本發(fā)明屬于生物藥物領(lǐng)域，具體涉及一種由四神丸制備的含藥血清及其制備方法和在治療結(jié)腸癌上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由于全球經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，城市化、工業(yè)化、人口老齡化進(jìn)程不斷加快，環(huán)境污染逐漸加重，生活方式不斷改變(尤其是飲食)，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率不斷升高，并呈持續(xù)上升趨勢。結(jié)腸癌(cancer of colon)是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，與飲食的關(guān)系最為密切，是我國九大常見惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌的首選治療方式仍然是盡早進(jìn)行外科手術(shù)切除，但是由于每個人身體狀況和病情不一樣，一般手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的幾率是很大的，而且手術(shù)價格昂貴。而中醫(yī)治療向來是尋求達(dá)到治本的目的，且費(fèi)用相對較低，因此尋求合適的中藥進(jìn)行開發(fā)、研究，成為國內(nèi)外學(xué)者堅(jiān)定不移的研究方向。已有學(xué)者在研發(fā)中藥治療疾病的進(jìn)程上取得了不小的成就，例如：2015年10月，藥學(xué)家屠呦呦女士因發(fā)現(xiàn)青蒿素治療瘧疾的新療法而獲得諾貝爾科學(xué)獎。因此新的植物型藥物的開發(fā)和研制有不可小覷的潛力。

中藥作為一類天然藥物，已經(jīng)在中國沿襲了幾千年。中藥具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，這與腫瘤是由于多環(huán)節(jié)突變而非單一原因而發(fā)生的、多級的、多途徑的和多病灶的特點(diǎn)是相吻合的，因此中藥在結(jié)腸癌的預(yù)防及治療中更有優(yōu)勢。本發(fā)明中用到的四神丸就是典型的中藥方劑。四神丸初次發(fā)現(xiàn)于宋代陳文忠著作的《陳氏小兒病源痘診方論》一書中，其由《普濟(jì)本事方》中記載的二神丸(即肉豆藉、補(bǔ)骨脂組成)和五味子散(即五味子、吳茱萸組方)兩劑藥方組成。兩劑藥方并用相輔相成，溫補(bǔ)脾腎，對固腸止瀉等癥狀藥用效果極佳。隨著時代的發(fā)展，該方己經(jīng)超出了原有方劑的應(yīng)用范圍，臨床中也以其作為基礎(chǔ)方廣泛應(yīng)用于各科室，并取得了良好的療效。我們現(xiàn)今用的四神丸是由補(bǔ)骨脂、吳茱萸、肉豆蔻、五味子、生姜和紅棗六位藥材組成的，是治療脾腎虛寒型結(jié)腸炎的中藥方劑，對過敏性結(jié)腸炎、慢性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎等癥均有良好療效，且已證實(shí)其能夠較佳地消除結(jié)腸炎相關(guān)的各種癥狀和有效修復(fù)、保護(hù)病人的腸粘膜。中藥的給藥方式主要有：口服給藥、灌腸給藥以及二者聯(lián)合用藥。因此運(yùn)用中藥預(yù)防與治療癌癥是中醫(yī)藥發(fā)展的必然趨勢。

中藥血清藥理學(xué)的相關(guān)研究在近年來中藥或中藥復(fù)方研究中有了新的進(jìn)展，它主要是通過模擬中藥或中藥復(fù)方在體內(nèi)的消化、吸收、轉(zhuǎn)化、代謝的一些過程，然后通過采集服用(或注射)中藥的動物的血液并分離血清，進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的一種新的方法。中藥服用或注射的方法及簡稱如下：靜脈注射(iv)、腹腔注射(ip)、口服(po)、皮下注射(ih)、灌胃(ig)、肌注(im)、靜滴(iv)等。這種實(shí)驗(yàn)方法的提出，既可以在一定程度上排除中藥或中藥復(fù)方直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的難以確定的因素干擾，也可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度大大提高，更重要的是中藥血清使療效更加顯著。蘆沖等研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮醇提物灌胃大鼠后獲得的含藥血清對HT-29人結(jié)腸癌細(xì)胞有抑制作用，作用機(jī)制可能不僅與抑制細(xì)胞生長有關(guān)，還與阻滯細(xì)胞生長周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。范欽等研究發(fā)現(xiàn)，九香蟲灌胃后處理得到的含藥血清孵育SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞，可促使結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并影響凋亡相關(guān)因子P53、FADD的表達(dá)，從而達(dá)到抗腫瘤作用。肖海娟等研究發(fā)現(xiàn)，腸胃清含藥血清能夠逆轉(zhuǎn)HCT116人結(jié)腸癌鉑類化療耐藥，其機(jī)制與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA損傷、誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。李素云等研究發(fā)現(xiàn)，扶正抑癌方含藥血清通過上調(diào)上皮鈣黏蛋白表達(dá)和下調(diào)神經(jīng)鈣黏蛋白的表達(dá)，抑制LoVo人結(jié)腸癌細(xì)胞的間葉表型細(xì)胞即發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，從而降低lovo細(xì)胞的侵襲力和運(yùn)動能力。目前常用的結(jié)腸癌細(xì)胞系有HCT116，HCT8，HT-29，LS174T，LoVo，SW480，SW620等。但暫未發(fā)現(xiàn)使用由四神丸含制備的藥血清對LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞做相關(guān)研究的報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種由四神丸制備的含藥血清；該含藥血清可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明還提供一種由四神丸制備的含藥血清的制備方法及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述的一種由四神丸制備的含藥血清，所述含藥血清為將四神丸對大鼠進(jìn)行灌胃后，采血得到。

其中，所述四神丸由肉豆蔻、補(bǔ)骨脂、五味子、吳茱萸和大棗組成，經(jīng)磨粉、煮沸、煎煮后，將提取液過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到。

所述所大鼠為清潔級SD雄性大鼠，大鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，體重為250～400g。

本發(fā)明所述的由川芎醇提物制備的含藥血清的制備方法，包括如下步驟：

(1)給大鼠按體重比灌胃四神丸(20-40)g/kg；

(2)末次灌胃后1-2h對大鼠進(jìn)行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置3-5h，離心，取上清，滅活后過濾除菌，得到含藥血清，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>

5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的含藥血清，其特征在于，步驟(1)所述灌胃每日1-2次，持續(xù)4-6d，末次禁食12-14h給藥。

作為優(yōu)選，步驟(3)所述離心為3000-5000rpm，4-6℃離心10-15min。

作為優(yōu)選，步驟(3)所述滅活為56-60℃滅活25-30min。

作為優(yōu)選，步驟(3)所述過濾除菌為通過濾膜過濾除菌，優(yōu)選為0.22um的濾膜。

本發(fā)明所述的由四神丸制備的含藥血清在制備治療結(jié)腸癌的藥物中應(yīng)用。

進(jìn)一步地，所述由四神丸制備的含藥血清在制備治療LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞的藥物中應(yīng)用。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明由四神丸制備的含藥血清根據(jù)四神丸溫補(bǔ)脾腎，固腸止瀉的特征，可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移。

2、本發(fā)明以LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞作為模型，使用四神丸灌胃大鼠后處理得到的含藥血清培養(yǎng)LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，對于抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡、抑制其轉(zhuǎn)移的效果明顯要優(yōu)于四神丸以及現(xiàn)有治療結(jié)腸癌的藥物；其中給大鼠按體重比灌胃四神丸(20-40)g/kg制備的含藥血清，取濃度為10％(與DMEM培養(yǎng)基體積比)的含藥血清抑制LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活率可以達(dá)到43.45％以下，促進(jìn)LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活率凋亡率達(dá)到33.54％以上；而四神丸和現(xiàn)有治療結(jié)腸癌的藥物抑制細(xì)胞存活率最好的效果僅為87.32％、74.72％，四神丸和現(xiàn)有治療結(jié)腸癌的藥物促進(jìn)凋亡率最好的效果為15.45％、15.28％；同時該含藥血清可以有效的抑制LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力，從而驗(yàn)證其具有抑制結(jié)腸癌的良好效果；該四神丸制備的含藥血清制備的藥物在治療結(jié)腸癌時也具有顯著的效果。

3、本發(fā)明的制備方法安全可控，并且便于操作、保管、貯存和運(yùn)輸。

附圖說明

圖1為實(shí)施例4給大鼠按體重比灌胃四神丸40g/kg制備的含藥血清以及對照組孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，Transwell細(xì)胞遷移檢測細(xì)胞遷移能力的示意圖；

圖2為實(shí)施例5給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg制備的含藥血清以及對照組孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，Transwell細(xì)胞遷移檢測細(xì)胞遷移能力的示意圖；

圖3為實(shí)施例5給大鼠按體重比灌胃四神丸20g/kg制備的含藥血清以及對照組孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，Transwell細(xì)胞遷移檢測細(xì)胞遷移能力的示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

由四神丸制備的含藥血清

(1)首先稱取肉豆蔻(煨)200g、補(bǔ)骨脂(鹽炒)400g、五味子(醋制)200g、吳茱萸(制)100g、大棗(去核)200g，全部購買于北京同仁堂天然藥物(唐山)有限公司，經(jīng)磨粉、煎煮、提取后合并提取液，將提取液通過200目篩網(wǎng)過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到四神丸。

(2)給400g清潔級SD雄性大鼠按體重比灌胃四神丸40g/kg，每日1次，持續(xù)4d，末次禁食12h給藥；

(2)末次灌胃后1h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進(jìn)行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置3h，3000rpm，4℃離心15min，取上清，56℃滅活30min后通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存于－80℃冰箱備用。

實(shí)施例2

由四神丸制備的含藥血清

(1)首先稱取肉豆蔻(煨)200g、補(bǔ)骨脂(鹽炒)400g、五味子(醋制)200g、吳茱萸(制)100g、大棗(去核)200g，全部購買于北京同仁堂天然藥物(唐山)有限公司，經(jīng)磨粉、煎煮、提取后合并提取液，將提取液通過200目篩網(wǎng)過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到四神丸。

(2)給300g清潔級SD雄性大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg，每日2次，持續(xù)6d，末次禁食14h給藥；

(2)末次灌胃后2h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進(jìn)行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置5h，5000rpm，6℃離心10min，取上清，60℃滅活25min后通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清分裝，凍存于－80℃冰箱備用。

實(shí)施例3

由四神丸制備的含藥血清

(1)首先稱取肉豆蔻(煨)200g、補(bǔ)骨脂(鹽炒)400g、五味子(醋制)200g、吳茱萸(制)100g、大棗(去核)200g，全部購買于北京同仁堂天然藥物(唐山)有限公司，經(jīng)磨粉、煎煮、提取后合并提取液，將提取液通過200目篩網(wǎng)過濾并且蒸餾濃縮得到膏體，再經(jīng)冷凍干燥后粉碎得到四神丸。

(2)給250g清潔級SD雄性大鼠按體重比灌胃四神丸20g/kg，每日2次，持續(xù)5d，末次禁食12h給藥；

(2)末次灌胃后2h對大鼠用戊巴比妥鈉麻醉進(jìn)行麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血；

(3)將血液靜置3h，5000rpm，4℃離心10min，取上清，60℃滅活25min后通過0.22μm濾膜過濾除菌，得含藥血清，分裝，凍存于－80℃冰箱備用。

實(shí)施例4

將實(shí)施例3給大鼠按體重比灌胃四神丸40g/kg后處理得到的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞。

將LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞解凍復(fù)蘇后加入含有(體積比)10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中并置于5％CO₂(細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)環(huán)境，CO₂體積分?jǐn)?shù)為5％)，飽和濕度95％，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常培養(yǎng)時約每天更換1次培養(yǎng)液，等到細(xì)胞生長融合度達(dá)到70％-80％時進(jìn)行傳代培養(yǎng)；傳代培養(yǎng)時首先棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入37℃磷酸緩沖鹽溶液(PBS)液洗瓶2次，在25cm²培養(yǎng)瓶中加入2mL濃度為0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/L的胰蛋白酶溶液)進(jìn)行消化。然后在倒置顯微鏡下仔細(xì)隨時觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙變大時終止消化。接下來?xiàng)壢ヒ让溉芤?，加入?體積比)10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基之后用吸管輕柔吹打使貼壁細(xì)胞懸浮。緊接著將含懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，1500rpm離心5min，棄上清液。將細(xì)胞重新懸浮于5mL含(體積比)10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)束，選擇合適濃度將細(xì)胞分裝到新的無菌培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)。最后6h后可見細(xì)胞貼壁，以后每2-3天換液次，待細(xì)胞長滿瓶底70％-80％后再次消化傳代。

取4-6代的生長良好，融合度約為60％-70％的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。呈亞融合狀態(tài)的細(xì)胞，輕柔吹打配成單細(xì)胞懸液并接種于96孔培養(yǎng)板，24孔培養(yǎng)板以及Tranwell鋪板，細(xì)胞貼壁生長24h后用各個分組對細(xì)胞進(jìn)行孵育24h處理，具體分組情況如下：

對照組(共設(shè)6組，組1-組6)：

1、空白對照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

2、胎牛血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(所述血清為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為10％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

3、空白血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(血清采集方法與實(shí)施例1相同，不同在于沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為10％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

4、四神丸對照組：用四神丸與沒有灌胃的大鼠得到的血清進(jìn)行混合(血清采集方法與實(shí)施例1相同，不同在于沒有灌胃，四神丸與實(shí)施例1的大鼠體重的重量比為40g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水40g/kg得到的血清(血清采集方法與實(shí)施例1相同，不同之處四神丸換成生理鹽水)加入到DMEM培養(yǎng)液中加入，血清濃度(體積比)為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

6、現(xiàn)有藥物對照組：用現(xiàn)有治療結(jié)腸癌藥物5-Fu(5-氟尿嘧啶)與沒有灌胃的大鼠得到的血清進(jìn)行混合(血清采集方法與實(shí)施例1相同，不同在于沒有灌胃，5-Fu與實(shí)施例1的大鼠體重的重量比為40g/kg，5-Fu購買于上海旭東海普藥業(yè)有限公司)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

對照組中沒有設(shè)置5-氟尿嘧啶灌胃制備含藥血清對照組及5-氟尿嘧啶注射制備含藥血清對照組是由于5-氟尿嘧啶注射是其常用方法，不適合灌胃使用，而在本實(shí)施例中注射就失去其本身對照組的意義。

處理組(共設(shè)2組，組7和組8)：

按實(shí)施例1給大鼠按體重比灌胃四神丸40g/kg制得的含藥血清加入到DMEM培養(yǎng)液中，配制出含藥血清濃度(體積比)為10％和15％兩種DMEM培養(yǎng)液，分別用濃度10％和15％含藥血清DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h。

實(shí)施例5

將實(shí)施例2給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg后處理得到的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，具體的細(xì)胞培養(yǎng)方法與實(shí)施例4相同；

對照組(共設(shè)6組，組1-組6)：

1、空白對照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

2、胎牛血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(所述血清為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為10％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

3、空白血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(血清采集方法與實(shí)施例2相同，不同在于沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為10％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

4、四神丸對照組：用四神丸與沒有灌胃的大鼠得到的血清進(jìn)行混合(血清采集方法與實(shí)施例2相同，不同在于沒有灌胃，四神丸與實(shí)施例2大鼠體重的重量比為30g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水30g/kg得到的血清(血清采集方法與實(shí)施例2相同，不同之處四神丸換成生理鹽水)加入到DMEM培養(yǎng)液中加入，血清濃度(體積比)為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

6、現(xiàn)有藥物對照組：用現(xiàn)有治療結(jié)腸癌藥物5-Fu(5-氟尿嘧啶)與沒有灌胃的大鼠得到的血清進(jìn)行混合(血清采集方法與實(shí)施例2相同，不同在于沒有灌胃，5-Fu與實(shí)施例2大鼠體重的重量比為30g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清與DMEM培養(yǎng)液重量比為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

處理組(共設(shè)2組，組7和組8)：

按實(shí)施例2給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg制得的含藥血清加入到DMEM培養(yǎng)液中，配制出含藥血清濃度(體積比)為10％和15％兩種DMEM培養(yǎng)液，分別用濃度10％和15％含藥血清DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h。

實(shí)施例6

將實(shí)施例3給大鼠按體重比灌胃生理鹽水20g/kg后處理得到的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，具體的細(xì)胞培養(yǎng)方法與實(shí)施例4相同；

對照組(共設(shè)4組)：

對照組(共設(shè)6組，組1-組6)：

1、空白對照組：用無血清DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

2、胎牛血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(所述血清為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購自杭州四季青生物科技有限公司)，血清濃度(體積比)為10％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

3、空白血清對照組：DMEM培養(yǎng)液中僅加入血清(血清采集方法與實(shí)施例2相同，不同在于沒有灌胃)，血清濃度(體積比)為10％，該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

4、四神丸對照組：用四神丸與沒有灌胃的大鼠得到的血清進(jìn)行混合(血清采集方法與實(shí)施例3相同，不同在于沒有灌胃，四神丸與實(shí)施例3大鼠體重的重量比為20g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清濃度(體積比)為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

5、生理鹽水對照組：給大鼠按體重比灌胃生理鹽水20g/kg得到的血清(血清采集方法與實(shí)施例3相同，不同之處四神丸換成生理鹽水)加入到DMEM培養(yǎng)液中加入，血清濃度(體積比)為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

6、現(xiàn)有藥物對照組：用現(xiàn)有治療結(jié)腸癌藥物5-Fu(5-氟尿嘧啶)與沒有灌胃的大鼠得到的血清進(jìn)行混合(血清采集方法與實(shí)施例3相同，不同在于沒有灌胃，5-Fu與實(shí)施例3大鼠體重的重量比為20g/kg)，然后加入到DMEM培養(yǎng)液中，血清與DMEM培養(yǎng)液重量比為10％，用該DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h；

處理組(共設(shè)2組，組7和組8)：

按實(shí)施例3給大鼠按體重比灌胃四神丸20g/kg制得的含藥血清加入到DMEM培養(yǎng)液中，配制出含藥血清濃度(體積比)為10％和15％兩種DMEM培養(yǎng)液，分別用濃度10％和15％含藥血清DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞24h。

試驗(yàn)例1MTT方法檢測藥物對LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性的作用

MTT全稱3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃色的染料。處于增殖期的活細(xì)胞細(xì)胞線粒體中含有的琥珀脫氫酶可使外源性的MTT還原成難溶的針狀Formazan結(jié)晶，呈藍(lán)紫色，并沉淀在活細(xì)胞中，細(xì)胞活力與Formazan的形成量成正比，DMSO能使Formazan結(jié)晶溶解，使用酶標(biāo)儀于波長570nm處測定吸收值，以此間接反映細(xì)胞增殖的情況。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

分別取實(shí)施例4，5，6各分組孵育后制備的96孔板的細(xì)胞，每孔定量加100μL含(體積比)15％胎牛血清(FBS)完全培養(yǎng)基；然后置于5％CO₂，飽和濕度95％，37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24～72h；培養(yǎng)終止前4h加入10μL/孔(濃度為5mg/mL)的MTT；繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸棄上清培養(yǎng)液后加100μL/孔二甲基亞砜(DMSO)終止反應(yīng)，于振蕩器上震蕩10min左右，使結(jié)晶物充分溶解；酶標(biāo)儀570nm檢測OD值，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。記錄結(jié)果，計(jì)算存活率。

細(xì)胞存活率(％)＝處理組平均OD值/對照組平均OD值×100％。

結(jié)果如1至3所示。

表1 40g/kg的四神丸灌胃大鼠時MTT法檢測LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活率

*表示與對照組比較差異顯著

表2 30g/kg的四神丸灌胃大鼠時MTT法檢測LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活率

*表示與對照組比較差異顯著

表3 20g/kg的四神丸灌胃大鼠時MTT法檢測LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活率

*表示與對照組比較差異顯著

由表1至3可知，給大鼠按體重比分別灌胃四神丸40、30、20g/kg制備得到的含藥血清，當(dāng)使用重量比10％和15％的含藥血清時LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活率可以達(dá)到43.45％和43.03％以下，與四神丸對照組的細(xì)胞存活率以及現(xiàn)有藥物對照組的細(xì)胞存活率相比具有明顯的優(yōu)勢，都具有很好的抑制LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活效果，說明本發(fā)明實(shí)施例制備的含藥血清具有良好的抑制LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞的存活的作用。

由表2可知，給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg制得的含藥血清效果最好，10％和15％含藥血清組的細(xì)胞存活率分別是40.63％，40.58％；15％含藥血清組時細(xì)胞存活率為40.58％，與10％含藥血清組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，通過給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg制得的含藥血清，使用其10％的含藥血清就可以取得良好的抑制LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活效果。

試驗(yàn)例2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

磷脂酞絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在鞘液的約束和包圍下，待測樣本的細(xì)胞排成單列由流動室噴嘴高速噴出，而形成細(xì)胞液柱。液柱在通過檢測區(qū)時，在入射激光束的照射下可產(chǎn)生側(cè)向散射光(SSC)和前向散射光(FSC)，它們分別反映細(xì)胞顆粒度和大小，根據(jù)這些特性將細(xì)胞分類。樣本經(jīng)一種或幾種特殊熒光標(biāo)記后，可在激光束的激發(fā)下產(chǎn)生特定熒光，該特定熒光可被光學(xué)系統(tǒng)檢測并分析，由此得到相應(yīng)的各種細(xì)胞特性。AnnexinV是一種分子量35～36kDa的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行FITC標(biāo)記，以標(biāo)記了AnnexinV作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

分別取實(shí)施例4，5，6各分組孵育后制備的24孔板的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)上清后每孔加入0.5mL濃度為0.25％的胰蛋白酶(即2.5g/L的胰蛋白酶溶液)，在倒置顯微鏡下觀察待細(xì)胞開始變圓，加少量含血清培養(yǎng)液，終止消化，吹打懸浮細(xì)胞后移至離心管中，1000rpm下離心10min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，用250μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。調(diào)節(jié)其濃度為1×10⁶/mL，取100μL細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入5μL AnnexinVFITC和10μL 20μg/mL的PI溶液，混勻后室溫避光孵育15min，在反應(yīng)管中加入400μL PBS，上流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件ModFitLT3.0分析軟件分析細(xì)胞周期細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次；結(jié)果見表4-6所示。

表格40g/kg的四神丸灌胃大鼠時LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的變化

*表示與對照組比較差異顯著

表5 30g/kg的四神丸灌胃大鼠時LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的變化

*表示與對照組比較差異顯著

表6 20g/kg的四神丸灌胃大鼠時LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的變化

*表示與對照組比較差異顯著

由表1-3可知，給大鼠按體重比分別灌胃四神丸40、30、20g/kg制備得到的含藥血清，當(dāng)使用重量比10％和15％的含藥血清時LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞存活率可以達(dá)到33.54％和33.47％以上，與四神丸對照組的細(xì)胞存活率以及現(xiàn)有藥物對照組的細(xì)胞存活率相比具有明顯的優(yōu)勢，都可以使LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率大大增加，說明本發(fā)明實(shí)施例制備的含藥血清具有良好的促進(jìn)LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡的作用。

由表2可知，給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg制得的含藥血清效果最好，10％和15％含藥血清組的細(xì)胞凋亡率分別是35.71％，35.38％；15％含藥血清組時細(xì)胞存活率為35.38％，與10％含藥血清組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，通過給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg制得的含藥血清，使用其10％的含藥血清就可以取得良好的促使LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡效果。

試驗(yàn)例3Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測四神丸含藥血清對細(xì)胞侵襲能力的影響

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)是將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的腫瘤細(xì)胞種在上室內(nèi)，下室加入含F(xiàn)BS或某些特定的趨化因子的培養(yǎng)液，由于聚碳酸酯膜具有通透性，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室遷移，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量就能反應(yīng)細(xì)胞的遷移能力。

分別取實(shí)施例4，5，6的經(jīng)過各個分組孵育的Transwell鋪板細(xì)胞，細(xì)胞的終濃度大小約為5×10⁵個/mL；24孔板的下室內(nèi)加入500μL的含(體積比)20％FBS的DMEM，在Transwell小室內(nèi)加入100μL的細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)24h；細(xì)胞培養(yǎng)完成后，輕提Transwell小室，傾倒室內(nèi)的培養(yǎng)基，用適量的PBS將細(xì)胞洗滌2遍，之后每孔加入1mL 4％的多聚甲醛(4％的多聚甲醛為4g多聚甲醛融于100mLPBS中制得；PBS緩沖液的配制：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24，加入800mL去離子水，充分?jǐn)嚢瑁肏Cl調(diào)節(jié)pH值至7.4，補(bǔ)充去離子水定容至1000mL，高壓蒸汽滅菌，保存于4℃。)固定細(xì)胞15min，PBS再清洗3次，每次5min，再使用0.1％的結(jié)晶紫染色細(xì)胞30min，用PBS洗滌3次，每次5min，使用超純水輕輕沖洗濕潤小室表面的細(xì)胞，最后用濕潤棉簽輕輕擦去未遷移過膜的細(xì)胞，風(fēng)機(jī)風(fēng)干；倒置Transwell小室，顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。于顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察細(xì)胞，并計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。

圖1為實(shí)施例1給大鼠按體重比灌胃四神丸40g/kg制備的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，Transwell細(xì)胞遷移檢測細(xì)胞遷移能力，具體分組參照實(shí)施例4，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4四神丸對照組；5生理鹽水對照組；6現(xiàn)有藥物對照組；7濃度(體積比)10％含藥血清組；8濃度(體積比)15％含藥血清組。圖中＊為P<0.05，差異顯著。

圖2為實(shí)施例2給大鼠按體重比灌胃四神丸30g/kg制備的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，Transwell細(xì)胞遷移檢測細(xì)胞遷移能力，具體分組參照實(shí)施例5，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4四神丸對照組；5生理鹽水對照組；6現(xiàn)有藥物對照組；7濃度(體積比)10％含藥血清組；8濃度(體積比)15％含藥血清組。圖中＊為P<0.05，差異顯著。

圖3為實(shí)施例3給大鼠按體重比灌胃四神丸20g/kg制備的含藥血清孵育LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞，Transwell細(xì)胞遷移檢測細(xì)胞遷移能力，具體分組參照實(shí)施例6，其中1空白對照組；2胎牛血清對照組；3空白血清對照組；4四神丸對照組；5生理鹽水對照組；6現(xiàn)有藥物對照組；7濃度(體積比)10％含藥血清組；8濃度(體積比)15％含藥血清組。圖中＊為P<0.05，差異顯著。

從圖1至3可以看出，給大鼠按體重比分別灌胃四神丸40g/kg、30g/kg和20g/kg后經(jīng)腹主動脈取血離心后，將其配制成與DMEM培養(yǎng)液體積比10％、15％的含藥血清對LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行孵育，結(jié)果表明含藥血清孵育的LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞相對于4四神丸對照組、6現(xiàn)有藥物對照組遷移能力顯著降低，說明本發(fā)明實(shí)施例制備的含藥血清具有良好的抑制LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的作用。