的質(zhì)量對(duì)應(yīng)于約2個(gè)肽表位。所述偶聯(lián)物的紫外-可見光譜顯示在色氨酸吸收的波長范圍內(nèi)的明顯吸收。質(zhì)粒dna與所述padre-枝狀物偶聯(lián)物的復(fù)合通過將這2種成分在用pbs緩沖至生理ph的水溶液中混合來完成。典型n/p(胺對(duì)磷酸根)比是10:1。采用凝膠電泳顯示dna的完整復(fù)合。在生理ph值下，氨基(-nh2)質(zhì)子化，賦予所述枝狀物高正電荷且使其特別適于遞送帶負(fù)電的dna或rna到細(xì)胞中。在水溶液中，所述帶正電枝狀物和所述帶負(fù)電核酸產(chǎn)生可相對(duì)容易滲透并跨生物膜的凝聚物或納米顆粒。偶聯(lián)t輔助表位而不是padre的枝狀物一般通過與上述padre衍生枝狀物類似的方法制備。例如，所述肽的酸性末端與所述枝狀物表面胺基之一的共價(jià)結(jié)合可通過多種熟知的合成方法進(jìn)行，例如使用碳二亞胺作為活化劑的酰胺化。在另一例子中，用2種合成途徑使這些肽結(jié)合端氨基枝狀物。通過乙?；Ｗo(hù)所述肽表位的氨基末端。第1種途徑使用末端半胱氨酸殘基的羧酸以經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)酰胺化學(xué)實(shí)現(xiàn)結(jié)合。第2種途徑利用半胱氨酸的巰基(如存在于所述肽上，否則可加入)以使其與此前經(jīng)馬來酰亞胺處理加入所述枝狀物表面的烯烴基團(tuán)反應(yīng)。2種途徑都可用表位使枝狀物功能化。每枝狀物高至多個(gè)肽表位(例如2、3、4、5、6等)可提高dna遞送劑的靶向特性，改善其用于免疫目的性質(zhì)。然而，保留相當(dāng)數(shù)量未反應(yīng)胺基很重要，從而所述枝狀物通過在生理ph值下的質(zhì)子化獲得高正電荷。本文所述枝狀物可偶聯(lián)任意t輔助表位。t輔助表位的另一示例是流感ha。通常，本文所述組合物、藥盒和方法使用5代(g5)枝狀物。然而，可使用其他代枝狀物(見表1)。表1pamam枝狀物代分子量直徑(nm)表面基團(tuán)05171.5411,4302.2823,2562.91636,9093.632414,2154.564528,8265.4128658,05486.7256帶電聚合載體疫苗和組合物本文所述疫苗包括至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體如枝狀物，其偶聯(lián)或結(jié)合mhc靶向和免疫原性肽如t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)和至少一種肽或多肽抗原或者至少一種編碼所述至少一種抗原的核酸，使得所述至少一種mhc靶向和免疫原性肽和所述至少一種核酸或者至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)的外表面，且所述mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助肽)特異性結(jié)合papc。所述至少一種t輔助肽、至少一種枝狀物和至少一種肽或多肽抗原或至少一種編碼所述至少一種抗原的核酸的組合能誘導(dǎo)針對(duì)所述至少一種抗原的免疫應(yīng)答，包括誘導(dǎo)mhcii型介導(dǎo)的t輔助細(xì)胞活化。疫苗還可包括油包水乳液。將所述疫苗給予哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的單克隆抗體。本文所述位于枝狀物之上或之內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)抗原誘導(dǎo)免疫應(yīng)答抵御由不同致病條件引起的疾病發(fā)生。在一種實(shí)施方式中，所述抗原可源自但不限于致病細(xì)菌，真菌或病毒生物，鏈球菌(streptococcus)、念珠菌(candida)、布氏桿菌(brucella)、沙門氏菌(salmonella)、志賀氏菌(shigella)、假單胞菌(pseudomonas)、包特菌(bordetella)、梭菌(clostridium)、諾沃克病毒、炭疽桿菌(bacillusanthracis)、結(jié)核分支桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、人免疫缺陷病毒(hiv)、衣原體(chlamydia)、人乳頭瘤病毒、流感病毒、副粘病毒種、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、愛波斯坦-巴爾病毒、肝炎病毒、瘧原蟲(plasmodium)、毛滴蟲(trichomonas)、性傳播疾病致病劑、病毒性腦炎致病劑、原蟲病致病劑、真菌致病劑、細(xì)菌致病劑、癌細(xì)胞、或其混合物。所述至少一種枝狀物還可偶聯(lián)聚肌胞苷酸(poly(i:c))，所述疫苗或組合物還能包括藥學(xué)上可接受的載體。在一種實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)t輔助表位是pan-dr表位，例如各具有seqidno:1所示氨基酸序列的2個(gè)pan-dr表位。在另一實(shí)施方式中，所述t輔助表位是流感ha。然而，所述t輔助表位可以是激活或有助于激活cd4+t輔助細(xì)胞的任何表位。cd8t細(xì)胞的擴(kuò)張和刺激和b細(xì)胞生成抗體都需要t輔助表位激活cd4+t輔助細(xì)胞，兩者對(duì)于誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答抵御傳染劑或癌癥都至關(guān)重要。在所述枝狀物偶聯(lián)抗原編碼核酸的實(shí)施方式中，所述核酸一般是表達(dá)載體。所述表達(dá)載體通常包括與抗原編碼基因、克隆位點(diǎn)、聚腺苷酸化序列、可選擇標(biāo)記和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)操作性連接的真核啟動(dòng)子。通常，所述抗原是典型的癌抗原或來自傳染性病原體的抗原。所述至少一種枝狀物通常是g5枝狀物。類似地，在所述枝狀物偶聯(lián)肽或多肽抗原的實(shí)施方式中，所述抗原通常是癌抗原或來自傳染性病原體的抗原，所述至少一種枝狀物是g5枝狀物。在一些實(shí)施方式中，所述疫苗或組合物可納入佐劑。枝狀物是護(hù)送dna(和其他核酸，包括dna、rna、sirna、微小rna、rnai等)到細(xì)胞內(nèi)的有效載體。然而，枝狀物由于多種原因在作為疫苗遞送平臺(tái)方面歷來失敗。首先，枝狀物缺乏佐劑活性；它們?nèi)鄙傧忍烀庖叩挠行Т碳ぃ宜鼈儾划a(chǎn)生“危險(xiǎn)信號(hào)”。枝狀物也提供的apc靶向弱且通常適應(yīng)性免疫刺激較差。特別需要特異性靶向papc、誘導(dǎo)“危險(xiǎn)信號(hào)”、聚集專職性單核細(xì)胞到注射位點(diǎn)且安全的強(qiáng)佐劑疫苗遞送系統(tǒng)，在處理免疫原性較低的弱抗原或“自體”抗原或與免疫系統(tǒng)已發(fā)展出耐受性的“自體”抗原有高度同源性的抗原時(shí)尤其需要。弱抗原或免疫原性較低的抗原不產(chǎn)生或產(chǎn)生低水平特異性免疫應(yīng)答、抗體反應(yīng)或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。本文所述疫苗平臺(tái)是與dna或者肽或多肽抗原復(fù)合的生物可降解納米顆粒。所述平臺(tái)通過其mhcii型配體靶向papc，通過其高度帶正電外膜結(jié)合并透過所述細(xì)胞膜，其安全并易于規(guī)?；笈可a(chǎn)，且由于對(duì)所述分子的修飾性質(zhì)可作為強(qiáng)佐劑。在典型實(shí)施方式中，所述至少一種枝狀物是g5pamam枝狀物，它是高度分支的聚合大分子且由于其溶解度提高而是理想的賦形劑。g5對(duì)遞送dna到細(xì)胞中是特別理想的。本文所述典型疫苗包括油包水乳液，其誘導(dǎo)瞬時(shí)危險(xiǎn)信號(hào)從而聚集單核細(xì)胞到所述注射位點(diǎn)。這些細(xì)胞在接受dna后來到局部淋巴結(jié)并呈遞抗原。含有結(jié)合mhcii型分子側(cè)翼的通用t輔助激動(dòng)劑如padre可集中枝狀物復(fù)合物用于papc以及輔助t細(xì)胞。此改變使惰性和弱枝狀物成為所表達(dá)感興趣抗原的強(qiáng)免疫增強(qiáng)劑。含有具佐劑活性以及貯存效果的疏水載體即油乳液(例如montanideisa720)引起抗原緩慢釋放。含有poly(i:c)進(jìn)一步增強(qiáng)誘導(dǎo)針對(duì)感興趣抗原的免疫應(yīng)答。由于poly(i:c)具有負(fù)凈電荷，其容易結(jié)合枝狀物，且是提高免疫應(yīng)答強(qiáng)度的佐劑。這些特征作為強(qiáng)“危險(xiǎn)信號(hào)”并聚集更多單核細(xì)胞(包括apc)到所述注射位點(diǎn)。總體上，這些特征刺激先天免疫并使誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答所需的促炎細(xì)胞因子環(huán)境表達(dá)增加。在疫苗的一種實(shí)施方式中，所述t輔助肽是padre表位且所述枝狀物是padre衍生的。padre是結(jié)合大部分mhcii型的人工設(shè)計(jì)肽，padre肽偶聯(lián)枝狀物(例如padre衍生枝狀物)使所得復(fù)合物或偶聯(lián)物成為表達(dá)高水平mhcii型的papc的配體。因而此復(fù)合物成為對(duì)表達(dá)mhcii型或papc的細(xì)胞有高親和力的通用靶向疫苗遞送系統(tǒng)。padre也激活t輔助細(xì)胞且產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子環(huán)境，聚集其他免疫細(xì)胞到注射位點(diǎn)。結(jié)合枝狀物后，padre還可通過誘導(dǎo)“危險(xiǎn)信號(hào)”提高抗原吸收。padre衍生枝狀物提供優(yōu)于當(dāng)前已知疫苗的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，g5枝狀物是高度帶電、可生物降解分子，能結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞膜而非常有效地產(chǎn)生強(qiáng)蛋白表達(dá)。其次，padre是結(jié)合許多小鼠和人mhcii型分子的通用t輔助表位。它是合成的非天然t輔助表位[akchxavaawtlkaaa(seqidno:26)(chxa＝環(huán)己基丙氨酸)]。當(dāng)融合所述枝狀物表面時(shí)，padre結(jié)合并激活具有mhcii型的原代細(xì)胞，包括所有papc。各枝狀物可結(jié)合多個(gè)padre表位(例如2、3、4、5個(gè)等)。用適當(dāng)間隔件完成所述結(jié)合以保留賦予所述肽免疫原性的結(jié)合性質(zhì)?？刹捎媒宇^或間隔分子偶聯(lián)抗原或其他分子與本文所述枝狀物偶聯(lián)物。間隔件可以是氨基酸的任意組合，包括aaa、kk、gs、gsggggs(seqidno:27)、rs或aay。如本文所用，術(shù)語“接頭”或“間隔件”指介于所述枝狀物與所述表面暴露分子如mhcii型配體、cd4+t輔助表位、多肽、或者偶聯(lián)或結(jié)合所述枝狀物(例如padre-枝狀物)和表面暴露分子的治療劑之間的化學(xué)基團(tuán)。接頭優(yōu)選一端偶聯(lián)所述表面分子且另一端偶聯(lián)所述納米顆粒(例如padre-枝狀物)。鏈接可以用同或異雙功能試劑進(jìn)行，即spdp、dss、siab。dejongh等在pct/dk00/00531(wo01/22995)公開了連接方法，其通過引用全文納入本文。第三，在所述疫苗也包括油包水乳液的實(shí)施方式中，所述油包水乳液誘導(dǎo)瞬時(shí)“危險(xiǎn)信號(hào)”使得單核細(xì)胞聚集于所述注射位點(diǎn)。這些細(xì)胞在接受dna后來到局部淋巴結(jié)并呈遞抗原。此外，為進(jìn)一步提高誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，合成的雙鏈rna(dsrna)poly(i:c)可結(jié)合所述枝狀物(例如padre-枝狀物)。poly(i:c)是具有負(fù)電荷的toll樣受體3(tlr-3)激動(dòng)劑并因而易結(jié)合枝狀物。poly(i:c)是佐劑且由于其負(fù)電荷可結(jié)合所述枝狀物并提高免疫應(yīng)答強(qiáng)度。poly(i:c)與枝狀物的結(jié)合對(duì)單克隆抗體的生產(chǎn)(下述)特別有用，因?yàn)槠錅p少注射頻率和間隔。本文所述編碼抗原的核酸可以是rna形式(例如mrna、微小rna、sirna、shrna或合成的化學(xué)修飾rna)或dna形式(例如cdna、基因組dna和合成dna)。所述dna可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈則可以是編碼(有義)鏈或非編碼(反義)鏈。在一種實(shí)施方式中，核酸可以是從永生化或原代腫瘤細(xì)胞系中分離或擴(kuò)增的rna分子。如上所述，在一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗包括至少一種枝狀物，其偶聯(lián)至少一種t輔助表位和編碼抗原的核酸，其中所得復(fù)合物誘導(dǎo)針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答。與需要使用例如病毒載體或體內(nèi)電穿孔的其他基因免疫方法相比，這些組合物和方法安全、簡單、迅速許多。使用dna誘導(dǎo)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。首先，使用dna提供全譜原初(天然)加工表位。枝狀物與t輔助表位和抗原編碼核酸的偶聯(lián)也提供通用疫苗遞送靶向所有人mhc(aka,hla)中>95％的apc且不再需要純化難以提純的蛋白。這類蛋白可以是多蛋白復(fù)合物的一部分，可以是膜蛋白，且可以是不正確折疊和不溶的。本文所述枝狀物偶聯(lián)物不需要蛋白的糖基化或翻譯后修飾，它們標(biāo)記蛋白結(jié)構(gòu)或折疊的干擾，大幅節(jié)約成本和時(shí)間。padre-枝狀物靶向并遞送核酸到小鼠、狒狒和人的pbmc，使得此平臺(tái)成為從小鼠到非人靈長類動(dòng)物和人的快速翻譯研究的理想候選。同樣如上所述，在另一實(shí)施方式中，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的疫苗包括油包水乳液和至少一種枝狀物，其偶聯(lián)至少一種t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)和一種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助表位和所述肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述枝狀物外表面且能誘導(dǎo)針對(duì)所述肽或多肽抗原的免疫應(yīng)答。具有弱免疫原性的肽或多肽如本文所述偶聯(lián)(復(fù)合)t輔助表位/枝狀物復(fù)合物時(shí)誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答。帶負(fù)電荷的多肽和肽可與例如padre-枝狀物復(fù)合，而不需要共價(jià)結(jié)合。例如，padre-枝狀物的油包水乳液產(chǎn)生進(jìn)一步的佐劑活性和貯存效果。如上所示，本文所述組合物和疫苗具有預(yù)防和治療性應(yīng)用；它們可用于預(yù)防或防止對(duì)象中疾病或病癥發(fā)生以及治療患病或具有病癥的對(duì)象。本文所述疫苗可用于引起免疫應(yīng)答抵御任何傳染性病原體或癌癥。傳染性病原體的示例包括病毒，例如但不限于流感、hiv、登革病毒、輪狀病毒、hpv、hbv、hcv、cmv、hsv、hzv和ebv，以及病原體，包括瘧疾的致病劑，惡性瘧原蟲(plasmodium(p)falciparum)、三日瘧原蟲(p.malariae)、卵形瘧原蟲(p.ovale)、間日瘧原蟲(p.vivax)和諾氏瘧原蟲(p.knowlesi)；包括利什曼原蟲(leishmania(l))的致病劑，碩大利什曼原蟲(l.major)、熱帶利什曼原蟲(l.tropica)、埃塞俄比亞利什曼原蟲(l.aethiopica)、墨西哥利什曼原蟲(l.mexicana)、杜氏利什曼原蟲(l.donovani)、嬰兒利什曼原蟲(l.infantum)同恰氏利什曼原蟲(l.chagas)；包括炭疽桿菌、百日咳桿菌(bordetellapertussis)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumonia)和腦膜炎球菌(meningococcus)在內(nèi)的病原細(xì)菌。在本文所述實(shí)驗(yàn)中，padre-枝狀物消除小鼠中已建立的黑素瘤。然而，本文所述與t輔助肽和抗原或抗原編碼核酸偶聯(lián)的枝狀物可用于產(chǎn)生針對(duì)任何癌癥的特異性免疫應(yīng)答。其他癌癥的示例包括hpv引起的宮頸癌(例如e7/e7腫瘤相關(guān)抗原(taa)或編碼這些抗原的質(zhì)粒可復(fù)合本文所述t輔助表位/枝狀物(例如padre-枝狀物))、人黑素瘤(例如trp-1、trp-2、gp-100、mage-1、mage-3和/或p53可用作taa且復(fù)合本文所述t輔助表位/枝狀物(例如padre-枝狀物))、和前列腺癌(例如tsa可用作taa且復(fù)合本文所述t輔助表位/枝狀物(例如padre-枝狀物))。對(duì)于肺腫瘤、乳腺腫瘤和白血病也類似，可使用任意合適taa，許多已有描述。許多這種taa在不同癌癥中共有(例如cea、muc-1、her2、cd20)。taa或編碼這些抗原的質(zhì)粒的混合物可用于制成本文所述通用、多用途癌癥疫苗。在本文所述疫苗的一個(gè)示例中，cd4表位/枝狀物(例如padre-枝狀物)可復(fù)合超過一種抗原或超過一種編碼所述抗原的質(zhì)粒?；蛘撸髋c一種抗原或編碼一種抗原的一種質(zhì)粒復(fù)合的多個(gè)疫苗可用作不同病原體或不同癌癥的疫苗。將抗原遞送給哺乳動(dòng)物并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法本文描述了將抗原遞送給哺乳動(dòng)物(例如人)并誘導(dǎo)生產(chǎn)針對(duì)該抗原的單克隆抗體以引起所述哺乳動(dòng)物中免疫應(yīng)答的方法。一種典型的方法包括以下步驟：將含有至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述載體偶聯(lián)有mhc靶向和免疫原性肽(例如，t輔助肽如padre肽或流感ha等)和至少一種肽或多肽抗原或者至少一種編碼所述至少一種抗原的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種核酸或者至少一種肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)的外表面，使得所述至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助肽)特異性結(jié)合papc且所述至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助肽)、至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)和所述至少一種核酸或者至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在此方法中，所述組合物給予的量有效誘導(dǎo)mhcii型介導(dǎo)的t輔助細(xì)胞激活，在所述哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生單克隆抗體和針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。組合物還可包括油包水乳液。所述至少一種枝狀物通常還偶聯(lián)poly(i:c)，所述組合物通常還包括藥學(xué)上可接受載體。所述至少一種t輔助表位可以是pan-dr表位，例如各具有seqidno:1氨基酸序列的2個(gè)pan-dr表位。或者，所述至少一種t輔助表位可以是除了pan-dr以外的表位(padre表位)，例如流感ha。通常，所述至少一種枝狀物是g5枝狀物。在一種實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物患有癌癥，所述抗原是癌抗原，所述組合物是所述癌癥的疫苗。在另一實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物患有傳染病，所述抗原是來自傳染性病原體的抗原，所述組合物是所述傳染性病原體的疫苗。在這類實(shí)施方式中，給予所述組合物通常在哺乳動(dòng)物中不產(chǎn)生局部不良反應(yīng)。這些方法通常通過在所述哺乳動(dòng)物外制成所述組合物(例如疫苗)并將所述組合物給予所述哺乳動(dòng)物來進(jìn)行，所給予的量足以在所述哺乳動(dòng)物中刺激免疫應(yīng)答抵御所述抗原，例如癌抗原或來自傳染性病原體的抗原。本文所述組合物、疫苗和方法可用于任何合適對(duì)象，例如動(dòng)物如哺乳動(dòng)物(例如人類、嚙齒類、狗、貓、山羊、綿羊、牛、馬等)?；加邪┌Y或傳染病或者具有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的人類病人是典型對(duì)象。遞送sirna到papc的組合物和方法本文也描述遞送sirna到papc的組合物和方法。在一種典型實(shí)施方式中，遞送sirna到papc的組合物包括至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)，其偶聯(lián)有至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助肽)和sirna。所述至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助表位)和所述sirna偶聯(lián)于所述至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)的外表面，從而所述至少一種t輔助表位特異性結(jié)合papc。所述sirna可針對(duì)(特異于)任何感興趣的基因(例如foxp3、cd-28、ctla-4)。所述組合物還可包括油包水乳液。遞送sirna到papc的典型方法包括以下步驟：提供含有至少一種枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)有至少一種t輔助肽和至少一種sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種sirna偶聯(lián)于所述枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助表位特異性結(jié)合papc；將所述組合物在一定條件下給予哺乳動(dòng)物，該條件下偶聯(lián)有至少一種t輔助肽和至少一種sirna的所述至少一種枝狀物結(jié)合papc且所述sirna進(jìn)入所述papc并在所述papc內(nèi)表達(dá)。所述組合物還可包括油包水乳液。在此方法中，所述sirna可針對(duì)(特異于)任何感興趣的基因(例如foxp3)以使感興趣基因的表達(dá)沉默。在一個(gè)示例中，用針對(duì)foxp3的sirna使foxp3的表達(dá)沉默，foxp3是誘導(dǎo)調(diào)節(jié)t細(xì)胞的分子，該細(xì)胞抑制免疫應(yīng)答并作為免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)。此實(shí)施方式對(duì)癌癥治療特別有用，其中調(diào)節(jié)t細(xì)胞抑制免疫治療和干預(yù)。調(diào)節(jié)t細(xì)胞表達(dá)mhcii型且可通過padre-枝狀物或其他cd4表位-枝狀物而靶向。另一個(gè)示例是cd4t細(xì)胞上傳遞抑制信號(hào)給t細(xì)胞的ctla-4。在ctla-4特異性sirna復(fù)合padre-枝狀物的實(shí)施方式中，所述復(fù)合物靶向含cd4t細(xì)胞的mhcii型表達(dá)細(xì)胞并使ctla-4表達(dá)沉默。ctla-4表達(dá)越低則針對(duì)病原體或癌癥的免疫應(yīng)答越高，且當(dāng)遞送到papc中時(shí)其防止或減少免疫應(yīng)答抑制分子的表達(dá)(或當(dāng)宿主進(jìn)行免疫接種時(shí)，提高針對(duì)病原體、癌癥的免疫應(yīng)答)或者提高免疫應(yīng)答，包括b7.1、lfa-3、icam-1(誘導(dǎo)t細(xì)胞活化所需的信號(hào)2)，用于治療自身免疫病如銀屑病。在典型實(shí)施方式中，本文所述組合物包括的sirna特異于共抑制和共刺激分子及其推定的共刺激受體(例如foxp3、cd28、ctla-4)。序列特異性sirna結(jié)合靶核酸分子，抑制其表達(dá)。sirna有效處理異常細(xì)胞、異常細(xì)胞生長和腫瘤，包括由傳染性致病劑導(dǎo)致的腫瘤。提供了遞送sirna的組合物和其治療方法。本領(lǐng)域已知構(gòu)建和使用核酶、sirna和反義分子的方法(例如，isakay.，curropinmolther第9卷:132-136,2007；sioudm.和iversenp.o.，currdrugtargets第6卷:647-653,2005；mouldysioud的ribozymesandsirnaprotocols(methodsinmolecularbiology)(《核酶和sirna方案(分子生物學(xué)方法)》)第2版，2004，美國休曼出版社，紐約州紐約市)。“反義”核酸可包括與編碼蛋白的“有義”核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，例如與雙鏈cdna分子編碼鏈互補(bǔ)或與mrna序列互補(bǔ)。所述反義核酸可與感興趣基因的完整編碼鏈或僅其中一部分互補(bǔ)。在另一實(shí)施方式中，所述反義核酸分子與編碼感興趣基因的核苷酸序列編碼鏈的“非編碼區(qū)”(例如5'和3'非翻譯區(qū))反義。反義試劑可包括例如約8到約80個(gè)核堿基(即約8到約80個(gè)核苷酸)，如約8到約50個(gè)核堿基，或約12到約30個(gè)核堿基。反義化合物包括核酶、外部指導(dǎo)序列(egs)寡核苷酸(寡核苷酸酶)、和其他與靶核酸雜交并調(diào)節(jié)其表達(dá)的催化性短rna或催化性寡核苷酸。反義化合物可包括至少8個(gè)連續(xù)核堿基的延伸，其與靶基因(即感興趣基因)序列互補(bǔ)。寡核苷酸不必與其可特異性雜交的靶核酸序列100％互補(bǔ)。當(dāng)寡核苷酸與靶標(biāo)的結(jié)合干擾所述靶分子正常功能引起功能喪失，并存在足夠的互補(bǔ)度以防止所述寡核苷酸在特異性結(jié)合所需條件下與非靶標(biāo)序列非特異性結(jié)合時(shí)，寡核苷酸是可特異性雜交的，特異性結(jié)合所需條件在體內(nèi)分析或治療性處理的情況下即生理?xiàng)l件，或者在體外分析的情況下即進(jìn)行所述分析的條件。rna干擾(rnai)是顯著有效過程，其中雙鏈rna(dsrna，本文中也稱小干擾rna為sirna，或者稱雙鏈小干擾rna為dssirna)在動(dòng)物和植物細(xì)胞中誘導(dǎo)序列特異性同源mrna降解(hutvagner和zamore，curr.opin.genet.dev.，12:225-232(2002)；sharp，genesdev.，15:485-490(2001))。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可通過雙股小干擾rna引發(fā)rnai(sirna)(chiu等，mol.cell.，10:549-561(2002)；elbashir等，nature，411:494-498(2001))，或是通過微小rna(mirna)、功能性小發(fā)夾rna(shrna)、或用dna模板與rna聚合酶iii啟動(dòng)子在體內(nèi)表達(dá)的其他dsrna(zeng等，mol.cell，9:1327-1333(2002)；paddison等，genesdev.，16:948-958(2002)；lee等，naturebiotechnol.，20:500-505(2002)；paul等，naturebiotechnol.，20:505-508(2002)；tuschl,t.，naturebiotechnol.，20:440-448(2002)；yu等，proc.natl.acad.sci.usa，99(9):6047-6052(2002)；mcmanus等，rna，8:842-850(2002)；sui等，proc.natl.acad.sci.usa，99(6):5515-5520(2002))。所述dsrna分子通常每條鏈包括16-30個(gè)核苷酸，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)，其中一條鏈與所述mrna中的靶區(qū)域基本相同，例如至少80％(或更多，例如85％、90％、95％或100％)相同，例如有3、2、1或0個(gè)錯(cuò)配核苷酸，而另一條鏈與第一條鏈相同或基本相同。每條鏈也可具有一個(gè)或多個(gè)突出端(即非互補(bǔ))核苷酸，例如1、2、3、4個(gè)或更多突出端核苷酸，如dtdtdt。所述dsrna分子可化學(xué)合成，或者可從dna模板體外轉(zhuǎn)錄或從例如shrna體內(nèi)轉(zhuǎn)錄?？捎帽绢I(lǐng)域任何已知方法設(shè)計(jì)所述dsrna分子；本領(lǐng)域已知多種算法，參見例如tuschl等，genesdev13(24):3191-7(1999)，且許多可在網(wǎng)上獲得。陰性對(duì)照sirna通常與所選sirna具有相同的核苷酸組成，但與所述合適基因組沒有顯著的序列互補(bǔ)性。這種陰性對(duì)照可通過隨機(jī)置亂所選sirna核苷酸序列來設(shè)計(jì)；可進(jìn)行同源性搜索以確保陰性對(duì)照不與所述合適基因組中任何其他基因同源。此外，可通過將一個(gè)或多個(gè)堿基錯(cuò)配引入序列來設(shè)計(jì)陰性對(duì)照sirna。在一些實(shí)施方式中，sirna可用修飾核苷酸(例如2f-rna)生成以使該sirna抗核酸酶。產(chǎn)生抗體的方法和藥盒本文描述了產(chǎn)生抗體的方法和藥盒，所述抗體可給予對(duì)象用于治療或預(yù)防性目的。目前遞送dna到細(xì)胞的方法效率低、復(fù)雜且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答弱。然而，本文所述組合物和方法引起的強(qiáng)抗體反應(yīng)顯示快速和高表達(dá)感興趣抗原。在一個(gè)產(chǎn)生抗體的方法中，本文所述枝狀物/t輔助肽偶聯(lián)物(例如padre-枝狀物)可與肽或多肽或核酸(例如dna)復(fù)合(偶聯(lián))。poly(i:c)與枝狀物的結(jié)合對(duì)產(chǎn)生單克隆抗體特別有用，因?yàn)樗鼫p少注射間的頻率和間隔。在下述實(shí)驗(yàn)中，單次注入復(fù)合dna的padre-枝狀物后，顯示gfp在角膜和皮膚中的遞送和表達(dá)以及強(qiáng)體液反應(yīng)。目前50％的藥物靶向最難以純化的膜蛋白。本文所述組合物、藥盒和方法提供靶向難以純化蛋白的工具而不需純化它們。多克隆抗體是在免疫動(dòng)物血清內(nèi)包含的異質(zhì)抗體分子群。因此，可用本文所述組合物、藥盒和方法生成的抗體包括多克隆抗體，以及單克隆抗體、單鏈抗體、fab片段、f(ab')2片段、和用fab表達(dá)庫生成的分子。單克隆抗體是特定抗原的同質(zhì)抗體群，可用本文所述枝狀物/t輔助表位偶聯(lián)物和標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)制備(參見例如kohler等，nature256:495，1975；kohler等，eur.j.immunol.6:511,1976；kohler等，eur.j.immunol.6:292,1976；hammerling等，monoclonalantibodiesandtcellhybridomas(《多克隆抗體和t細(xì)胞雜交瘤》，紐約愛思唯爾公司(elsevier)，1981；ausubel等，同上)。具體地，可通過生成抗體分子的任何技術(shù)獲得單克隆抗體，用例如kohler等，nature256:495，1975和美國專利號(hào)4,376,110所述的培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞系；人b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kosbor等，immunologytoday4:72,1983；cole等，proc.natl.acad.sci.usa80:2026，1983)和ebv-雜交瘤技術(shù)(cole等，monoclonalantibodiesandcancertherapy(《單克隆抗體和癌癥治療》)，arl公司(alanr.liss)，第77-96頁，1983)。這些抗體可以是任何免疫球蛋白種類，包括igg、igm、ige、iga、igd和其任意亞類。如本文所述產(chǎn)生mab的雜交瘤可在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)生成高效價(jià)mab的能力使得本文所述組合物、藥盒和方法對(duì)于mab生成特別有用。本文所述組合物、藥盒和方法中枝狀物/t輔助肽(例如padre-枝狀物)與編碼蛋白或抗原的核酸復(fù)合(偶聯(lián)或結(jié)合)而無需純化蛋白或抗原，因?yàn)樗鼍幋a抗原或蛋白的核酸(例如質(zhì)粒dna或mrna)提供以下優(yōu)點(diǎn)：i)免除冗長和/或昂貴和/或費(fèi)時(shí)的蛋白純化步驟，ii)通過宿主的細(xì)胞機(jī)制體內(nèi)表達(dá)所述蛋白的天然形式，避免常規(guī)蛋白純化所得蛋白非天然形式的問題，和ii)產(chǎn)生治療性單克隆抗體的理想方法，其中所述靶標(biāo)是所述蛋白或抗原的自然/天然形式。通過應(yīng)用已知技術(shù)以在動(dòng)物如小鼠中生成人抗體，可制得針對(duì)特定抗原的人抗體。參見例如fishwild,d.m.等，naturebiotechnology14(1996):845-851；heijnen,i.等，journalofclinicalinvestigation97(1996):331-338；lonberg,n.等，nature368(1994):856-859；morrison,s.l.，nature368(1994):812-813；neuberger,m.，naturebiotechnology14(1996):826；美國專利號(hào)5,545,806；5,569,825；5,877,397；5,939,598；6,075,181；6,091,001；6,114,598；和6,130,314。通過應(yīng)用已知方法如美國專利號(hào)5,530,101、5,585,089、5,693,761和5,693,762所述，可從非人抗體制得針對(duì)特定抗原的類人或人源化抗體。一旦生成多克隆或單克隆抗體，可通過蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀分析經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法或其他合適方法測試所述抗體的特異性抗原識(shí)別，例如ausubel等，同上所述?？赏ㄟ^系列注射產(chǎn)生抗血清，優(yōu)選包括至少3次加強(qiáng)注射?？赏ㄟ^已知技術(shù)生成識(shí)別并結(jié)合特異表位的抗體片段。例如，這類片段包括但不限于可通過胃蛋白酶消化所述抗體分子產(chǎn)生的f(ab')2片段、可通過還原f(ab')2片段二硫橋產(chǎn)生的fab片段?；蛘撸蓸?gòu)建fab表達(dá)庫(huse等，science246:1275，1989)以快速和簡單鑒定具有所需特異性的單克隆fab片段。遞送抗原給哺乳動(dòng)物并在該哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)所述抗原的單克隆抗體以獲得單克隆抗體的典型方法包括將含有至少一種枝狀物的組合物給予哺乳動(dòng)物，所述枝狀物偶聯(lián)有至少一種t輔助肽和肽或多肽抗原或者編碼所述抗原的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸或者肽或多肽抗原偶聯(lián)于所述至少一種枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合papc且所述至少一種t輔助肽、至少一種枝狀物和所述核酸或者肽或多肽抗原的組合能誘導(dǎo)針對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。在此方法中，所述組合物給予的量有效誘導(dǎo)mhcii型介導(dǎo)的t輔助細(xì)胞激活，導(dǎo)致產(chǎn)生針對(duì)該抗原的單克隆抗體。在小鼠內(nèi)生成抗體的方法中，如上所述用抗原免疫小鼠后，從一只或多只小鼠中收獲抗體并篩選高效價(jià)。選擇具有高效價(jià)的小鼠，從該小鼠中取出脾。然后，與骨髓瘤融合，篩選最佳結(jié)合克隆。本文也描述了對(duì)抗原產(chǎn)生抗體(例如單克隆抗體)而無需蛋白純化的藥盒。典型的藥盒包括含有多個(gè)本文所述枝狀物/t輔助肽復(fù)合物(偶聯(lián)物)(例如padre衍生枝狀物、偶聯(lián)有流感ha的枝狀物等)的容器、和ph通常為7.4的生理緩沖液。在緩沖液或培養(yǎng)基的一個(gè)示例中，所述緩沖液或培養(yǎng)基包括伊格爾氏最低限度必需培養(yǎng)基，用hepes和碳酸氫鈉緩沖，補(bǔ)充有次黃嘌呤、胸苷、丙酮酸鈉、l-谷氨酰胺、和小于10％的牛血清白蛋白或包括胰島素和/或轉(zhuǎn)鐵蛋白的帶100mg/lcacl2的單獨(dú)血清蛋白，其中內(nèi)毒素水平低于1.0eu/ml。在此實(shí)施方式中，藥盒用戶將至少一種編碼一種抗原的核酸(例如dna質(zhì)粒)用緩沖液稀釋至100-200μg/ml，溫和振蕩的同時(shí)將所述組合物(t輔助-枝狀物)添加到經(jīng)稀釋的質(zhì)粒dna。在典型實(shí)施方式中，使用比例為10:1的t輔助-枝狀物與質(zhì)粒dna(n:p)，大約是7倍(重量)的組合物與1倍(重量)的dna質(zhì)粒。在一種實(shí)施方式中，遵循以下條件。室溫孵育10分鐘后，將含有10-20μg質(zhì)粒dna/組合物的100ul混合物皮下注入小鼠。在14天中進(jìn)行類似加強(qiáng)免疫，然后通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行初始篩選、融合和最終篩選單克隆抗體。除了核酸外，本文所述組合物和藥盒可偶聯(lián)蛋白或抗原。在這樣的實(shí)施方式中，同樣10:1比例的所述組合物與蛋白通常形成復(fù)合物。本文所述藥盒中的用法說明描述了在需要時(shí)形成適當(dāng)比例、緩沖的操作方案和進(jìn)行優(yōu)化和解決問題的方法。質(zhì)粒dna或蛋白/抗原與本文所述padre-枝狀物偶聯(lián)物的復(fù)合通過在水溶液中混合這2種成分來完成，水溶液用含pbs的生理緩沖液緩沖于生理ph。典型n/p(胺與磷酸根)比是10:1。采用凝膠電泳或其他合適試驗(yàn)證實(shí)dna與padre-枝狀物的完整復(fù)合。本文所述藥盒可與編碼感興趣抗原的任何載體或質(zhì)粒一起使用。通常包括制備和使用本文所述枝狀物/t輔助表位復(fù)合物(偶聯(lián)物)的說明材料。盡管說明材料一般包括書面或印刷材料，它們并不限于如此。本文的藥盒和方法涵蓋任何能保存這些說明并將其與終端用戶交流的介質(zhì)。這類介質(zhì)包括但不限于電子存儲(chǔ)介質(zhì)(例如磁盤、磁帶、膠卷、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(例如cdrom)等。這類介質(zhì)可包括提供這些說明材料的網(wǎng)址。遞送核酸到細(xì)胞的組合物和方法在本文所述實(shí)驗(yàn)中，遞送編碼gfp的基因被特異性遞送到mhcii型細(xì)胞(表達(dá)mhcii型的細(xì)胞)且觀察到所述基因表達(dá)。因此，本文所述組合物和方法可用于任何基因治療應(yīng)用。遞送核酸到細(xì)胞的組合物通常包括至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種t輔助肽和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)化。遞送核酸給細(xì)胞的方法通常包括使所述細(xì)胞接觸含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯(lián)有至少一種t輔助肽和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯(lián)于至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合所述細(xì)胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細(xì)胞內(nèi)化。在典型實(shí)施方式中，所述肽或蛋白在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。給予組合物本文所述疫苗和組合物可以任何適當(dāng)制劑形式給予哺乳動(dòng)物(例如狗、貓、豬、馬、嚙齒類、非人靈長類、人)。例如，含有與sirna偶聯(lián)的padre-枝狀物的組合物或含有與核酸或者肽或多肽抗原復(fù)合的padre-枝狀物的疫苗能配制在藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑如生理鹽水或緩沖鹽溶液中?？苫诮o予模式和途徑及標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐選擇合適的載體和稀釋劑。示范性藥學(xué)上可接受載體和稀釋劑以及藥物制劑的描述可參見本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)教材remington’spharmaceuticalsciences(《雷明頓藥學(xué)科學(xué)》)以及usp/nf。所述組合物可添加其他物質(zhì)以穩(wěn)定和/或保存所述組合物。本文所述組合物和疫苗可通過任何常規(guī)技術(shù)給予哺乳動(dòng)物。這種給予通常是胃腸外(例如靜脈內(nèi)、皮下、瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或鞘內(nèi)引入)。所述組合物也可直接給予靶位點(diǎn)。所述組合物可以單次大劑量注射、多次注射或通過連續(xù)輸注(例如靜脈內(nèi)、腹膜透析、泵輸注)給予。對(duì)于胃腸外給予，所述組合物優(yōu)選制成滅菌無熱原形式。在治療性應(yīng)用中，將本文所述組合物和疫苗給予已患癌癥或感染有感興趣病原體(例如病毒)的個(gè)體。在預(yù)防性應(yīng)用中，將本文所述組合物和疫苗給予具有癌癥或傳染病(即感染有感興趣病原體(例如病毒))發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(例如遺傳傾向或環(huán)境接觸)的個(gè)體。在治療性應(yīng)用中，將本文所述組合物和疫苗給予已患癌癥或感染有感興趣病原體(例如病毒)的個(gè)體。在預(yù)防性應(yīng)用中，將本文所述組合物和疫苗給予具有發(fā)展(例如遺傳傾向，或環(huán)境接觸)癌癥或傳染病(即感染有感興趣病原體(例如病毒))風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。有效劑量優(yōu)選以有效量將本文所述疫苗和組合物給予哺乳動(dòng)物(例如狗、貓、豬、馬、嚙齒類、非人靈長類、人)，即所述量能在處理的哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生所需結(jié)果(例如防止或消除哺乳動(dòng)物中的癌，提供保護(hù)抵御傳染病等)?？扇缦滤龃_定這個(gè)治療有效量。本文所述疫苗和組合物的毒性和治療功效可通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)過程測定，使用培養(yǎng)細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物以測定ld50(使50％群體死亡的劑量)。毒性和治療效果間的劑量比是治療指數(shù)且可表示為ld50/ed50比。優(yōu)選表現(xiàn)出高治療指數(shù)的那些組合物。盡管可使用顯示副作用的那些組合物，必須仔細(xì)設(shè)計(jì)遞送系統(tǒng)使這些副作用的潛在損害最小化。優(yōu)選組合物的劑量優(yōu)選在含有低或無毒ed50的范圍內(nèi)。根據(jù)所用劑型和給予途徑，所述劑量可在此范圍內(nèi)變化。對(duì)于70kg的病人，本文所述組合物和疫苗用于初始免疫(即用于治療或預(yù)防性給予)的治療有效量范圍通常為約1μg到約25,000μg(例如1、100、500、2000、2500、10,000、15,000、25,000μg)偶聯(lián)有抗原或結(jié)合有編碼所述抗原的核酸的t輔助表位/枝狀物的復(fù)合物(例如，0.14μg-357μg的質(zhì)粒dna或蛋白和0.86μg-2142.85μg的t輔助-枝狀物)，然后是約1μg到約2500μg復(fù)合物(疫苗)的加強(qiáng)劑量，根據(jù)病人反應(yīng)和通過測量病人血液中的特定ctl活性和/或抗體反應(yīng)所得情況進(jìn)行數(shù)周到數(shù)月的加強(qiáng)免疫方案。在一種實(shí)施方式中，可以比上面劑量高>133倍的劑量將枝狀物每天給予哺乳動(dòng)物共15次而無毒性(參見abhaysinghchauhan等2009proc.r.soc.a,466，第1535–1550頁.2009)。對(duì)于治療目前患有癌或傳染病的對(duì)象和/或剛診斷出有癌或傳染病的對(duì)象，在急性感染情況下，給藥優(yōu)選在疾病第一征兆或檢測到或手術(shù)取出腫瘤時(shí)或于診斷后不久便開始。然后是加強(qiáng)劑量，直到至少病癥顯著減輕且之后持續(xù)一段時(shí)間。在慢性感染中，可能需要負(fù)荷劑量，然后是加強(qiáng)劑量。對(duì)于預(yù)防性用途，給藥可以在個(gè)體意識(shí)到癌癥傾向時(shí)就開始，或在預(yù)期面臨傳染病之前。如醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域所熟知，任一對(duì)象的劑量取決于許多因素，包括所述對(duì)象的尺寸、體表面積、年齡、待給予的具體組合物、給予時(shí)間和途徑、總體健康、和同時(shí)給予的其他藥物。已在臨床前研究以及臨床試驗(yàn)中測試枝狀物如pamam。近期，fda授予iii期臨床試驗(yàn)中的(星藥公司(starpharma)，澳大利亞墨爾本)“快速通道”地位。已知枝狀物在角膜中的治療性用途，枝狀物已用于角膜基因遞送。在角膜應(yīng)用中使用枝狀物的示例包括角膜新生血管治療、光動(dòng)力治療、和作為角膜等價(jià)物的組織工程。將poly(i:c)作為干擾素的“天然”誘導(dǎo)劑給予人已超過40年。多項(xiàng)近期臨床試驗(yàn)檢測了不同劑量和給藥途徑的安全性和增強(qiáng)的免疫原性；重復(fù)報(bào)道和確立了總體安全性和增強(qiáng)的免疫原性。實(shí)施例通過以下具體實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。所述實(shí)施例僅提供用于說明且不應(yīng)以任何形式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1-基于納米顆粒的佐劑/靶向基因免疫平臺(tái)治療已建立的黑素腫瘤采用裸露dna的基因免疫用于生成天然形式的抗原。然而，目前基因免疫方法的低體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率、缺乏有效遞送和弱特異性嚴(yán)重限制其功效。為克服這些限制，本文開發(fā)并描述了抗腫瘤dna免疫的新型靈活的平臺(tái)，1)可體內(nèi)特異性有效轉(zhuǎn)染papc，2)提供“危險(xiǎn)信號(hào)”，引起自體papc成熟并從而引起強(qiáng)免疫應(yīng)答，和3)激活可進(jìn)一步加強(qiáng)所產(chǎn)生免疫應(yīng)答的t輔助細(xì)胞。本文所述基于枝狀物的新型納米顆粒通常通過偶聯(lián)2種反應(yīng)物來制備：5代端氨基pamam枝狀物、和靶向/免疫增強(qiáng)肽或通用t輔助表位(padre)。下述數(shù)據(jù)顯示此平臺(tái)i)獲得目標(biāo)抗腫瘤效果，c57bl小鼠中已建立的高侵入性b16/lu8黑素腫瘤的腫瘤尺寸減小50％，ii)誘導(dǎo)針對(duì)免疫所用基因的產(chǎn)物的強(qiáng)免疫應(yīng)答和ii)使小鼠和人apc的轉(zhuǎn)染效率升至2-3倍。此外，采用偶聯(lián)padre-枝狀物的gfp編碼質(zhì)粒的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示引流淋巴結(jié)中產(chǎn)生gfp。材料和方法如上所述并加以下列改良而生成padre衍生的pamam-枝狀物。通過以適當(dāng)n/p比在室溫孵育10分鐘來產(chǎn)生所述padre-枝狀物/dna或sirna復(fù)合物。將這種復(fù)合物加入原代pbmc或脾細(xì)胞的體外研究或皮下注射用于免疫目的。圖1顯示5代pamam枝狀物的padre修飾(偶聯(lián))。為維持高度帶正電表面以結(jié)合多個(gè)核酸，一個(gè)枝狀物分子通常有2個(gè)偶聯(lián)其表面的padre肽從而可保持其正凈電荷。將padre加入所述枝狀物引起特異性靶向apc和強(qiáng)cd4輔助。所述padre衍生的pamam-枝狀物不僅護(hù)送編碼抗原的質(zhì)粒，還刺激先天和適應(yīng)性免疫并作為“危險(xiǎn)信號(hào)”。用無內(nèi)毒素的maxiprep試劑生成不同質(zhì)粒(包括pegfp-c1、pmax、gfp、trp-2、p2、pcard和pcdna3.1中的ova)。通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行熒光免疫吸附試驗(yàn)(flisa)和免疫熒光檢測(ifa)。簡要地，將轉(zhuǎn)染的cos-7細(xì)胞以0.02×106/孔接種于96孔板，固定細(xì)胞并進(jìn)行透化。為測量產(chǎn)生的體液反應(yīng)，將稀釋血清加入所述孔且采用irdye800cw標(biāo)記的第二抗小鼠igg測量抗體反應(yīng)。為制備枝狀物/dna復(fù)合物，將溶于無內(nèi)毒素pbs中的1μg/μl制備dna與枝狀物或枝狀物-padre以不同電荷比復(fù)合。室溫孵育10分鐘后，將所述復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)物或皮下、真皮內(nèi)注射或注入角膜基質(zhì)腔內(nèi)。為免疫荷載b16-lu8黑素腫瘤的小鼠，5組雌性c57bl小鼠皮下移植(0.02×106)b16-f10細(xì)胞。在腫瘤移植后第2和10天，不同組分別接受i)無處理，ii)僅pcdna3.1(載體對(duì)照)，iii)與單獨(dú)枝狀物復(fù)合的trp-2，或iv)與padre-枝狀物復(fù)合的trp-2。每周進(jìn)行2次腫瘤測量。結(jié)果鑒定已制備的padre-枝狀物。通過所述肽–cooh末端與所述枝狀物胺基之間的簡單酰胺偶聯(lián)制成所述肽-枝狀物偶聯(lián)物。反應(yīng)中使用2:1的肽/枝狀物攻擊比例，嘗試各枝狀物僅結(jié)合幾個(gè)肽以保留大部分游離胺基離從而在該枝狀物上有大量正電荷。所述產(chǎn)物通過相對(duì)純水透析來純化至少24小時(shí)，隨后真空干燥。通過1hnmr、紫外-可見光譜和maldi-tof質(zhì)譜鑒定所收集產(chǎn)物，清油。nmr顯示對(duì)應(yīng)于所述枝狀物質(zhì)子的大峰和所述肽質(zhì)子的一小組峰。所述padre-枝狀物偶聯(lián)物的maldi-tof質(zhì)譜在m/z比枝狀物自身觀察到的峰高約3,000個(gè)單位處顯示峰。超出的質(zhì)量對(duì)應(yīng)于約2個(gè)肽表位(圖17)。所述數(shù)據(jù)確認(rèn)各枝狀物上平均存在2個(gè)padre(圖17)。顯示了將多個(gè)核酸體外遞送到自體apc內(nèi)。以1:5和1:10的電荷比達(dá)到最佳的體外多核苷酸遞送/轉(zhuǎn)染人原代外周單核細(xì)胞。圖2顯示sirna通過padre-枝狀物遞送(～％86)到純化的人b細(xì)胞，其中復(fù)合(偶聯(lián))padre-枝狀物的alexafluor標(biāo)記sirna與b細(xì)胞一起孵育4小時(shí)。細(xì)胞用cd19/fitc染色且紅色通道(pe)代表有sirna/alexafluor.man的細(xì)胞。參見圖3，顯示padre-枝狀物的體內(nèi)dna遞送。編碼gfp或trp-2的質(zhì)粒單獨(dú)注射或者與padre-枝狀物或枝狀物(即不復(fù)合padre的枝狀物)復(fù)合注射。圖像顯示注射后24和16小時(shí)在皮膚(左)和角膜(右)中的gfp表達(dá)。已證實(shí)注射padre-枝狀物復(fù)合物后24和16小時(shí)在皮膚和角膜中都有g(shù)fp有效表達(dá)。證實(shí)了體內(nèi)的淋巴結(jié)靶向。皮下注射padre-枝狀物/gfp質(zhì)粒復(fù)合物(5μg總質(zhì)粒)后8天，取出相鄰淋巴結(jié)并與僅注射gfp-dna的小鼠淋巴結(jié)作比較。在免疫后第8天拍攝網(wǎng)狀淋巴結(jié)的熒光顯微圖像。觀察到毗鄰注射位點(diǎn)的淋巴結(jié)中的抗原表達(dá)，但對(duì)照淋巴結(jié)中未觀察到抗原表達(dá)。證實(shí)了體內(nèi)淋巴結(jié)靶向。皮下注射padre-枝狀物/gfp質(zhì)粒復(fù)合物(5μg總質(zhì)粒)后8天，取出相鄰淋巴結(jié)并與僅注射gfp-dna的小鼠淋巴結(jié)作比較。在免疫后第8天拍攝網(wǎng)狀淋巴結(jié)的熒光顯微圖像。觀察到毗鄰注射位點(diǎn)的淋巴結(jié)中的抗原表達(dá)，但對(duì)照淋巴結(jié)中未觀察到抗原表達(dá)。如圖4所示，給予padre-枝狀物/質(zhì)粒復(fù)合物后產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。用質(zhì)粒/padre-枝狀物復(fù)合物免疫一次(gfp)或二次(ova)后觀察到強(qiáng)體液反應(yīng)。圖5所示數(shù)據(jù)顯示padre-枝狀物治療已建立腫瘤。已知b16黑素瘤是侵入性小鼠腫瘤模型。移植b16黑素瘤細(xì)胞(頂部)或tsa(底部)的小鼠在腫瘤移植后第2或3天進(jìn)行免疫接種，接著在1周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫。后續(xù)腫瘤測量清楚證實(shí)給予padre-枝狀物可具體在c57bl(iab)中產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，c57bl(iab)對(duì)padre結(jié)合有較高親和性。c57bl也通過誘導(dǎo)t輔助細(xì)胞而對(duì)padre響應(yīng)更強(qiáng)。參見圖5，所述結(jié)果表明目標(biāo)抗腫瘤效果，已建立的高侵入性b16/lu8腫瘤的腫瘤尺寸減小50％。有意選擇此侵入性模型以顯示該平臺(tái)的效能，其他平臺(tái)都失敗了。腫瘤生長延遲和腫瘤尺寸減小是前所未有的。事實(shí)上，腫瘤移植后第22天，在測試組(即這些動(dòng)物接受如本文所述疫苗)中未檢測到腫瘤或無可觸摸的腫瘤，這與所有對(duì)照組顯著不同。此免疫所用dna量(疫苗劑量)比正常所用(20μg，共2次免疫)低許多。圖5中，下方圖是用balb/c小鼠的陰性對(duì)照，其中padre結(jié)合不適當(dāng)，balb/ctsa腫瘤模型中的類似實(shí)驗(yàn)未顯示效果。這清楚顯示通過mhcii型的遞送系統(tǒng)的特異性。這些數(shù)據(jù)清楚證實(shí)本文所述的靶向佐劑納米顆粒平臺(tái)導(dǎo)致基因遞送、所編碼抗原的強(qiáng)表達(dá)、抗原呈遞和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答。因此，本文所述padre-枝狀物是新型有效的佐劑/靶向遞送工具和平臺(tái)，用于i)無蛋白的(單克隆)抗體生成，ii)免疫治療/防止具有假象印跡(deceptiveimprinting)的惡性腫瘤和傳染病，和iii)遞送sirna用于基于免疫的多種治療干預(yù)。實(shí)施例2-體外靶向遞送和轉(zhuǎn)染效率參見圖6，體外靶向遞送pbmc產(chǎn)生77％的b細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。獲得來自健康供體的人pbmc。以600萬細(xì)胞/毫升rpmi培養(yǎng)基培養(yǎng)pbmc，所述培養(yǎng)基含有10％胎牛血清。將5μg的gfp編碼質(zhì)粒稀釋于100ul生理緩沖液pbs，振蕩的同時(shí)將溶于50ulpbs的5μgpadre-枝狀物加入dna。室溫孵育10分鐘后，將gfp質(zhì)粒和padre-枝狀物的混合物/復(fù)合物加入pbmc。在37℃/5％co2培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)后，pbmc用cd19pe染色且通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。在總pbmc的43％中觀察到gfp表達(dá)，而在b細(xì)胞上門控時(shí)77％的b細(xì)胞表達(dá)gfp。對(duì)照組中，用相同比例的枝狀物和gfp質(zhì)粒孵育的pbmc在總pbmc或b細(xì)胞中約11％和7％顯示gfp表達(dá)。與僅用培養(yǎng)基的pbmc比較，未觀察到主要的活力變化。這是多個(gè)實(shí)驗(yàn)的代表。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)i)將gfp質(zhì)粒遞送到pbmc特別是表達(dá)mhcii型的細(xì)胞(b細(xì)胞)，和ii)由pbmc特別是由b細(xì)胞表達(dá)gfp。實(shí)施例3-將肽/蛋白體內(nèi)遞送到小鼠dc和體外遞送到人b細(xì)胞將pdd/白蛋白-fitc遞送到純化的人b細(xì)胞(圖7)。參見圖8，此圖顯示padre-枝狀物體內(nèi)靶向小鼠dc和其功效以及注射和淋巴結(jié)分析的時(shí)間軸。此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明i)(圖7)在不到2小時(shí)內(nèi)將混合padre-枝狀物的白蛋白-fitc(一種蛋白)遞送入人b細(xì)胞內(nèi)，ii)(圖8)在皮下注射后第5天，將偶聯(lián)枝狀物的padre(一種表位)體內(nèi)遞送到淋巴結(jié)的b細(xì)胞和dc(所述padre-枝狀物復(fù)合gfp質(zhì)粒以顯影所述復(fù)合物遞送到淋巴結(jié)/b細(xì)胞/dc)，iii)(圖9)在皮下注射后第5天，將偶聯(lián)枝狀物的流感ha輔助表位(一種表位)體內(nèi)遞送到淋巴結(jié)的dc(所述padre-枝狀物復(fù)合gfp質(zhì)粒以顯影所述復(fù)合物遞送到淋巴結(jié)dc)。這些數(shù)據(jù)代表多個(gè)實(shí)驗(yàn)，在一些實(shí)驗(yàn)中皮下注射各自復(fù)合gfp質(zhì)粒的padre-枝狀物或ha-枝狀物后第3天取出淋巴結(jié)。這些結(jié)果確立了以下示例：將偶聯(lián)fitc的蛋白遞送到包括b細(xì)胞和dc在內(nèi)的apc通過fitc顯影，以及將偶聯(lián)枝狀物的2種肽padre和ha輔助表位遞送到淋巴結(jié)細(xì)胞中，其中g(shù)fp質(zhì)粒復(fù)合肽-枝狀物以促進(jìn)顯影和分析所述復(fù)合物(與復(fù)合gfp編碼質(zhì)粒的枝狀物肽相連)。在注射納米顆粒(padre-枝狀物/gfp編碼質(zhì)粒)與對(duì)照5天后，通過在相鄰淋巴結(jié)中靶向和擴(kuò)增dc的體內(nèi)流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)顯示特異性體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染dc(78％相比～7％的gfp表達(dá))。padre衍生枝狀物(pdd)可增強(qiáng)遞送，因?yàn)樗兄谝愿哂H和力結(jié)合apc上所表達(dá)mhcii型的padre的調(diào)理效果。類似地，皮下注射時(shí)將ha-枝狀物(drha)/gfp質(zhì)粒體內(nèi)遞送到相鄰淋巴結(jié)中(圖9)。應(yīng)注意在小鼠中，padre結(jié)合iab的mhcii型(c57bl小鼠)(圖8)，而所選ha表位結(jié)合iad的mhcii型(balb/c小鼠)(圖9)。顯示了用2種不同表位在2個(gè)不同小鼠品系中體內(nèi)遞送獲得類似結(jié)果的可行性。apc靶向的遞送引起padre-枝狀物/gfp質(zhì)粒在人pbmc(圖6)和純化的人b細(xì)胞(圖6)和c57bl小鼠脾細(xì)胞中表達(dá)gfp，和遞送padre-枝狀物/*dsrna到人b細(xì)胞(圖10)和猴pbmc(圖11)內(nèi)是通過本文所述組合物將肽遞送到papc的其他體外證明。由于使用以結(jié)合mhcii型為獨(dú)特特征的2種不同靶向肽，如本文中的實(shí)驗(yàn)所示起作用，因此本文所述疫苗、方法和組合物涵蓋所有mhcii型結(jié)合肽。參見圖9，也制備與流感ha輔助表位偶聯(lián)的枝狀物(hdd)。hdd可用于balb/c小鼠。hdd在注入小鼠時(shí)靶向相鄰淋巴結(jié)中的dc。實(shí)施例4-padre-枝狀物遞送sirna到人b細(xì)胞和非人靈長類pbmc以及padre-枝狀物遞送質(zhì)粒到非人靈長類pbmc。參見圖10，復(fù)合dssirna(對(duì)照sirna)的padre-枝狀物顯示體外靶向傳遞。將0.1μgdsrna稀釋于100ulpbs，振蕩的同時(shí)將溶于20ulpbs的0.7μgpadre-枝狀物加入alexafluor標(biāo)記的dsdna。室溫孵育10分鐘后，將所述復(fù)合物加入在24孔板孔中的100萬個(gè)純化b細(xì)胞(在加有10％胎牛血清的rpmi中)。在37℃/5％co2培養(yǎng)箱孵育約1小時(shí)后，沖洗細(xì)胞并將其放置回所述孔(在加有10％胎牛血清的1ml新鮮rpmi中)，在熒光顯微鏡下以紅色通道分析。亮場和紅色通道下的細(xì)胞覆蓋圖像證實(shí)人b細(xì)胞吸收alexafluor標(biāo)記的dsrna(圖10)。細(xì)胞在37℃/5％co2培養(yǎng)箱孵育過夜后用cd19(b細(xì)胞標(biāo)記物)染色并通過流式細(xì)胞儀分析(圖2)。如圖2所示，>80％的b細(xì)胞是alexafluor(標(biāo)記dsrna)陽性，而對(duì)照枝狀物/dsrna-alexafluor約6％是陽性。這些結(jié)果清楚證實(shí)padre-枝狀物強(qiáng)力遞送核酸到papc。測試來自狒狒(阿拉伯狒狒，papiohamadryas)的1個(gè)樣品和來自食蟹獼猴(macacafascicularis)的2個(gè)不同樣品的pbmc。圖11所示代表性熒光顯微圖像在加入各自復(fù)合sirna/alexafluor的padre-枝狀物或枝狀物后2小時(shí)獲取。類似地，將復(fù)合gfp質(zhì)粒的padre-枝狀物或枝狀物加入pbmc，孵育24小時(shí)后分析(圖12)。結(jié)果顯示padre-枝狀物在低于2小時(shí)內(nèi)將核酸遞送到猴pbmc中，而枝狀物僅顯示中等遞送。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示padre-枝狀物對(duì)非人靈長類動(dòng)物起作用。實(shí)施例5-比較padre-枝狀物納米顆粒和in-cell-arttm平臺(tái)本文所述padre-枝狀物提供特異性靶向papc，與in-cell-art的非特異遞送到所有細(xì)胞相反。in-cell-arttm平臺(tái)包括704聚合物，通過電穿孔將dna遞送到細(xì)胞而無特異性內(nèi)置佐劑活性或用于結(jié)合apc的任何配體。目前，已知體內(nèi)電穿孔是最佳的非病毒性基因免疫法。本文所述padre-枝狀物提供in-cell-art平臺(tái)不具有的t輔助細(xì)胞誘導(dǎo)。在上述實(shí)驗(yàn)中，顯示所述padre-枝狀物在治療性腫瘤模型中有效，而in-cell-art未顯示在在體內(nèi)腫瘤模型中有效。在上述實(shí)驗(yàn)中，padre-枝狀物作為與體內(nèi)電穿孔作比較的有力對(duì)照(圖13)。相反，in-cell-art僅顯示與裸露dna的比較。本文所述單次免疫padre-枝狀物與用于增強(qiáng)體液反應(yīng)的體內(nèi)電穿孔作比較。為進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)，將padre-枝狀物與5μg質(zhì)粒室溫混合，10分鐘后，用所述混合物皮下注射至小鼠。在單次接種后第28天用表達(dá)50kb16f10的ova攻擊用已接種偶聯(lián)ova編碼質(zhì)粒的padre-枝狀物免疫的小鼠和對(duì)照小鼠。接受與質(zhì)粒偶聯(lián)的padre-枝狀物的所有小鼠在腫瘤移植后第25天時(shí)受保護(hù)，而經(jīng)體外電穿孔接受質(zhì)粒的小鼠中40％受保護(hù)，僅接受dna的對(duì)照組中0％受保護(hù)。如圖13所示，結(jié)果顯示用padre-枝狀物/質(zhì)粒(drp-ova)的單次dna接種在誘導(dǎo)抗ova抗體體液反應(yīng)上優(yōu)于體內(nèi)電穿孔(ep)遞送質(zhì)粒(ep-ova)。實(shí)施例6-padre-枝狀物在小鼠中誘導(dǎo)強(qiáng)體液反應(yīng)如圖14-16所示，復(fù)合質(zhì)粒的padre-枝狀物在小鼠中引發(fā)強(qiáng)體液反應(yīng)。實(shí)施例7-通過padre-枝狀物/ova疫苗在預(yù)防性設(shè)定中消除b16/ova腫瘤6周齡的雌性c57bl小鼠以每籠5只分組接受i)無處理，ii)用dermavax電轉(zhuǎn)儀通過“體內(nèi)電穿孔”2次免疫20μgova質(zhì)粒，或iii)用padre-枝狀物/ova質(zhì)粒2次免疫(各20μg)。免疫間隔2周進(jìn)行。免疫后10天，所有小鼠在右脅接受皮下注射(移植)100μlpbs中的50,000b16/ova腫瘤細(xì)胞。每周2次測量腫瘤且對(duì)每周數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，如圖18所示。用padre-枝狀物/20μgova質(zhì)粒的2次接種使得所有免疫小鼠中的b16/ova腫瘤完全消除，而100％無處理小鼠和60％經(jīng)“體內(nèi)電穿孔”接種小鼠維持荷瘤。殺死所有腫瘤大于15％體重的荷瘤小鼠。其他實(shí)施方式可對(duì)部分或全部的所述組合物、藥盒和方法步驟進(jìn)行任何改進(jìn)。本文引用的包括出版物、專利申請(qǐng)和專利在內(nèi)的所有參考文獻(xiàn)通過引用納入本文，。使用本文提供的任何和所有實(shí)施例或示例性用語(例如，“如”)旨在闡述本發(fā)明，除非另有說明否則不對(duì)本發(fā)明范圍構(gòu)成限制。例如，盡管本文所述實(shí)驗(yàn)包括消除b16黑素瘤和誘導(dǎo)對(duì)gfp、ova、pcard、ccr5、vgpcr、mupar、cathl或p2抗原的強(qiáng)體液反應(yīng)，本文所述疫苗、組合物和方法可用于多種其他治療和預(yù)防性應(yīng)用，包括防止和消除其他癌類型、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并因而誘導(dǎo)針對(duì)任何感興趣抗原(例如來自傳染性病原體的抗原)的免疫。在另一實(shí)施例中，本文所述疫苗、組合物和方法可用于遞送對(duì)細(xì)胞而言不是抗原的蛋白或肽。在此實(shí)施例中，用于遞送肽或蛋白到細(xì)胞的典型組合物包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯(lián)有至少一種t輔助肽和至少一種肽或蛋白，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種肽或蛋白偶聯(lián)于所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結(jié)合所述細(xì)胞。本文中關(guān)于本發(fā)明或所述優(yōu)選實(shí)施方式的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)的任何表述不用于限制，不應(yīng)認(rèn)為這些表述限制了所附權(quán)利要求。更普遍地，本說明書的語言不用于表明任何非權(quán)利要求的元素對(duì)本發(fā)明實(shí)施必不可少。在適用法律允許情況下，本發(fā)明包括對(duì)所附權(quán)利要求中引用對(duì)象的全部改進(jìn)和等同方式。此外，除非本文另有說明或明顯與上下文矛盾，本發(fā)明包括任意上述元素組合的所有可能變化。序列表<110>邁阿密大學(xué)(universityofmiami)p.m.達(dá)夫塔里安(daftarian,pirouz)a.凱弗爾(kaifer,angel)p.塞拉菲尼(serafini,paolo)v.l.佩雷(perez,victor)b.b.布隆貝格(blomberg,bonnie)v.p.萊蒙(lemmon,vance)黎薇<120>疫苗組合物和其使用方法<130>7230-61wo<150>us61/165,732<151>2009-04-01<160>27<170>patentinversion3.5<210>1<211>16<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>乙?；痙-丙氨酸<222>(1)..(1)<220><221>ala<222>(3)..(3)<223>環(huán)己基丙氨酸<220><221>d-丙氨酸<222>(14)..(14)<220><221>氨基己酸<222>(15)..(15)<223>氨基己酸<400>1alalysxaavalalaalatrpthrleulysalaalaalaalaxaacys151015<210>2<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>丙氨酸<222>(3)..(3)<223>環(huán)己基丙氨酸<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>2alalysxaavalalaalatrpthrleulysalaalaala1510<210>3<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>3alalysphevalalaalatrpthrleulysalaalaala1510<210>4<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>4alalystyrvalalaalatrpthrleulysalaalaala1510<210>5<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>5alalysphevalalaalatyrthrleulysalaalaala1510<210>6<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>ala<222>(3)..(3)<223>環(huán)己基丙氨酸<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>6alalysxaavalalaalatyrthrleulysalaalaala1510<210>7<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>7alalystyrvalalaalatyrthrleulysalaalaala1510<210>8<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>8alalysphevalalaalahisthrleulysalaalaala1510<210>9<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>環(huán)己基丙氨酸<222>(3)..(3)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>9alalysxaavalalaalahisthrleulysalaalaala1510<210>10<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>10alalystyrvalalaalahisthrleulysalaalaala1510<210>11<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>11alalysphevalalaalaasnthrleulysalaalaala1510<210>12<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>環(huán)己基丙氨酸<222>(3)..(3)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>12alalysxaavalalaalaasnthrleulysalaalaala1510<210>13<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>d-ala<222>(1)..(1)<220><221>d-ala<222>(13)..(13)<400>13alalystyrvalalaalaasnthrleulysalaalaala1510<210>14<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>14alalysphevalalaalatrpthrleulysalaalaala1510<210>15<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>15alalystyrvalalaalatrpthrleulysalaalaala1510<210>16<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>16alalysphevalalaalatyrthrleulysalaalaala1510<210>17<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>環(huán)己基丙氨酸<222>(3)..(3)<400>17alalysxaavalalaalatyrthrleulysalaalaala1510<210>18<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>18alalystyrvalalaalatyrthrleulysalaalaala1510<210>19<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>19alalysphevalalaalahisthrleulysalaalaala1510<210>20<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>環(huán)己基丙氨酸<222>(3)..(3)<400>20alalysxaavalalaalahisthrleulysalaalaala1510<210>21<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>21alalystyrvalalaalahisthrleulysalaalaala1510<210>22<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>22alalysphevalalaalaasnthrleulysalaalaala1510<210>23<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>環(huán)己基丙氨酸<222>(3)..(3)<400>23alalysxaavalalaalaasnthrleulysalaalaala1510<210>24<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>24alalystyrvalalaalaasnthrleulysalaalaala1510<210>25<211>11<212>prt<213>前病毒pr8病毒<400>25serphegluargphegluilepheprolysglu1510<210>26<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<220><221>環(huán)己基丙氨酸<222>(3)..(3)<400>26alalysxaavalalaalatrpthrleulysalaalaala1510<210>27<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>27glyserglyglyglyglyser15當(dāng)前第1頁12