本發(fā)明涉及納米技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種納米技術(shù)在羊胚胎提取中的應(yīng)用以及羊胚胎素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
背景技術(shù)：
自1912年，瑞士科學(xué)家卡爾教授首次發(fā)現(xiàn)羊胚胎細(xì)胞中有一種能使細(xì)胞恢復(fù)活力的物質(zhì)(稱之為羊胚胎素)以來。羊胚胎中含有活化細(xì)胞、增強生命系統(tǒng)免疫功能、恢復(fù)人體精力的多種物質(zhì)，這些物質(zhì)對人類抗衰老、治療和預(yù)防疾病得到了應(yīng)用。隨著人類對羊胚胎素用研究深入，羊胚胎素的提取與純化技術(shù)，對羊胚胎素在人類應(yīng)用中起決定性作用。具有高生物活性小分子羊胚胎素能快速被人體吸收利用，且安全、效果明顯，它通過增強人體免疫功能，調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌，加速細(xì)胞的分裂，修復(fù)受細(xì)胞，活化衰老細(xì)胞，使人體各細(xì)胞及組織達(dá)到年輕狀態(tài)，人體各機能均被激活，達(dá)到真正意義上的延緩衰老，治療和預(yù)防疾病。羊胚胎素包括細(xì)胞中含有蛋白質(zhì)、核酸、糖類、磷脂類、維生素、酶等。按常規(guī)方法提取的羊胚胎素中的大分子物質(zhì)多，成分復(fù)雜，過敏性高，活性低、生物利用率低。
羊胚胎素的生物活性高低和分子的大小能決定羊胚胎素是否可以達(dá)到上述效果。目前的提取方法主要以粉碎、生化提取、離心、微濾，整個生產(chǎn)過程中受熱量和化學(xué)物質(zhì)的影響，特別是細(xì)胞破碎后沒有對生物活性物質(zhì)保護(hù)，生物活性受到破壞較大，因此提取物中羊胚胎素的活性較低，其次在純化時采用微濾，成分復(fù)雜，不易吸收，過敏源多，再提取出來的羊胚胎素?zé)o質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不能保證其質(zhì)量。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種納米技術(shù)在羊胚胎提取中的應(yīng)用以及羊胚胎素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
1.一種從羊胚胎中制備羊胚胎提取液的方法，從羊胚胎的選取及處理開始，經(jīng)過組織破碎、細(xì)胞反復(fù)凍融、離心去雜、微濾，獲得羊胚胎提取液，包括下述步驟：
(1)羊胚胎選取與處理：其羊胚胎為孕期6-8周，脫母體后浸泡在生理鹽水中，30min內(nèi)置-20℃儲藏；
(2)組織破碎：去除羊胚胎腸胃雜質(zhì)，碎成碎片，絞肉機2次后用4-6℃生理鹽水制成肉漿，再用膠體磨研磨4次；
(3)細(xì)胞反復(fù)凍融：在-35±2℃和0℃反復(fù)凍融三次，每35±2℃時間凍融時間為12小時；
(4)離心去雜：采用冷凍離心機，確保離心室溫度在-8—-10℃；
(5)微濾：離心上清液經(jīng)濾紙過濾后，再經(jīng)0.8um、0.2um過濾，得羊胚胎提取液。
作為本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案，步驟(2)中所述生理鹽水與羊胚胎重量比例為15：1。
2.一種從羊胚胎提取液中分離純化得到羊胚胎素溶液的制備方法，通過不同納米遞度過濾，獲得羊胚胎素溶液，包括下述步驟：
(1)納濾：經(jīng)過微濾后的羊胚胎提取液，在無菌條件下采用不同納米遞度過濾，去掉分子量大于6000道爾頓的物質(zhì)(高分子物質(zhì)、細(xì)菌、病毒等)和分子量小于100道爾頓物質(zhì)(無機鹽類等)；
(2)納濾后的處理：納濾后的溶液充氮后密封保存，確保儲藏期因氧化導(dǎo)致生物活性降低，同時回收100道爾頓以下的液體循環(huán)利用，減少排放達(dá)到環(huán)保。
作為本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案，在無菌條件下指的是B級潔凈區(qū)內(nèi)。
作為本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案，不同納米遞度為10—100nm。
3.一種羊胚胎素溶液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，具體為：
性狀：本品為無色或微黃色液體。
鑒別：取本品，加40％氫氧化鈉溶液0.5ml，搖勻，再加1％硫酸銅溶液1ml,溶液顯紫紅色。
PH值：6.0～7.5；
蛋白質(zhì)：取本品2ml，加20％磺基水楊酸溶液1ml，混勻，不得發(fā)生混濁或沉淀；
多肽含量：不得低于6mg/ml；
高分子物質(zhì)：不得高于5.0％；
生物活性：不得低于30.0％；
貯藏：充氮密閉，-4℃以下保存；
有效期：24個月。
作為本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案，多肽含量的測定方法為福林酚測定法。
作為本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案，高分子物質(zhì)的測定方法為高效液相色譜法。
作為本發(fā)明更進(jìn)一步的技術(shù)方案，生物活性的測定方法為T細(xì)胞活性測定法-脫E受體法。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種羊胚胎提取和純化方法，解決了羊胚胎素中高分子物質(zhì)多、成分雜、過敏源多、生物活性低的原因。同時本發(fā)明建立了羊胚胎素溶液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，解決了羊胚胎提取后無標(biāo)準(zhǔn)檢測的問題。
本發(fā)明提供的提取方法，從羊胚胎原料到提取過程，整個過程在低溫(胚胎-20℃儲藏、組織破碎4-6℃、細(xì)胞反復(fù)凍融在-35±2℃、離心去雜在-8—-10℃)和細(xì)胞生理環(huán)境(生理鹽水環(huán)境下)條件下保證羊胚胎素的生物活性。本發(fā)明提供的純化方法，采用不同納米遞度過濾，去除了高分子物質(zhì)、細(xì)菌、病毒、無機鹽類等，選擇性留下100—6000道爾頓高生物活性物質(zhì)，納濾后的羊胚胎素溶液充入無菌氮氣后密封保存，確保儲藏期不會因氧化生物活性降低，同時回收100道爾頓以下的液體循環(huán)利用，減少排放達(dá)到環(huán)保。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
步驟一
羊胚胎的選擇和處理：經(jīng)發(fā)明人的反復(fù)試驗，原料的選擇與前期處理對產(chǎn)品的生物活性很重要，孕期6-8周羊胚胎，其胚胎生長最快時期，其胚胎各組織細(xì)胞中含生物活性物質(zhì)最高，脫母體后浸泡在生理鹽水中，30min內(nèi)置-20℃儲藏，對生物活性物質(zhì)沒有任何影響。
步驟二
組織破碎：先將羊胚胎解凍，解凍后清洗干凈，去除腸胃，剁成碎片，放入絞肉機中絞碎，重復(fù)2次，再用4-6℃生理鹽水(純化水加氯化鈉配制成0.9％生理鹽水，再滅菌好備用)，制成肉漿(生理鹽水與羊胚胎重量比例為15：1)。肉漿經(jīng)膠體磨研磨，重復(fù)4次，變成肉糊狀，前兩次膠磨應(yīng)快(30min/100kg羊胚胎)，后兩次膠磨稍慢(45min/100kg羊胚胎)，這樣膠磨產(chǎn)生的熱量，基本不會對溶液溫度產(chǎn)生影響，不會影響生物活性。反復(fù)膠磨使組織破碎。
步驟三
細(xì)胞反復(fù)凍融：將步驟二中的肉糊裝入5cm厚的容器中，密閉置于冷凍池中，-35±2℃時間12小時后，再解凍至0℃，重復(fù)三次。通過反復(fù)凍融，細(xì)胞破裂，活性物質(zhì)被凍出。盛裝容器不能過厚，否則反復(fù)凍融時中心溫度達(dá)到時太長且延長了反復(fù)凍融時間。
步驟四
離心去雜：將步驟三的凍融物解凍至4—6℃，攪拌30min，便于活性物質(zhì)均勻分散溶液中。離心時必須采用冷凍離心機，冷凍離心機設(shè)置溫度不得高于-12℃，這樣才能確保離心室工作溫度在-10℃左右，離心時間6min，離心速度4200轉(zhuǎn)/分鐘，使懸浮大顆粒全部沉淀。這樣離心出來的上清液中不影響微濾，如果離心時間過短或轉(zhuǎn)速偏小，微濾中濾膜很容易堵塞，微濾時間過長，影響生物活性。
步驟五
微濾：將步驟四中的上清液先經(jīng)濾紙過濾，再先后經(jīng)0.8um、0.2um微孔濾芯過濾，過濾過程中一定要注意溶液溫度，控制在4—6℃之間，溫度過高會影響生物活性，過濾過程中也應(yīng)按孔徑大小先后順序過濾，否則時間過濾較長。
步驟六
分離純化：經(jīng)過微濾后的提取液，在無菌條件下(B級潔凈區(qū))采用不同納米遞度過濾(10—100nm)，先后去年掉10萬道爾頓、1萬道爾頓、6000道爾頓的高分子物質(zhì)、細(xì)菌、病毒等，再去掉分子量小于100道爾頓物質(zhì)(無機鹽類等)，最終獲得100—6000道爾頓小分子高活性的羊胚胎素溶液。再將此溶液充無菌氮氣后-4℃密封保存。低溫和充氮能確保儲藏期生物活性降低。同時回收100道爾頓以下的液體，下批提取時可當(dāng)作部分提取水，循環(huán)利用減少排放，達(dá)到環(huán)保。
本發(fā)明實施的質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)：
檢測標(biāo)準(zhǔn)一
性狀：本品為無色或微黃色液體。
檢測標(biāo)準(zhǔn)二
鑒別：取本品，加40％氫氧化鈉溶液0.5ml，搖勻，再加1％硫酸銅溶液1ml,溶液顯紫紅色。
檢測標(biāo)準(zhǔn)三
PH值：用pH計測量，pH應(yīng)為6.0～7.5。
蛋白質(zhì)：取本品2ml，加20％磺基水楊酸溶液1ml，混勻，不得發(fā)生混濁或沉淀。
多肽含量(福林酚測定法)：取本品適量，加水制成每1ml中含多肽0.15mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取1.0ml，照福林酚測定法(附二)測定，從回歸方程中求出多肽含量。多肽不得低于6mg/ml。
高分子量物質(zhì)：
(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：用凝膠色譜柱(如TSK GEL 2005SWx1 7.8mm×300mm，5um)；流動相為三氟醋酸-乙腈-水(0.05：10：90)；檢測波長為214nm。理論板數(shù)按胰島素峰計算應(yīng)不得低于3000。
(2)對照品溶液的制備：取胰島素(分子量5800)適量，用流動相制成每1ml中含1mg的溶液，作為對照品溶液。
(3)供試品溶液的制備：取本品，加流動相稀釋成每1ml中含多肽1mg的溶液，作為供試品溶液。
(4)測定法：取對照品溶液和供試品溶液各20ul，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，將先于胰島素峰保留時間的峰視為高分子量物質(zhì)，按面積歸一化法計算，含高分子量物質(zhì)的量不得過5.0％。
生物活性：取本品適量，照T細(xì)胞活性測定法-脫E受體法測定，供試品管的E玫瑰花結(jié)百分率與對照管的E玫瑰花結(jié)百分率之差應(yīng)不低于30.0％。
貯藏：充氮密閉，-4℃以下保存。
有效期：24個月。
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法：
T細(xì)胞活性測定法-脫E受體法
本法系根據(jù)轉(zhuǎn)移因子可使脫E受體后的胸腺T細(xì)胞恢復(fù)其E受體功能，從而反映轉(zhuǎn)移因子的生物活性。
試劑：
(1)Hank’s液：將0.3％磷酸二氫鉀溶液，0.76％磷酸氫二鈉溶液，2％氯化鉀溶液及20％氯化鈉溶液依次按20：20：20：40比例混合，加葡萄糖1g，溶解混勻，用水稀釋至1000ml，并用4％碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至7.2～7.3(臨用時配制)。
(2)阿氏液：取氯化鈉0.420g，枸緣酸0.055g，枸緣酸鈉0.766g。葡萄糖2.05g，加水溶解并稀釋至100ml，滅菌。
(3)分離液：為淋巴細(xì)胞分離液。
(4)羊血：取綿羊靜脈血5ml，加入5ml阿氏液中，冰箱保存。
(5)固定液：取25％戊二醛溶液，3.5％碳酸氫鈉溶液及Hank’s液依次按1：1：38比例混合。
(6)姬姆薩染色液原液：取姬姆薩染料0.5g，加甘油33ml，55～60℃加熱至姬姆薩染料溶解，冷至室溫，加入33ml甲醇，室溫放置24小時后，用濾紙過濾，濾液即為原液。密封室溫保存。
(7)染色液：取姬姆薩染色液原液2ml，加Hank’s液6ml，搖勻，以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液待用。
操作法：
(1)脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液的制備：取新鮮豬胸腺，去脂肪并剪碎，加適量Hank’s液使成細(xì)胞懸液，經(jīng)100目篩過濾，每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清液，加入少量Hank’s液打勻，將此溶液加入已具有1/3濾液量的分離液的離心管中，以每分鐘2005轉(zhuǎn)離心20分鐘，小心吸出中間層的胸腺細(xì)胞，放入另一離心管中，加適量Hank’s液洗滌，搖勻，以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清液，洗滌一次后，在沉淀物中加入適量Hank’s液，混勻，45℃恒溫水浴保溫30分鐘(每隔5分鐘振搖一次)。以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清液，再加入適量Hank’s液，混勻后，置45℃恒溫水浴保溫30分鐘，取出后以每分鐘1500轉(zhuǎn)離心3～5分鐘，棄去上清液，用Hank’s液洗滌三次(操作同前)，最后用Hank’s液適當(dāng)稀釋并計數(shù)，使最終濃度為每1ml中3×106～5×106個細(xì)胞。
(2)綿羊紅血球懸液的制備：取適量羊血，用適量Hank’s液洗三次(同前)，棄去上清液，加適量Hank’s液稀釋并計數(shù)，使最終濃度為脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液濃度的8～10倍。
(3)供試品溶液的制備：取供試品，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。
(4)測定：取小試管6支，其中3支各加Hank’s液0.1ml作對照管，另3支各加供試品溶液0.1ml作測定管，每管中各加脫E受體胸腺T細(xì)胞懸液0.2ml，37℃保溫1小時后，加入綿羊紅血球懸液0.2ml，搖勻，以每分鐘500轉(zhuǎn)離心3分鐘，放入4℃冰箱過夜，次日取出，棄去上清液，每管中各加入固定液一滴，輕輕搖勻，靜置10分鐘，加入染色液2滴并搖勻，靜置15分鐘后開始計數(shù)，顯微鏡視野中淡藍(lán)色的較大的細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，共數(shù)計數(shù)板16個大方格上所有淋巴細(xì)胞的個數(shù)(不少于200個)，統(tǒng)計其中的E玫瑰花結(jié)形成的細(xì)胞數(shù)(結(jié)合3個以上綿羊紅細(xì)胞的淋巴細(xì)胞)，求得結(jié)花百分率，取平均值。即為供試品管或?qū)φ展艿钠骄怠?/p>
樣品活力＝供試品測定管E玫瑰花結(jié)百分率－對照管E玫瑰花結(jié)百分率。
福林酚測定法
試劑：
(1)堿性銅試液：取氫氧化鉀10g，碳酸鈉50g,加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g,加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合，作為乙液。臨用前，合并兩液，并加水至500ml。
(2)福林酚試液：取福林酚試劑1ml，加水稀釋至16ml，臨用前配制。
(3)對照品溶液的制備：取牛血清白蛋白對照品1支，精密稱取適量，加水溶解并稀釋成每1ml中含0.3mg的溶液，即得。
(4)供試品溶液的制備：精密量取本品1ml置50ml容量瓶中，用水稀釋至刻度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml,分別置具塞試管中，各加水至1.0ml,再分別加入堿性銅試液1.0ml，搖勻，各加入福林酚試液4.0ml,立即搖勻，置55℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘，置冷水浴中10分鐘，在650nm的波長處測定吸收度；同時以0號管作為空白，以吸收度為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)。
精密量取供試品溶液1.0ml,做平行試驗2份，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法，自“加入堿性銅試液”起，依次測定，自標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得供試品溶液的濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，即得。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。