專利名稱：：低添加流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于提供保護(hù)免遭流感病毒感染的疫苗，特別是含有低水平的藥物添加劑的疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：目前有各種形式的流感病毒疫苗可用(參見，例如參考文獻(xiàn)1的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒或滅活的病毒。滅活的病毒可以基于完整的病毒顆粒、"裂解的"病毒顆粒或純化的表面抗原。除了它們的抗原性內(nèi)含物外，目前的疫苗也包含各種形式的藥物添加劑和其他污染物，例如抗菌防腐劑，如硫柳滎；洗滌劑，如CTAB、聚山梨醇酯80、辛苯聚醇10等；抗生素，如新霉素、卡那霉素；甲醛；和雞蛋衍生的物質(zhì)，包括雞蛋蛋白質(zhì)(如卵清蛋白)和雞DNA。例如，對(duì)于2006/07季，美國(guó)使用的四種滅活疫苗的生產(chǎn)商數(shù)據(jù)表揭示了以下信息<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>與Fluvirin2006-07產(chǎn)品相似，參考文獻(xiàn)2制備了不含甲醛，但含有硫柳滎和雞蛋產(chǎn)物的疫苗。本發(fā)明的目的是提供進(jìn)一步改良的流感疫苗和它們的制備方法，所述疫苗中這些藥物添加劑的含量和/或數(shù)量降低或消除，從而得到更純的疫苗產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的流感疫苗缺乏以下成分中的至少三種組分汞防腐劑；抗生素；甲醛；和雞蛋衍生的物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，疫苗不含這四種組分。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐劑，不含抗生素以及不含雞蛋_衍生的物質(zhì)。優(yōu)選不含甲醛的疫苗。因此，本發(fā)明提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐劑、不含抗生素以及不含甲醛。本發(fā)明還提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含抗生素、不含甲醛以及不含雞蛋_衍生的物質(zhì)。本發(fā)明還提供包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐劑、不含抗生素、不含甲醛以及不含雞蛋_衍生的物質(zhì)。優(yōu)選疫苗還應(yīng)具有極低水平的內(nèi)毒素，例如低于0.1IU/ml，優(yōu)選低于0.05IU/ml。內(nèi)毒素測(cè)量的國(guó)際單位是熟知的，可通過例如與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[3，4]，如從NIBSC獲得的2ndInternationalStandard(第二國(guó)際標(biāo)準(zhǔn))(代碼94/580-IS)比較來計(jì)算樣品的內(nèi)毒素國(guó)際單位。目前從雞蛋培養(yǎng)病毒制備的疫苗的內(nèi)毒素水平為0.5-5IU/ml。本發(fā)明還提供制備流感病毒抗原的方法，包括以下步驟(i)沒有雞蛋-衍生物質(zhì)和抗生素存在下，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)流感病毒；(ii)在沒有甲醛存在下，滅活步驟(i)所培養(yǎng)的流感病毒；和(iii)在沒有硫柳汞存在下，從該滅活的流感病毒制備疫苗抗原制劑。得到的抗原制劑可以是能用于制備單價(jià)或多價(jià)疫苗的散裝疫苗抗原?？乖M分本發(fā)明利用從流感病毒顆粒制備的流感病毒抗原。不利用甲醛滅活病毒顆粒。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的以下一種或多種試劑處理洗滌劑、e-丙內(nèi)酯、或紫外光。滅活的其它化學(xué)方法包括用亞甲藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它們的任何組合處理。本領(lǐng)域已知病毒滅活的其它方法，例如二乙胺、乙酰乙烯亞胺、或Y射線?？赏ㄟ^各種方法從含病毒液體收獲病毒顆粒。例如，純化方法可包括用線性蔗糖梯度溶液(含有洗滌劑以破壞病毒顆粒)進(jìn)行區(qū)帶離心。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用洗滌劑(如乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、三正丁基磷酸鹽、曲通x-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、Tergito1NP9等)處理純化的病毒顆粒可獲得裂解病毒顆粒，從而產(chǎn)生亞病毒顆粒制劑，包括"吐溫_醚"裂解方法。裂解流感病毒的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如參見參考文獻(xiàn)5-10等。一般使用破壞濃度的裂解劑使得完整病毒破壞或斷裂來裂解病毒，無論該病毒有無感染性。這種破壞導(dǎo)致病毒蛋白的完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子型和離子型(例如陽離子型)表面活性劑，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季銨化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲銨鹽、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑、利非他明(lipofectamine)和D0T-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性齊U，如曲通x-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，并且裂解可在病毒顆粒初始純化期間發(fā)生(例如在蔗糖密度梯度溶液中)?？蓪⒘呀獾牟《绢w粒重懸于磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般還包含神經(jīng)氨酸酶。制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。流感抗原也可以病毒體(無核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)的形式存在[ll]，例如inflexalVtm禾Pinvavactm產(chǎn)品，可使流感病毒減毒。流感病毒可以是溫度敏感型。流感病毒可以是冷適應(yīng)性病毒。然而，這三種特征與活病毒疫苗更相關(guān)。用于疫苗的人流感病毒毒株隨季節(jié)而變。在目前的大流行間期，疫苗一般包括兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株，一般是三價(jià)疫苗。本發(fā)明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群從未與其發(fā)生過免疫接觸的毒株)，如H2、H5、H7或H9亞型毒株(特別是甲型流感病毒)的HA，大流行毒株的流感疫苗可以是單價(jià)疫苗，或者可以基于補(bǔ)充有大流行毒株的正常三價(jià)疫苗。然而，根據(jù)季節(jié)和疫苗中所含抗原的特性，本發(fā)明可保護(hù)免受HA亞型H1、H2、H3、H4、H5、朋、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16(甲型流感病毒)中一種或多種亞型的感染。本發(fā)明可保護(hù)免受甲型流感病毒NA亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中一種或多種亞型的感染。本發(fā)明組合物不僅適用于免疫大流行間期的免疫，尤其適用于對(duì)大流行毒株的免疫?？赡芤鸫罅餍斜l(fā)的流感毒株的特征是(a)與目前流行的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有數(shù)十年沒在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發(fā)現(xiàn)的血凝素(如通常只出現(xiàn)在鳥群體中的H5、H6或H9)，和/或與目前流行的人毒株中的神經(jīng)氨酸酶相比，它含有新的神經(jīng)氨酸酶，以至于人群未曾免疫接觸過該毒株的血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶；(b)它能夠在人群中水平傳播；和(c)它能使人致病。含H5血凝素類型的病毒優(yōu)選用于對(duì)大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現(xiàn)的大流行毒株。在H5亞型中，病毒分為HA進(jìn)化支1、HA進(jìn)化支1'、HA進(jìn)化支2或HA進(jìn)化支3[12]，進(jìn)化支1和3尤其相關(guān)。其抗原可用于包含在組合物中的其它毒株是對(duì)抗病毒治療有抗性(例如對(duì)奧塞米韋[13]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[14]。本發(fā)明組合物可包含一種或多種(如1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原?？芍苽鋯蝺r(jià)疫苗，也可制備2-價(jià)、3_價(jià)、4_價(jià)疫苗，等等。當(dāng)疫苗包含一種以上流感毒株時(shí)，一般單獨(dú)培養(yǎng)不同毒株，收獲病毒后將它們混合在一起，然后制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟，且該步驟可在非冷藏條件下進(jìn)行。優(yōu)選三價(jià)疫苗，其包含來自兩種甲型流感病毒毒株和一種乙型流感病毒毒株的抗原。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該組合物可包含來自一種甲型流感毒株的抗原。在一些實(shí)施方式中，該組合物可包含來自兩種甲型流感毒株的抗原，前提是這兩種毒株不是H1N1和H3N2。在一些實(shí)施方式中，該組合物可包含來自兩種以上甲型流感毒株的抗原。流感病毒可能是重配毒株，可通過反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得該病毒。反向遺傳學(xué)技術(shù)[如15-19]能夠用質(zhì)粒在體外制備含有所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術(shù)一般包括例如(a)由poll啟動(dòng)子表達(dá)編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)由polll啟動(dòng)子表達(dá)編碼病毒蛋白的DNA分子，這兩種類型的DNA在細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致組裝成完整的感染性病毒顆粒。該DNA優(yōu)選提供病毒的所有RNA和蛋白質(zhì)，但也可能使用輔助病毒來提供一些RNA和蛋白質(zhì)。優(yōu)選采用不同質(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA的基于質(zhì)粒的方法[20-22]，這些方法也包括使用質(zhì)粒來表達(dá)所有或一些病毒蛋白(例如，僅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中使用最多12種質(zhì)粒。為了減少所需的質(zhì)粒數(shù)量，近期方法[23]將多個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(用于合成病毒RNA)合并到同一質(zhì)粒上(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，并且將多個(gè)蛋白編碼區(qū)與RNA聚合酶II啟動(dòng)子合并到另一個(gè)質(zhì)粒上(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種甲型流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)。參考文獻(xiàn)23方法的優(yōu)選方面包括(a)PBl、PB2和PAmRNA編碼區(qū)在一個(gè)質(zhì)粒上；和(b)所有8個(gè)vRNA編碼區(qū)段在一個(gè)質(zhì)粒上。一個(gè)質(zhì)粒上包含NA和HA區(qū)段而另外六個(gè)區(qū)段位于另一質(zhì)粒上也可能是有利的。作為使用poll啟動(dòng)子來編碼病毒RNA區(qū)段的替換方式，可使用噬菌體聚合酶啟動(dòng)子[24]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動(dòng)子。由于poll啟動(dòng)子的物種特異性，噬菌體聚合酶啟動(dòng)子可能較適合許多細(xì)胞類型(如MDCK)，但也必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在其它技術(shù)中，可使用polI和pol11雙啟動(dòng)子由一個(gè)模板同時(shí)編碼病毒RNA和可表達(dá)的mRNA[25，26]。因此，病毒，特別是甲型流感病毒可包含來自A/PR/8/34病毒的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段(一般6個(gè)區(qū)段來自A/PR/8/34，HA和N區(qū)段來自疫苗毒株，即6:2重配毒株)。也可包含來自A/WSN/33病毒，或用于產(chǎn)生疫苗制劑的重配病毒的任何其它毒株的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段。本發(fā)明一般保護(hù)免受能夠在人之間傳播的毒株的感染，因此該毒株的基因組通常包含起源于哺乳動(dòng)物(如人)流感病毒的至少一個(gè)RNA區(qū)段。它可包含起源于禽流感病毒的NS區(qū)段。如上所述，通常在細(xì)胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)用作抗原來源的病毒，從而能避免含胚雞蛋組分的污染。因此，本發(fā)明疫苗可不含雞DNA以及不含雞蛋蛋白質(zhì)(例如，卵白蛋白或卵類粘蛋白)。細(xì)胞底物一般是哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞系。合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源包括但不限于倉鼠、牛、靈長(zhǎng)動(dòng)物(包括人和猴)和犬細(xì)胞。可采用各種細(xì)胞類型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適的倉鼠細(xì)胞的例子是稱為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞是(例如)非洲綠猴細(xì)胞，例如腎細(xì)胞，如Vero細(xì)胞系。合適的犬細(xì)胞是(例如)腎細(xì)胞，例如MDCK細(xì)胞系。因此，合適的細(xì)胞系包括但不限于MDCK、CH0、293T、BHK、Vero、MRC-5、PER.C6、WI-38等。用于培養(yǎng)流感病毒的哺優(yōu)選乳動(dòng)物細(xì)胞系包括馬-達(dá)二氏(MadinDarby)犬腎來源的MDCK細(xì)胞[27-30];非洲綠猴(Cercopithecusaethiops)腎來源的Vero細(xì)胞[31-33];或人胚視網(wǎng)膜母細(xì)胞來源的PER.Ce細(xì)胞[34]。這些細(xì)胞系可由各種來源獲得，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)[35]、Coriell細(xì)胞庫[36]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC供應(yīng)各種不同Vero細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-81、CCL_81.2、CRL_1586和CRL-1587，還供應(yīng)MDCK細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-34。PER.C6可獲自ECACC，保藏號(hào)96022940。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的代替，可在禽細(xì)胞系[如參考文獻(xiàn)37-39]，包括禽胚胎干細(xì)胞[37，40]和鴨(如鴨視網(wǎng)膜)或母雞來源的細(xì)胞系上培養(yǎng)病毒。合適的禽胚胎干細(xì)胞包括衍生自雞胚胎干細(xì)胞的Ebx細(xì)胞系、EB45、EB14和EB14_074[41]。也可使用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，坐坐寸寸。用于培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選細(xì)胞系是MDCK細(xì)胞系。原始MDCK細(xì)胞系可購自ATCC(CCL-34)，但也可利用該細(xì)胞系的衍生細(xì)胞系。例如，參考文獻(xiàn)27公開了適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系('MDCK33016'，保藏號(hào)DSMACC2219)。類似地，參考文獻(xiàn)42公開了在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的MDCK衍生細(xì)胞系('B-702'，保藏號(hào)FERMBP-7449)。參考文獻(xiàn)43公開了非致瘤性MDCK細(xì)胞，包括'MDCK-S'(ATCCPTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCCPTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCCPTA-6502)禾口，MDCK-SF103，(PTA-6503)。參考文獻(xiàn)44公開了非常易于感染的MDCK細(xì)胞系，包括'MDCK.5F1'細(xì)胞(ATCCCRL-12042)?？墒褂萌魏芜@些MDCK細(xì)胞系。細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)物，以及用于啟動(dòng)培養(yǎng)的病毒接種物優(yōu)選不含(即經(jīng)測(cè)試且得到陰性污染結(jié)果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環(huán)病毒和/或細(xì)小病毒[45]。特別優(yōu)選不存在單純皰疹病毒。可以在懸浮[27，46，47]或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中培養(yǎng)病毒。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞可能適合懸浮培養(yǎng)。一種適合懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系是MDCK33016(保藏號(hào)DSMACC2219)?；蛘撸刹捎梦⑤d體培養(yǎng)。優(yōu)選在無血清培養(yǎng)基和/或無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系。在本發(fā)明中，如果培養(yǎng)基中沒有人或動(dòng)物來源的血清添加劑，則稱為無血清培養(yǎng)基。無蛋白應(yīng)理解為在不含蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、其它蛋白添加劑和非血清蛋白質(zhì)的情況下發(fā)生細(xì)胞增殖的培養(yǎng)物，但可任選包含諸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等病毒生長(zhǎng)可能必需的蛋白質(zhì)。在這類培養(yǎng)物中培養(yǎng)的細(xì)胞在天然情況下本身含有蛋白質(zhì)。在病毒復(fù)制過程中，支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系優(yōu)選在37t:以下[48](如30-36。C)培養(yǎng)。在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖病毒的方法通常包括以下步驟用待培養(yǎng)的毒株接種培養(yǎng)的細(xì)胞，將感染細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間以使病毒增殖，例如通過病毒滴度或抗原表達(dá)來確定所需時(shí)間(如接種后24-168小時(shí))，然后收獲增殖的病毒。用i:500-1:i，優(yōu)選i:ioo-i:5，更優(yōu)選l:50-1:10的病毒(由PFU或TCID50測(cè)定)細(xì)胞比接種培養(yǎng)的細(xì)胞。將病毒加入細(xì)胞懸液中，或施加于細(xì)胞單層，在25-4(TC，優(yōu)選28-37t:下，使病毒吸附于細(xì)胞至少60分鐘，但通常小于300分鐘，優(yōu)選90-240分鐘?？赏ㄟ^凍融或酶作用去除感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(如單層)，以提高收獲的細(xì)胞上清液的病毒含量。然后，可滅活或冷凍儲(chǔ)存收獲的液體?？梢约s0.0001-10、優(yōu)選0.002-5、更優(yōu)選0.001-2的感染復(fù)數(shù)("m.o.i.〃)感染培養(yǎng)的細(xì)胞。更優(yōu)選地，以約O.Ol的m.o.i.感染細(xì)胞?？梢栽诟腥竞?0-60小時(shí)收獲感染的細(xì)胞。優(yōu)選在感染后34-48小時(shí)收獲細(xì)胞。更優(yōu)選在感染后38-40小時(shí)收獲細(xì)胞。通常在細(xì)胞培養(yǎng)期間加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒釋放，可以在培養(yǎng)的任何合適階段加入蛋白酶。按照本發(fā)明，培養(yǎng)期間可避免抗生素。目前參照一般由SRID測(cè)定的HA水平來標(biāo)準(zhǔn)化流感疫苗?，F(xiàn)有疫苗一般含有約15ygHA/毒株，但較低劑量也可使用(例如，當(dāng)用佐劑時(shí))。采用了分?jǐn)?shù)劑量如l/2(即7.5iigHA/毒株)、1/4禾P1/8[62，63]，以及較高劑量(如3x或9x劑量[49，50])。因此，疫苗可包含0.1-150iigHA/流感毒株，優(yōu)選0.1-50iig，例如0.1-20yg、0.1-15yg、0.l-10iig、0.1-7.5iig、0.5-5iig等。具體劑量包括例如，約90、約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約1.9、約1.5/毒株等?？蛇x擇本發(fā)明所述疫苗、試劑盒和方法的組分(例如，它們的體積和濃度)以在最終產(chǎn)品中提供這些抗原劑量。本發(fā)明所用HA可以是天然HA，如病毒中發(fā)現(xiàn)的，或者可以是經(jīng)修飾的。例如，已知修飾HA以去除決定簇(如HA1和HA2之間切割位點(diǎn)周圍的超堿性區(qū)域(hyper-basicregion))。除了包含血凝素，本發(fā)明的組合物還可包含其它流感病毒蛋白。例如，它們通常包含神經(jīng)氨酸酶糖蛋白。它們還可包含基質(zhì)蛋白，如Ml和/或M2(或其片段)，和/或核蛋白。宿主細(xì)胞DNA用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐是最大程度減少最終疫苗中殘留的細(xì)胞系DNA的含量，以盡可能降低這些DNA的致癌活性。因此，本發(fā)明組合物優(yōu)選含有小于10ng(優(yōu)選小于lng，更優(yōu)選小于100pg)殘留的宿主細(xì)胞DNA/劑量，但可能存在痕量宿主細(xì)胞DNA。通常，需要從本發(fā)明組合物中排除的宿主細(xì)胞DNA是長(zhǎng)度大于100bp的DNA?，F(xiàn)在，殘留宿主細(xì)胞DNA的測(cè)定是生物制品的常規(guī)管理要求，并且在技術(shù)人員的普通能力范圍內(nèi)。用于測(cè)定DNA的實(shí)驗(yàn)一般是驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[51，52]。可通過數(shù)學(xué)和可以量化的術(shù)語來描述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的性能特征，并鑒定可能的誤差來源。通常測(cè)試該實(shí)驗(yàn)的某些特征，如精確性、準(zhǔn)確性、特異性。一旦校正(例如用已知標(biāo)準(zhǔn)量的宿主細(xì)胞DNA校正)并檢驗(yàn)了某個(gè)實(shí)驗(yàn)，則可按常規(guī)進(jìn)行定量DNA測(cè)定?？刹捎萌NDNA定量的基本技術(shù)雜交方法，如Southern印跡或狹線印跡[53];免疫測(cè)定法，如Threshold系統(tǒng)[54];和定量PCR[55]。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法，但各方法的準(zhǔn)確特征，例如雜交探針的選擇、用于擴(kuò)增的引物的和/或探針的選擇等可能取決于所研究的宿主細(xì)胞。來自分子設(shè)備公司(MolecularDevices)的Threshold系統(tǒng)是皮克水平的總DNA的定量實(shí)驗(yàn)，已用于監(jiān)測(cè)生物藥品中污染DNA的水平[54]。典型實(shí)驗(yàn)包括生物素化ssDNA結(jié)合蛋白、脲酶偶聯(lián)的抗ssDNA抗體和DNA之間以非序列特異性方式形成反應(yīng)復(fù)合物。購自生產(chǎn)商的總DNA測(cè)定試劑盒(TotalDNAAssayKit)中包含所有實(shí)驗(yàn)組分。多個(gè)商業(yè)生產(chǎn)商均提供了用于檢測(cè)殘留宿主細(xì)胞DNA的定量PCR實(shí)驗(yàn)，例如AppTecTM實(shí)驗(yàn)室服務(wù)公司(A卯Tec"LaboratoryServices)、BioRelianceTM公司奧西科技公司(AltheaTechnologies)等。用于測(cè)定人病毒疫苗的宿主細(xì)胞DNA污染的化學(xué)發(fā)光雜交實(shí)驗(yàn)和總DNAThreshol系統(tǒng)的比較參見參考文獻(xiàn)56。在疫苗制備過程中可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，如層析法等去除污染性DNA?？赏ㄟ^核酸酶處理，例如DNA酶處理來改進(jìn)對(duì)殘留宿主細(xì)胞DNA的清除效果。參考文獻(xiàn)57和58公開了一種減少宿主細(xì)胞DNA污染的方便方法，該方法包括兩步處理，第一步是在病毒生長(zhǎng)期間使用DNA酶(如Benzonase)處理，然后是在病毒顆粒破裂期間使用陽離子洗滌劑(如CTAB)進(jìn)行處理。也可利用烷化劑如P-丙內(nèi)酯處理來去除宿主細(xì)胞DNA，該方法也宜用于滅活病毒顆粒[59]。優(yōu)選每15iig血凝素中宿主細(xì)胞DNA含量〈10ng(如〈lng、<100pg)的疫苗，以及每O.25ml體積中宿主細(xì)胞DNA含量<10ng(如〈lng、<100pg)的疫苗。更優(yōu)選每50iig血凝素中宿主細(xì)胞DNA含量〈10ng(如〈lng、<100pg)的疫苗，以及每O.5ml體積中宿主細(xì)胞DNA含量〈10ng(如〈lng、<100pg)的疫苗。佐劑本發(fā)明組合物宜包含佐劑，佐劑可用于在接受該組合物的患者中提高所引發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)(體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答)。曾經(jīng)描述過將佐劑與流感疫苗一起使用。參考文獻(xiàn)60和62中使用了氫氧化鋁，參考文獻(xiàn)62中使用了氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。參考文獻(xiàn)63也描述了鋁鹽佐劑的應(yīng)用。希龍疫苗公司(ChironVaccines)的FLUAD產(chǎn)品包含水包油乳液?？捎糜诒景l(fā)明的佐劑包括但不限于包含f丐鹽和鋁鹽(或其混合物)的含礦物質(zhì)組合物。f丐鹽包括磷酸f丐(如參考文獻(xiàn)64公開的"CAP"顆粒)。鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，所述鹽取任何合適的形式(如凝膠、晶體、無定形態(tài)等)。優(yōu)選吸附于這些鹽。也可將含有礦物質(zhì)的組合物制成金屬鹽的顆粒[65]。下面更詳細(xì)地描述了鋁鹽佐劑。細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑(詳述見下)。皂苷[參考文獻(xiàn)101第22章]，皂苷是在許多種類的植物的皮、葉、莖干、根甚至花中發(fā)現(xiàn)的甾醇糖苷和三萜糖苷的異質(zhì)群體。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹(Quillaias即onaria)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可購自麗花菝葜(Smilaxornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophillapaniculata)(婚紗花)和肥皂草(S即onariaofficianalis)(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質(zhì)制劑如ISC0M。QS21以商標(biāo)Stimulon出售。已采用HPLC和RP-HPLC來純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術(shù)純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷優(yōu)選QS21。制備QS21的方法參見參考文獻(xiàn)66。也可將QuilA的組分A與至少一種其他佐劑一起使用[67]。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[68]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫剌激復(fù)合物(ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)101的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM優(yōu)選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻(xiàn)68-70中進(jìn)一步描述了ISC0M。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[71]。也可使用至少兩種ISCOM復(fù)合物的混合物，各種復(fù)合物基本上包含一種皂苷組分，此時(shí)的復(fù)合物是ISCOM復(fù)合物或ISCOM基質(zhì)復(fù)合物[72]。開發(fā)基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻(xiàn)73和74。脂肪佐劑(詳述見下)。細(xì)菌ADP-核糖基化毒素(如大腸桿菌(E.coli)不耐熱腸毒素〃LT〃、霍亂毒素〃CT〃或百日咳毒素〃PT〃)及其脫毒衍生物，如稱為L(zhǎng)T-K63和LT-R72的突變毒素[75]。參考文獻(xiàn)76中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻(xiàn)77中描述了將其用作胃腸道外佐劑。生物粘附劑和粘膜粘附劑，如酯化透明質(zhì)酸微球[78]或殼聚糖及其衍生物[79]。由可生物降解和無毒材料(例如聚(a-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己酸內(nèi)酯等)，優(yōu)選丙交酯_乙交酯共聚物形成的微粒(即直徑約100nm-150ym，更優(yōu)選約200nm-30ym，或約500nm-10ym的顆粒)，任選處理以具有帶負(fù)電表面(如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)101第13和14章)。適合用作佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子見參考文獻(xiàn)80-82所述。水包油乳液(詳述見下)聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑[83]。這種制劑還包括聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯聚醇[84]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種其它非離子表面活性劑如辛苯聚醇[85]的混合物。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯_9_固醇醚(steorylether)、聚氧乙烯_8_固醇醚、聚氧乙烯_4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰_去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-異谷氨酰-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺(〃DTP-DPP〃或〃Theramide")、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰-幼-甘油_3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。由第一種革蘭氏陰性菌制備的外膜蛋白蛋白酶體制劑與第二種革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂多糖制劑的組合，其中所述外膜蛋白蛋白酶體和脂多糖制劑形成穩(wěn)定的非共價(jià)佐劑復(fù)合物。這類復(fù)合物包括〃IVX-908"，它是由腦膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)外膜蛋白和脂多糖組成的復(fù)合物。已將它們用作流感疫苗佐劑[86]。甲基肌苷5，-單磷酸酯("MMP")[87]。多聚羥化吡咯雙烷類化合物[88]，如下式化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或衍生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>式中R選自氫，直鏈或支鏈、未取代或取代、飽和或不飽和的酰基、烷基(如環(huán)烷基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于木麻黃(casuarine)、木麻黃-6-ci-D-吡喃葡萄糖、3_表_木麻黃、7_表-木麻黃、3，7-二表-木麻黃等。y菊糖[89]或其衍生物，如藻類菊粉(algammulin)。CDld配體，如a_糖基神經(jīng)酰胺，例如a-半乳糖基神經(jīng)酰胺。參考文獻(xiàn)101和102中更詳細(xì)地討論了這些和其它佐劑活性物質(zhì)。組合物可包含兩種或多種所述佐劑。例如，它們宜同時(shí)包含水包油乳液和細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑，因?yàn)檫@種組合提高了流感疫苗引發(fā)的細(xì)胞因子應(yīng)答，如干擾素_y應(yīng)答，與該乳液或藥劑單用時(shí)相比，它們聯(lián)用時(shí)引發(fā)的應(yīng)答高得多。組合物中的抗原和佐劑通常是混合在一起的。當(dāng)疫苗包含佐劑時(shí)，它可在遞送時(shí)當(dāng)場(chǎng)制備。因此，本發(fā)明提供了包含各種易混的抗原和佐劑組分的試劑盒。該試劑盒可將佐劑和抗原單獨(dú)保存，直到使用。試劑盒中諸組分在物理上互相分離，可通過各種方式實(shí)現(xiàn)這種分離。例如，這兩種組分可以裝在兩個(gè)不同的容器，如藥瓶中。可通過(例如)取出一個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并將其加入另一個(gè)藥瓶，或者分別取出兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物并在第三個(gè)容器中將它們混合在一起，來混合兩個(gè)藥瓶的內(nèi)容物。在優(yōu)選的安排中，試劑盒的一種組分在注射器中，另一種組分在容器如藥瓶中?？墒褂迷撟⑸淦?例如裝有針頭的)將其內(nèi)容物注入第二個(gè)容器中混合，然后將該混合物抽回注射器中。然后，一般通過新的無菌針頭將該注射器中的混合成分給予患者。將一種組分包裝到注射器中使得不需要另外準(zhǔn)備注射器進(jìn)行給藥。在另一優(yōu)選的安排中，這兩種試劑盒組分在同一注射器，例如雙室注射器(如參考文獻(xiàn)90-97等所述)中分開保存。當(dāng)注射器致動(dòng)時(shí)(例如給予患者時(shí))，則這兩室中的內(nèi)容物混合。這種安排避免了使用時(shí)的單獨(dú)混合步驟。水包油乳液佐劑發(fā)現(xiàn)水包油乳液特別適用于含佐劑的流感病毒疫苗。多種這類乳液是已知的，它們一般包含至少一種油和至少一種表面活性劑，油與表面活性劑是可生物降解(可代謝)和生物相容性的。乳液中油滴的直徑通常小于5m，甚至可以是亞微米級(jí)，用微流化床實(shí)現(xiàn)這種小尺寸以提供穩(wěn)定的乳液。優(yōu)選小于220nm的液滴，因?yàn)樗鼈兛蛇M(jìn)行過濾除菌。本發(fā)明可使用的油諸如動(dòng)物油(如魚油)或植物油。植物油的來源包括堅(jiān)果、種籽和谷粒。堅(jiān)果油中最常見的是花生油、大豆油、可可油和橄欖油。也可使用獲自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷粒油中，最常見的是玉米油，但也可采用其它谷類如小麥、燕麥、裸麥、稻、畫眉草、黑小麥等的油?？蓮膱?jiān)果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適的物質(zhì)來制備6-10碳脂肪酸甘油酯和1，2-丙二醇，雖然這些物質(zhì)不是種籽油中天然產(chǎn)生的。來自哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油是可代謝的，因此可用于實(shí)施本發(fā)明。由動(dòng)物來源獲得純油的過程中必需的分離、純化、皂化和其它步驟是本領(lǐng)域熟知的。大多數(shù)魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和鯨油如鯨蠟代表了可用于本發(fā)明的幾種魚油的例子。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單元合成許多支鏈油，它們總稱為萜類。鯊魚肝油含有支鏈不飽和類萜，稱為鯊烯2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，本文特別優(yōu)選此類萜。鯊烯的飽和類似物鯊?fù)橐彩莾?yōu)選的油。魚油，包括鯊烯和鯊?fù)椋子趶纳虡I(yè)來源購得，或可通過本領(lǐng)域已知方法獲得。其它優(yōu)選油是生育酚(見下)。可采用油的混合物?？筛鶕?jù)表面活性劑的"HLB"(親水/親油平衡)將其分類。優(yōu)選的本發(fā)明表面活性劑的HLB至少為IO，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16。本發(fā)明可用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;環(huán)氧乙烷(E0)、環(huán)氧丙烷(P0)和/或環(huán)氧丁烷(B0)的共聚物，以D0WFAX為商品名出售，例如線形E0/P0嵌段共聚物；重復(fù)的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基團(tuán)數(shù)目可能不同的辛苯聚醇，其中特別感興趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂，例如磷脂酰聚膽堿(卵磷脂)；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，例如三乙烯乙二醇單月桂基醚(triethyleneglycolmonolaurylether)(節(jié)澤30);和失水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和失水山梨糖醇單月桂酸酯。乳液中所含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，洗滌劑如吐溫80也可提高熱穩(wěn)定性，從下面的實(shí)施例可見?？墒褂帽砻婊钚詣┑幕旌衔?，如吐溫80/司盤85混合物。也適合采用聚氧乙烯失水山梨糖醇酯如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-IOO)的混合物。另一種有用的混合物包含聚乙二醇單月桂醚9和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性劑的含量(重量％)優(yōu)選為聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(如吐溫80)0.01-1%，特別是約0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100，或曲通系列的其它洗滌劑)O.001-0.1%，特別是0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(如聚乙二醇單月桂醚9)0.1-20%，優(yōu)選0.1_10%，特別是0.1-1%或約0.5%。本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。該乳液的體積組成可以是約5%鯊烯、約0.5%聚山梨酯80和約0.5%司盤85。以重量計(jì)，這些比例變?yōu)?.3%鯊烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盤85。此佐劑稱為'MF59'[98-100]，如參考文獻(xiàn)101的第10章和參考文獻(xiàn)102的第12章所詳述。MF59乳液宜包含檸檬酸根離子，如10mM檸檬酸鈉緩沖液。鯊烯、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸鹽緩沖鹽水。它也可含有司盤85(如1%)和/或卵磷脂。這些乳液可含有2-10%鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，鯊烯生育酚的重量比優(yōu)選《l，因?yàn)檫@能使乳液更穩(wěn)定。鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2?？赏ㄟ^下述方法制備一種這樣的乳液將吐溫80溶解于PBS得到2%溶液，然后將90ml該溶液與5gDL-a-生育酚和5ml鯊烯的混合物混合，然后使該混合物微流體化。得到的乳液可含有，例如，平均直徑為100-250nm，優(yōu)選約180nm的亞微米油滴。，鯊烯、生育酚和曲通洗滌劑(如曲通X-IOO)的乳液。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。該乳液可含有磷酸鹽緩沖液。含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通洗滌劑(如曲通X-IOO)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。該乳液可包含這三種組分，其質(zhì)量比約為75:11:IO(如750iig/ml聚山梨酯80，110iig/ml曲通X-100和100yg/ml琥珀酸a-生育酚)，這些濃度應(yīng)包括抗原中這些組分的貢獻(xiàn)。該乳液還可包含鯊烯。該乳液也可包含3d-MPL(見下)。水相可含有磷酸鹽緩沖液。鯊烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401("PluroniCTML121〃)的乳液?？梢杂昧姿猁}緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已知與用〃SAF-I"佐劑(0.05-1%Thr-MDP、5X鱉烯、2.5%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酉旨80)配的蘇氨酰基-MDP—起使用[103]。也可不與Thr-MDP—起使用，例如用〃AF〃佐劑(5%鯊烯、1.25%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)[104]。優(yōu)選微流體化。包含角鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(例如聚氧乙烯(12)鯨蠟基硬脂基(cetostearyl)醚)和疏水性非離子型表面活性劑(例如失水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇單油酸酯或'司盤80')的乳液。乳液優(yōu)選是熱致可逆的和/或至少90%油滴(按體積計(jì))的大小小于200nm[105]。乳液中還可包含以下一種或多種醛醇；冷凍保護(hù)劑(例如糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。這種乳液可被凍干。含有0.5_50%油、0.1-10%磷脂和0.05_5%非離子型表面活性劑的乳液。如參考文獻(xiàn)106所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴大小。不可代謝油(如輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(如卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液。可包含添力B劑，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂體偶聯(lián)物(如通過葡糖醛酸的羧基將脂族胺加到脫?；碥丈隙a(chǎn)生的GPI-0100，參見參考文獻(xiàn)107)、二甲基二-十八烷基溴化銨和/或N，N-二-十八烷基-N，N-雙(2-羥乙基)丙二胺。含有礦物油、非離子型親脂乙氧基化脂肪醇和非離子型親水表面活性劑(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯_聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[108]。12含有礦物油、非離子型親水乙氧基化脂肪醇和非離子型親脂表面活性劑(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯_聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[108]。[OOgo]皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如膽固醇)結(jié)合成螺旋膠束的乳液[109]?？梢栽谶f送時(shí)將該乳液與抗原臨時(shí)混合。因此，在包裝或出售的疫苗中該佐劑和抗原可分開保存，使用時(shí)配制成最終制劑。抗原通常是水性形式，以便最終通過混合兩種液體制備疫苗?；旌系膬煞N液體的體積比可變(例如5:i-i:5)，但通常約為i:i。將抗原與佐劑混合之后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，血凝素很少(如果有)會(huì)進(jìn)入該乳液的油相。當(dāng)組合物包含生育酚時(shí)，可使用a、|3、Y、S、e或；生育酚中任何一種，但優(yōu)選a-生育酚。生育酚可采取不同形式，例如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機(jī)鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等。D-a-生育酚和DL-a-生育酚均可使用。用于老年患者(如年齡大于60歲或更大的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因?yàn)閾?jù)報(bào)道維生素E在此患者群體中對(duì)免疫應(yīng)答有正面作用[110]。它們也具有抗氧化特性，這種特性有助于穩(wěn)定該乳液[lll]。優(yōu)選的a-生育酚是DL-a-生育酚，這種生育酚的優(yōu)選鹽是琥珀酸鹽。發(fā)現(xiàn)琥珀酸鹽在體內(nèi)能與TNF相關(guān)配體協(xié)作。而且，已知琥珀酸a-生育酚與流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐劑[8]。細(xì)胞因子-誘導(dǎo)劑給予患者時(shí)包含在本發(fā)明組合物中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑能夠引發(fā)免疫系統(tǒng)釋放細(xì)胞因子，包括干擾素和白細(xì)胞介素。已知細(xì)胞因子應(yīng)答參與針對(duì)流感病毒感染的宿主防御的早期和決定階段[112]。優(yōu)選藥劑可引發(fā)以下一種或多種物質(zhì)的釋放干擾素y;白細(xì)胞介素-1;白細(xì)胞介素-2;白細(xì)胞介素-12;TNF-a;TNF-P;和GM-CSF。優(yōu)選的藥劑引發(fā)與Thl型免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞因子釋放，如干擾素y、TNF-a、白介素-2。優(yōu)選剌激干擾素-y和白細(xì)胞介素-2。因此，接受本發(fā)明組合物的結(jié)果是，用流感抗原剌激時(shí)，患者的T細(xì)胞以抗原特異性方式釋放所需細(xì)胞因子。例如，由它們的血液純化的T細(xì)胞在體外接觸流感病毒血凝素時(shí)釋放y干擾素。本領(lǐng)域已知測(cè)定外周血單核的細(xì)胞(PBMC)的這類應(yīng)答的方法，包括ELISA、ELISPOT、流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)PCR。例如，參考文獻(xiàn)113報(bào)道了監(jiān)測(cè)針對(duì)破傷風(fēng)類毒素的抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，特別是y干擾素應(yīng)答的一項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)ELISPOT是區(qū)分抗原特異性TT誘導(dǎo)的應(yīng)答與自發(fā)性應(yīng)答的最靈敏的方法，但通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞漿內(nèi)細(xì)胞因子則是檢測(cè)再剌激作用的最有效方法。合適的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑包括但不限于，免疫剌激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通過磷酸鍵連接于鳥嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)、或雙鏈RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。3-0-脫酰化單磷酰脂質(zhì)A('3dMPL'，也稱為'MPL')[114-117]。咪唑喹啉化合物，如咪喹莫特(〃R-837")[118，119]、瑞喹莫德(〃R-848")[120]、和它們的類似物；以及它們的鹽(如鹽酸鹽)。有關(guān)免疫剌激性咪唑喹啉的其它細(xì)節(jié)可參見參考文獻(xiàn)121-125。，縮氨基硫脲化合物，如參考文獻(xiàn)126所述的化合物。參考文獻(xiàn)126中也描述了配制、制備和篩選活性化合物的方法?？s氨基硫脲在剌激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-a方面特別有效。，色胺酮化合物，如參考文獻(xiàn)127所述的化合物。參考文獻(xiàn)127中也描述了配制、制備和篩選活性化合物的方法。縮氨基硫脲在剌激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-a方面特別有效。.核苷類似物，如(a)艾沙托立賓(Isatorabine)(ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷)及其前藥(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻(xiàn)128-130所述的化合物;(f)具有下式的化合物式中&和R2各自獨(dú)立地是氫、鹵素、_NRaRb、-OH、C卜6烷氧基、取代的C卜6烷氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、C6—1Q芳基、取代的C6—1Q芳基、(V6烷基、或取代的C卜6烷基；R3不存在，或者是H、(V6烷基、取代的(V6烷基、C6—1Q芳基、取代的C6—1Q芳基、雜環(huán)基、或取代的雜環(huán)基；R4和R5各自獨(dú)立地是氫、鹵素、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、-C(0)-Rd、C卜6烷基、取代的(V6烷基、或結(jié)合在一起形成5元環(huán)，如R4—5:^UR4—5在—所示的化學(xué)鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合，Xi和X2各自獨(dú)立地是N、C、0或S;R8是氫、鹵素、-0H、(V6烷基丄2—6烯基丄2—6炔基、-0H、-NRaRb、-(CH2)n-0-Re、-0-(C烷基)、-S(0)pRe、或-C(0)-Rd;R9是氫、C卜6烷基、取代的C卜6烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基或Ik，其中R9a是在一所示的化學(xué)鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合，R1Q和Rn各自獨(dú)立地是氫、鹵素、C卜6烷氧基、取代的(V6烷氧基、-NRA、或-OH;Ra和Rb各自獨(dú)立地是氫、(V6烷基、取代的(V6烷基、-C(0)-Rd、C6—1Q芳基；R。各自獨(dú)立地是氫、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、C卜6烷基、或取代的C卜6烷基；Rd各自獨(dú)立地是氫、鹵素、C卜6烷基、取代的(V6烷基、C卜6烷氧基、取代的C卜6烷氧基、-NH2、-NH((V6烷基)、-NH(取代的C卜6烷基)、-N(Q—6烷基)2、_N(取代的6烷基)2、C6—1Q芳基、或雜環(huán)基；Re各自獨(dú)立地是氫、C卜6烷基、取代的6烷基、C6—1Q芳基、取代的C6—1Q芳基、雜環(huán)基、或取代的雜環(huán)基；Rf各自獨(dú)立地是氫、C卜e烷基、取代的C卜6烷基、-。(0)-1^、磷酸酯、二磷酸酯、或三磷酸酯基；n各自獨(dú)立地是0、l、2或3;p各自獨(dú)立地是0、1或2;或或者(g)(a)-(f)中任一項(xiàng)的藥學(xué)上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項(xiàng)的互變異構(gòu)體，或互變異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽。*洛索立賓(7-烯丙基-8-氧代鳥苷)[131]。參考文獻(xiàn)132所述化合物，包括酰基哌嗪化合物、噴哚二酮化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮化合物、氨基氮雜乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[133，134]、水合酞酰胺(hydr即thalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、異噁唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[135]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑并嘧啶化合物、和噴哚化合物[136]。*聚氧鎗(polyoxidonium)聚合物[137,138]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。參考文獻(xiàn)139所述化合物。氨烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC-529[140，141]。CDld配體，如a-糖基神經(jīng)酰胺[142-149](例如a-半乳糖基神經(jīng)酰胺)、含植物鞘氨醇的a_糖基神經(jīng)酰胺、0CH、KRN7000[(2S，3S，4R)+0-(a_D_吡喃乳糖基)-2-(N-二十六烷基氨基)_1，3，4-十八烷三醇]、CR0NY-101、3"-0-硫代-半乳糖基神經(jīng)酰胺，等等。磷腈，如參考文獻(xiàn)150和151中所述的聚[二(羧酸苯氧基)磷腈](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，"PCPP，，)。小分子免疫增強(qiáng)劑(SMIP)，例如N2-甲基-1-(2_甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_2，4-二胺N2，N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺N2-乙基-N2-甲基-1-(2_甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺N2-甲基-1-(2_甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5_c]喹啉_2，4-二胺1_(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_2，4-二胺N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_2，4-二胺N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5_c]喹啉_2，4-二胺N2-甲基-1-(2_甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺N2-甲基-1-(2_甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4，5_c]喹啉_2，4_二胺1-(2_甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫代]-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_4_胺1-(2_甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_4_胺2-[[4-氨基-1-(2_甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_2_基](甲基)氨基]乙醇2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4-c]喹啉_2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯4-氨基-1-(2_甲基丙基)-l，3-二氫-2H-咪唑并[4，5_c]喹啉_2_酮N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5_c]喹啉_2，4-二胺N2，N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺1_{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2_甲基丙_2-醇l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉_1_基]_2_甲基丙_2_醇N4，N4-二節(jié)基-l-(2-甲氧基_2_甲基丙基)_N2_丙基_1H_咪唑并[4，5_c]喹啉-2，4-二胺。用于本發(fā)明的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑可以是Toll樣受體(TLR)的調(diào)節(jié)劑和/或激動(dòng)劑。例如，它們可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中一種或多種的激動(dòng)劑。優(yōu)選試劑是TLR7激動(dòng)劑(如咪唑并喹啉)和/或TLR9激動(dòng)劑(如CpG寡核苷酸)。這些試劑可用于激活先天性免疫途徑。可以在本發(fā)明組合物生產(chǎn)過程的各個(gè)階段加入細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。例如，可將其加入抗原組合物中，然后將此混合物加入水包油乳液中?；蛘?，可將其加入水包油乳液中，在這種情況下可以在乳液組分乳化之前加入該試劑，或者可以在乳液乳化后加入該試劑。相似地，該試劑可以凝聚在乳液液滴中。細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑在最終組合物中的位置和分布將取決于其親水/親脂特性，例如該藥劑可位于水相中、油相中和/或油水界面上。該細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑可偶聯(lián)于另一種試劑，如抗原(如CRM197)。參考文獻(xiàn)152中提供了有關(guān)小分子偶聯(lián)技術(shù)的綜述?；蛘?，佐劑可與其它試劑非共價(jià)(例如通過疏水作用或離子相互作用)結(jié)合。兩種優(yōu)選的細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑是(a)免疫剌激性寡核苷酸和(b)3dMPL。免疫剌激性寡核苷酸可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或(除RNA外)單鏈。參考文獻(xiàn)153、154和155公開了可能的類似取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷代替鳥苷。參考文獻(xiàn)156-161中進(jìn)一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。16CpG序列可能導(dǎo)向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[162]。CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，例如CpG-A0DN(寡脫氧核糖核苷酸)，或更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-BODN。參考文獻(xiàn)163-165中討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優(yōu)選CpG-AODN。優(yōu)選構(gòu)建CpG寡核苷酸時(shí)使其5'端可為受體所識(shí)別。任選將兩個(gè)CpG寡核苷酸序列的3'端相連接形成"免疫聚體"。參見例如，參考文獻(xiàn)162和166-168。有用的CpG佐劑是CpG7909，也稱為ProMuneTM(禾斗雷制藥集團(tuán)公司(ColeyPharmaceuticalGroup,Inc.))。或者，或此外，除使用CpG序列外，也可使用TpG序列[169]。這些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫剌激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一個(gè)以上連續(xù)的胸腺嘧啶核苷酸(例如，參考文獻(xiàn)169所公開的TTTT)，和/或它的核苷酸組成中可能含有>25%胸腺嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。例如，它可能含有一個(gè)以上連續(xù)的胞嘧啶核苷酸(例如，參考文獻(xiàn)169所公開的CCCC)，和/或它的核苷酸組成中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。這些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫剌激性寡核苷酸一般含有至少20個(gè)核苷酸。它們可含有少于100個(gè)核苷酸。3dMPL(也稱為3脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A或3_0_脫酰基-4'-單磷酰脂質(zhì)A)是單磷酰脂質(zhì)A的還原性末端葡糖胺的3位脫?；淖魟?。3dMPL可由明尼蘇達(dá)沙門菌(Salmonellami皿esota)的無庚糖突變體制備，在化學(xué)上類似于脂質(zhì)A，但缺少酸_不穩(wěn)定性磷酰基和堿_不穩(wěn)定性酰基。它能激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，并剌激幾種細(xì)胞因子的釋放，包括IL-I、IL-12、TNF-a和GM-CSF(也參見參考文獻(xiàn)170)。參考文獻(xiàn)171最先描述了3dMPL的制備。3dMPL可以采取?；煌南嚓P(guān)分子(如具有3、4、5或6個(gè)?；湥鼈兊拈L(zhǎng)度可以不同)的混合物的形式。兩個(gè)葡糖胺(也稱為2-脫氧-2-氨基-葡萄糖)單糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-?；?，3'位上也有0-酰基化。連接于碳2的基團(tuán)具有下式-NH-C0-CH2-CR力1，。連接于碳2'的基團(tuán)具有下式-NH-CO-CH2-CR2R2'。連接于碳3'的基團(tuán)具有下式_0-C0-CH2-CR3R3'。代表性結(jié)構(gòu)為基團(tuán)R1、R2和R3各自獨(dú)立地是-(CH》n-CH3。n值優(yōu)選為8_16，更優(yōu)選為9_12，最優(yōu)選為10。基團(tuán)R"、R2，禾PR"各自獨(dú)立地是(a)-H;(b)-OH;或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H17或-(CH丄-CH3，其中m值優(yōu)選為8-16，更優(yōu)選為10、12或14。在2位上，m優(yōu)選為14。在2'位上，m優(yōu)選為10。在3'位上，m優(yōu)選為12。因此，基團(tuán)R1'、R2，和R3'優(yōu)選為來自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的-o-?；?。R"、R"和R"均為-H時(shí)，3dMPL僅含有3條酰基鏈(2、2'和3'位置上各有一條)。R"、R2'和R3，中僅有兩個(gè)是-H時(shí)，3dMPL可含有4條?；湣"、R2'和R3'中僅有一個(gè)是-H時(shí)，3dMPL可含有5條?；湣1'、R2'和R3'中沒有一個(gè)是_H時(shí)，3chMPL可含有6條?；?。本發(fā)明所用的3dMPL佐劑可以是含有3-6條?；湹倪@些形式的混合物，但混合物中優(yōu)選包含具有6條?；湹?dMPL，具體說，保證6條?；湹男问秸?dMPL總重的至少10%，例如>20%、>30%、>40%、>50%或更多。發(fā)現(xiàn)具有6條?；湹?dMPL是佐劑活性最高的形式。因此，本發(fā)明組合物包含的3dMPL的最優(yōu)選形式具有下式(IV):以混合物的形式使用3dMPL時(shí)，提到3dMPL在本發(fā)明組合物中的含量或濃度，指混合物中的混合3dMPL物質(zhì)。在水性條件下，3dMPL可形成不同大小，如直徑<150nm或>500nm的膠束聚集體或顆粒。其中一種或兩者都可用于本發(fā)明，可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)選擇更好的顆粒。本發(fā)明優(yōu)選使用小顆粒(如小到足以產(chǎn)生澄清的3dMPL水懸液)，因?yàn)樗鼈兓钚愿遊172]。優(yōu)選顆粒的平均直徑小于220nm，更優(yōu)選小于200nm，小于150nm，或小于120nm，它們的直徑甚至可以小于100nm。然而在大多數(shù)情況下，平均直徑不小于50nm。這些顆粒足夠小，以便適合過濾除菌?？捎媒沂酒骄降某Ｒ?guī)技術(shù)動(dòng)態(tài)光散射評(píng)價(jià)粒徑。據(jù)稱顆粒的直徑為xnm時(shí)，粒徑通常分布在此平均值附近，但至少50數(shù)量％(例如^60%、>70%、>80%、>90%或更多)顆粒的直徑在x士25X的范圍內(nèi)。3dMPL宜與水包油乳液聯(lián)合使用?；旧纤?dMPL均位于該乳液的水相中。3dMPL可以獨(dú)自使用，或者與一種或多種其它化合物聯(lián)用。例如，已知將3dMP與以下物質(zhì)聯(lián)用QS21皂苷[173](包含在水包油乳液中[174])、免疫剌激性寡核苷酸、QS21和免疫剌激性寡核苷酸、磷酸鋁[175]、氫氧化鋁[176]或磷酸鋁和氫氧化鋁。月旨瞎齊ll可用于本發(fā)明的脂肪佐劑包括上述水包油乳液，還包括例如式I、II或III的化合物或其鹽H4',X1~fl,-HO~P=04似,<歸—乂(『^二V《IIIIII如參考文獻(xiàn)177所述，如，ER803058，、'ER803732，、，ER804053，、'ER804058，、，ER804059，、'ER804442，、'ER804680，、'ER804764，、，ER803022，或，ER804057，，如:A.oIIo一p—o'0NaHN卜人II.O—P—0'ONa00人.ER謝05719<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>.大腸桿菌(Escherichiacoli)的脂質(zhì)A的衍生物如0M-174(如參考文獻(xiàn)178和179所述)。陽離子脂質(zhì)與(通常為中性)共脂質(zhì)(co-lipid)的制劑，如氨基丙基-二甲基_肉豆蔻烯酰氧基_溴化丙銨_二植?；字乙醇胺(〃Vaxfectin")或氨基丙基-二甲基-雙十二烷基氧基-溴化丙銨-二油酰基磷脂酰-乙醇胺(〃GAP-DLRIE:DOPE")的制劑。優(yōu)選含有(士)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(順-9-四癸烯氧基)-l-丙銨鹽的制劑[180]。3-0-脫酰化單磷酰脂質(zhì)A(見上)。含有連接于含磷酸無環(huán)主鏈的脂質(zhì)的化合物，如TLR4拮抗劑E5564[1S1，182]:IS脅齊ll可使用稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規(guī)名稱，但僅為方便使用，因?yàn)樗鼈兌疾皇撬淼膶?shí)際化合物的準(zhǔn)確描述[例如參見參考文獻(xiàn)101的第9章]。本發(fā)明可采用通常用作佐劑的任何〃氫氧化物〃或〃磷酸鹽〃佐劑。稱為〃氫氧化鋁〃的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽(通常至少部分為晶體)?？刹捎眉t外(IR)光譜將式A10(0H)代表的羥基氧化鋁與其它鋁化合物，如氫氧化鋁A1(0H)3區(qū)別開，特別是1070cm—1處存在吸收條帶和3090-3100cm—1處存在強(qiáng)肩峰[參考文獻(xiàn)101的第9章]。半高的衍射條帶寬度(WHH)反映出氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶度，結(jié)晶差的顆粒由于結(jié)晶較小而譜線增寬較大。隨著WHH增加，表面積增大，觀察到WHH值較高的佐劑具有較大的抗原吸附能力。纖維形態(tài)(如透射電鏡照片中所見)是氫氧化鋁佐劑的典型形態(tài)。氫氧化鋁佐劑的Pl—般約為11，即該佐劑本身在生理pH下表面帶正電荷。據(jù)報(bào)道，pH7.4時(shí)氫氧化鋁佐劑的吸附容量為1.8-2.6毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。稱為〃磷酸鋁〃的佐劑一般是羥基磷酸鋁，也常常含有少量硫酸鹽(即羥基磷酸硫酸鋁)。它們可通過沉淀獲得，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度都會(huì)影響該鹽中磷酸取代羥基的程度。羥基磷酸鹽的P0/A1摩爾比通常為0.3-1.2?？梢酝ㄟ^是否存在羥基將羥基磷酸鹽與嚴(yán)格的A1P04區(qū)別開。例如，3164cm—1處的IR譜帶(例如加熱到200°C)表明存在結(jié)構(gòu)羥基[參考文獻(xiàn)101的第9章]。磷酸鋁佐劑的P(VA1"摩爾比通常為0.3-1.2，優(yōu)選為0.8-1.2，更優(yōu)選為0.95±0.1。磷酸鋁通常是無定形的，尤其是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P0"A1摩爾比為0.84-0.92的無定形的羥基磷酸鋁，每毫升包含0.6mgAl3+。磷酸鋁通常是顆粒(如在透射電子顯微鏡照片上觀察到的板狀形態(tài))?？乖胶箢w粒直徑一般是0.5-20iim(如約5-10iim)。據(jù)報(bào)道，pH7.4時(shí)磷酸鋁佐劑的吸附容量為0.7-1.5毫克蛋白質(zhì)/毫克Al+++。磷酸鋁的零電荷點(diǎn)(PZC)與磷酸對(duì)羥基的取代程度逆相關(guān)，這種取代程度可能取決于用于通過沉淀制備鹽的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度。也可通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(更多磷酸根二偏酸性PZC)或加入緩沖液如組氨酸緩沖液(使PZC偏堿性)來改變PZC。本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC通常為4.0-7.O，更優(yōu)選為5.0-6.5，例如約為5.7。用于制備本發(fā)明組合物的鋁鹽懸浮液可以，但不一定含有緩沖液(如磷酸鹽或組氨酸或Tris緩沖液)。該懸浮液優(yōu)選無菌且無熱原。該懸浮液可含有游離的水性磷酸根離子，如濃度為1.0-20mM，優(yōu)選5-15mM，更優(yōu)選約10mM的磷酸根離子。該懸浮液也可含有氯化鈉。本發(fā)明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物[62]。在這種情況下，磷酸鋁比氫氧化鋁多，例如重量比為至少2:1，例如>5:i、>6:i、>7:i、>8:i、>9:i等。給予患者的組合物中A1+++的濃度優(yōu)選小于10mg/ml，例如《5mg/ml、《4mg/ml、《3mg/ml、《2mg/ml、《lmg/ml等。優(yōu)選范圍是0.3_lmg/ml。最大值優(yōu)選為0.85毫克/劑量。除包含一種或多種鋁鹽佐劑外，佐劑組分還可包含一種或多種其它佐劑或免疫剌激劑。其它這類組分包括但不限于3-0-脫?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A佐劑('3d-MPL');和/或水包油乳液。3dMPL也稱為3脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A或3-0-脫?；?4'-單磷酰脂質(zhì)A。該命名表明單磷酰脂質(zhì)A的還原性末端葡糖胺的3位脫?；?。它是由明尼蘇達(dá)沙門菌(S.minnesota)的無庚糖突變體(h印toselessmutant)制備，在化學(xué)上類似于脂質(zhì)A，但缺少酸_不穩(wěn)定性磷?；蛪A_不穩(wěn)定性?；Ｋ芗せ顔魏思?xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，并剌激釋放幾種細(xì)胞因子，包括IL-I、IL-12、TNF-a和GM-CSF。參考文獻(xiàn)171中首先描述了3d-MPL的制備，該產(chǎn)品由考科薩公司(CorixaCorporation)生產(chǎn)并以商品名MPL出售。其它詳情可參見參考文獻(xiàn)114-117。藥物組合物本發(fā)明組合物是藥學(xué)上可接受的。除抗原外，它們通常還包含其它組分，例如它們一般包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對(duì)這類組分的充分討論參見參考文獻(xiàn)183。該組合物通常是水性形式。該組合物不含汞物質(zhì)。其可包含2-苯氧乙醇，但更優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。為了控制張力，優(yōu)選包含生理性鹽如鈉鹽。優(yōu)選氯化鈉(NaCl)，它的濃度可以是l-20mg/ml。可以存在的其它鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、二水合磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化牽丐等。組合物的滲透壓通常為200-400m0sm/kg，優(yōu)選為240-360m0sm/kg，更優(yōu)選為290-310m0sm/kg。雖然以前報(bào)道過滲透壓對(duì)疫苗接種引起的疼痛無影響[184]，但優(yōu)選將滲透壓保持在此范圍內(nèi)。組合物可含有一種或多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖劑的濃度一般是5-20mM。緩沖劑可存在于乳劑水相中。組合物的pH通常為5.0-8.1，更一般為6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本發(fā)明方法可包括在包裝前調(diào)整散裝疫苗pH的步驟。該組合物優(yōu)選無菌。該組合物優(yōu)選不含谷蛋白。疫苗不含抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。該組合物可含有一次免疫的物質(zhì)，或者可含有多次免疫的物質(zhì)(即'多劑量'組合物)。多劑量配置優(yōu)選含有防腐劑。為避免需要防腐劑，了將疫苗裝在具有用于取出物質(zhì)的無菌接頭的容器中。流感疫苗的典型給藥體積約為0.5ml，但也可將一半劑量(即約0.25ml)給予兒童，并相應(yīng)地選擇單位劑量，如將0.5ml的單位劑量給予患者。組合物或藥盒組分的包裝本發(fā)明的方法可包括將疫苗置入容器內(nèi)、尤其是置入銷售容器以供醫(yī)師使用的步驟。裝入這種容器之后，該容器無需冷藏。適用于該疫苗的容器包括藥瓶、鼻噴霧和一次性注射器等，這些容器應(yīng)無菌。組合物/組分位于藥瓶中時(shí)，該藥瓶?jī)?yōu)選由玻璃或塑料材料制成。優(yōu)選先滅菌藥瓶，再加入組合物。為了避免膠乳敏感型患者的問題，優(yōu)選用無膠乳的塞子密封藥瓶，優(yōu)選所有包裝材料中不含膠乳。藥瓶可包括單一劑量的疫苗，或者可以包括一個(gè)以上劑量('多劑量'藥瓶)，如IO個(gè)劑量。優(yōu)選的藥瓶由無色玻璃制成。藥瓶可以有適合的帽(如呂埃鎖(Luerlock))，以便將預(yù)填裝注射器插入該帽，將注射器的內(nèi)容物推入藥瓶，并將藥瓶的內(nèi)容物吸回注射器中。從藥瓶中拔出注射器后，可連上針頭，并將該組合物給予患者。該帽優(yōu)選位于封口或蓋子內(nèi)側(cè)，以便在封口或蓋子打開后才能接觸到該帽。藥瓶，特別是多劑量藥瓶裝有瓶帽，以便無菌地取出其內(nèi)含物。某組合物/組分包裝在注射器中時(shí)，該注射器可連有針頭。如果未連接針頭，可隨注射器提供單獨(dú)的針頭以便組裝和使用。這種針頭可裝在護(hù)罩中。優(yōu)選安全性針頭。一般是1-英寸23-號(hào)、1-英寸25-號(hào)和5/8-英寸25-號(hào)針頭?？商峁┯袆冸x標(biāo)簽的注射器，該標(biāo)簽上可打印上內(nèi)含物的批號(hào)、流感季節(jié)和到期日期，以幫助記錄保存。注射器的活塞優(yōu)選帶有抑止裝置，以防止活塞在吸出時(shí)意外脫出。注射器可以有膠乳橡膠帽和/或活塞。一次性注射器含有單一劑量的疫苗。注射器通常帶有頂帽，以在連接針頭前密封頂端，頂帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，那么針頭優(yōu)選裝有丁基橡膠護(hù)罩。優(yōu)選的注射器是以商品名〃Tip-Lok〃TM銷售的注射器。容器可標(biāo)注有半劑量體積，以便遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑量的注射器可標(biāo)有0.25ml體積的標(biāo)記。采用玻璃容器(如注射器或藥瓶)時(shí)，優(yōu)選采用由硼硅酸鹽玻璃，而非鈉鈣玻璃制成的容器。22可將組合物與單頁宣傳品包裝在一起(在同一個(gè)箱子中)，所述單頁宣傳品包括疫苗的詳細(xì)情況如給藥說明書、疫苗內(nèi)所含抗原的詳情等。說明書也可包含警示內(nèi)容，(例如)準(zhǔn)備好腎上腺素溶液以應(yīng)對(duì)疫苗接種后發(fā)生過敏反應(yīng)的情況等。治療方法和疫苗的給藥本發(fā)明組合物適合給予人類患者，本發(fā)明提供了在患者中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將本發(fā)明組合物給予患者的步驟。本發(fā)明也提供用作藥物的本發(fā)明試劑盒或組合物。這些方法和應(yīng)用引發(fā)的免疫應(yīng)答通常包括抗體應(yīng)答，優(yōu)選保護(hù)性抗體應(yīng)答。評(píng)價(jià)接種流感病毒疫苗后抗體應(yīng)答、中和能力和保護(hù)作用的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。人體研究表明，對(duì)人流感病毒血凝素的抗體滴度與保護(hù)作用相關(guān)聯(lián)(約30-40的血清樣品血凝反應(yīng)_抑制滴度對(duì)同源病毒感染產(chǎn)生約50%保護(hù)作用)[185]。一般通過血凝反應(yīng)抑制、微量中和、單徑向免疫擴(kuò)散(SRID)和/或單徑向溶血(SRH)來測(cè)定抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域熟知這些測(cè)定技術(shù)。可以各種方式給予本發(fā)明組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌內(nèi)注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[186-188]、口服[189]、皮內(nèi)[190,191]、經(jīng)皮、透皮[192]等?？衫冒凑毡景l(fā)明制備的疫苗來治療兒童和成年人。目前，推薦將流感疫苗用于年齡>6個(gè)月的兒童和成年人免疫。因此，患者可以小于1歲、l-5歲、5-15歲、15-55歲或至少55歲。接受該疫苗的優(yōu)選患者是老年人(例如>50歲、>60歲，優(yōu)選>65歲)、年輕人(如《5歲)、住院患者、醫(yī)護(hù)工作人員、軍隊(duì)服務(wù)人員和軍人、妊娠婦女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受該疫苗前7天接受過抗病毒化合物(如奧塞米韋或扎那米韋化合物；見下)的患者、對(duì)雞蛋過敏的人和出國(guó)旅行者。然而，該疫苗不只適用于這些人群，還可以在更廣泛的人群中使用。就大流行毒株而言，優(yōu)選給予所有年齡的人。本發(fā)明優(yōu)選組合物滿足CPMP的功效標(biāo)準(zhǔn)1、2或3。在成年人(18_60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)>70%血清保護(hù)；(2)>40%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加>2.5倍。在老年人(>60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)>60%血清保護(hù)；(2)>30%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加>2倍。這些標(biāo)準(zhǔn)基于至少50位患者的標(biāo)簽公開研究?？梢酝ㄟ^單劑量方案或多劑量方案進(jìn)行治療。多劑量可用于初免方案和/或加強(qiáng)免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑給予各種劑量，例如胃腸外初免和粘膜加強(qiáng)，粘膜初免和胃腸外加強(qiáng)，等等。給予一個(gè)以上劑量(一般是兩個(gè)劑量)特別可用于免疫原初患者，例如從未接受過流感疫苗的人，或者用于免疫對(duì)抗新的HA亞型(如大流行爆發(fā)中的亞型)。多劑量的給予一般至少間隔l周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約12周、約16周等)。可將本發(fā)明產(chǎn)生的疫苗與其它疫苗基本上同時(shí)給予患者(例如，可在醫(yī)護(hù)專家或疫苗接種中心的同一次用藥咨詢或就診期間)，例如與麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、匪R疫苗、水痘疫苗、匪RV疫苗、白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的乙型流感嗜血桿菌疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)疫苗(如四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞體病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)疫苗等基本上同時(shí)給藥。與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本上同時(shí)給予在老年患者中特別有用。23相似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，特別是對(duì)流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(shí)給予患者(例如，在醫(yī)護(hù)專家的同一次用藥咨詢或就診期間)。這些抗病毒化合物包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如(3R，4R，5S)_4-乙?；被鵢5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-l-環(huán)己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亞氨基甲基)_氨基]_2，6-脫水-3，4，5-三脫氧-D-甘油-D-半乳糖壬_2_烯酮酸，包括它們的酯(如乙酯)和鹽(如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(i-乙基丙氧基)-i-環(huán)己烯-i-羧酸的乙酯和磷酸鹽(1:l)，也稱為磷酸奧塞米韋(TAMIFLU)。概述術(shù)語"含有"包括"包含"以及"由…組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質(zhì)，例如X+Y。詞語"基本上"不排除"完全"，例如"基本上無"Y的組合物可完全無Y。該詞語"基本上"可視需要從本發(fā)明定義中省去。與數(shù)值x有關(guān)的術(shù)語"約"表示，例如x±10%。除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的方法不需要任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時(shí)，兩種組分可以相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合等。將動(dòng)物(具體是牛)材料用于培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，它們應(yīng)獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源?？傮w上，優(yōu)選在完全不含動(dòng)物來源的材料中培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)某化合物作為組合物的一部分給予人體時(shí)，該化合物可被合適的前藥所替換。當(dāng)使用細(xì)胞底物進(jìn)行重配或反向遺傳學(xué)方法時(shí)，優(yōu)選批準(zhǔn)用于人類疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞底物，例如歐洲藥典總綱5.2.3所述的細(xì)胞底物。優(yōu)選通過MPSRCH程序(牛津分子公司(OxfordMolecular))執(zhí)行的Smith-Waterman同源性檢索算法，利用仿射空位檢索測(cè)定多肽序列之間的相同性，其中參數(shù)為空位開放罰分=12、空位延伸罰分=1。本發(fā)明的實(shí)施方式按照參考文獻(xiàn)27和47的指導(dǎo)，將甲型和乙型流感病毒培養(yǎng)在MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中，而不用雞蛋。該培養(yǎng)液不含任何抗生素。澄清化最終的培養(yǎng)液以提供病毒顆粒，然后進(jìn)行層析和超濾/滲濾。按照參考文獻(xiàn)59的指導(dǎo)，利用13_丙內(nèi)酯(終濃度0.05%v/v;2-8。C溫育16-20小時(shí)，然后在37t:溫育2-2.5小時(shí)水解)滅活所得物質(zhì)中的病毒顆粒，而不利用甲醛滅活。然后利用CTAB裂解病毒顆粒，經(jīng)各種進(jìn)一步的加工步驟獲得含有純化的表面蛋白質(zhì)的最終單價(jià)散裝疫苗。最終的散裝物質(zhì)不含汞防腐劑、不含抗生素、不含甲醛、不含雞蛋-衍生的物質(zhì)。從散裝疫苗制備各劑量的疫苗，各含有A/H1N1、A/H3N2和B毒株的15ygHA。該疫苗已在臨床試驗(yàn)中給予了患者，其中對(duì)照患者接受雞蛋_衍生的Agri卯a(chǎn)l"(其可能包含甲醛和痕量的抗生素)。MDCK-衍生的疫苗耐受良好，免疫原性高(免疫學(xué)上不差于Agrippal)，符合評(píng)估流感疫苗的CHMP和CBER標(biāo)準(zhǔn)。三個(gè)不同批次的MDCK-衍生的疫苗誘24導(dǎo)了類似的免疫原性和安全性概況，證實(shí)該細(xì)胞培養(yǎng)物制備技術(shù)能產(chǎn)生一致的臨床結(jié)果。應(yīng)該理解，只是借助實(shí)施例描述了本發(fā)明，可作出改進(jìn)而仍屬于本發(fā)明的范圍和構(gòu)思內(nèi)。參考文獻(xiàn)[1]Vaccines(疫苗).(Plotkin禾POrenstein編)第4版，2004，ISBN:0-7216-9688-0.[2]W097/14434.[3]Poole和Mussett(1989)JBiolStand17:161-71.[4]Poole等.(1997)J.EndotoxinRes4:221-31[5]W002/28422.[6]W002/067983.[7]W002/074336.[8]W002/097072.[9]W02005/113756.[10]W001/21151.[ll]Huckriede等(2003)MethodsEnzymol373:74-91.[12]WorldHealth0rganisation(世界衛(wèi)生組織)(2005)EmerginglnfectiousDiseases11(10):1515—21.[13]Herlocher等.(2004)JInfectDis190(9):1627-30.[14]Le等.(2005)Nature437(7062):1108.[15]Hoffmann等.(2002)Vaccine20:3165-3170.[16]Subbarao等(2003)Virology305:192-200.[17]Liu等(2003)Virology314:580-590.[18]0zaki等(2004)J.Virol.78:1851-1857.[19]Webby等(2004)Lancet363:1099-1103.[20]W000/60050.[21]W001/04333.[22]美國(guó)專利6649372.[23]Neumann等.(2005)ProcNatlAcadSciUSA102:16825-9.[24]W02006/067211.[25]W001/83794.[26]Hoffmann等.(2000)Virology267(2):310-7.[27]W097/37000.[28]Brands等.(1999)DevBiolStand98:93-100.[29]Halperin等.(2002)Vaccine20:1240-7.[30]Tree等.(2001)Vaccine19:3444-50.[31]Kistner等.(1998)Vaccine16:960-8.[32]Kistner等(1999)DevBiolStand98:101-110.[33]Bruhl等.(2000)Vaccine19:1149—58.25[34]Pau等.(2001)Vaccine19:2716-21.[35]http://www.atcc.org/[36]http://locus,umdnj.edu/[37]W003/076601.[38]W02005/042728.[39]W003/043415.[40]WOO1/85938[41]W02006/108846[42]EP-A_1260581(W001/64846)[43]W02006/071563.[44]W02005/113758.[45]W02006/027698.[46]W003/023021[47]W003/023025[48]W097/37001.[49]Treanor等(1996)JInfectDis173:1467-70.[50]Keitel等.(1996)ClinDiagnLabImmunol3:507-10.[51]Umdblad(2001)BiotechnologyandAppliedBiochemistry34:195-197.[52]GuidanceforIndustry:BioanalyticalMethodValidation.(生物分析驗(yàn)證方法的工業(yè)指南)U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministrationCenterforDrugEvaluationandResearch(CDER)CenterforVeterinaryMedicine(CVM)(美國(guó)衛(wèi)生和人類服務(wù)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述疫苗不含汞防腐劑、不含抗生素以及不含甲醛。3.—種包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐劑、不含甲醛以及不含雞蛋-衍生的物質(zhì)。4.一種包含流感病毒抗原的疫苗，其中所述疫苗不含汞防腐劑、不含抗生素、不含甲醛以及不含雞蛋-衍生的物質(zhì)。5.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗具有低于O.1IU/ml的6.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，每15iig血凝素中宿主細(xì)胞DNA含量小于10ng。7.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是完整的病毒抗原。8.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是裂解病毒抗原。9.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是純化的表面糖蛋白抗原。10.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，所述抗原是病毒體。11.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含來自多于一種流感病毒毒株的抗原。12.—種制備流感病毒抗原的方法，包括以下步驟(i)在沒有雞蛋-衍生的物質(zhì)和抗生素存在下，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)流感病毒；(ii)在沒有甲醛存在下，滅活步驟(i)所培養(yǎng)的流感病毒；和(iii)在沒有硫柳汞存在下，由該滅活的流感病毒制備疫苗抗原制劑。全文摘要缺少以下組分中至少三種的流感疫苗汞防腐劑；抗生素；甲醛；和雞蛋衍生的物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述疫苗不含這四種組分。文檔編號(hào)A61K39/145GK101784283SQ200880103467公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2008年6月27日優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日發(fā)明者H·魯本,J·-P·格雷格森,J·范洛普申請(qǐng)人:諾華有限公司