本發(fā)明涉及一種山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗及其生產(chǎn)方法。屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
養(yǎng)羊業(yè)與國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和各族人民生活水平的提高關(guān)系十分密切，特別是進(jìn)入21世紀(jì)后，我國養(yǎng)羊業(yè)得到快速發(fā)展，成果顯著，養(yǎng)羊業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)中的比重也逐年提高。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)數(shù)據(jù)，2013年，中國大陸地區(qū)的綿羊養(yǎng)殖量即達(dá)1.91億頭，山羊1.83億頭，合計3.74億頭。2014年，中國大陸地區(qū)的綿羊養(yǎng)殖量為2.02億頭，山羊1.88億頭，合計3.90億頭。雖然我國養(yǎng)羊數(shù)量位居世界首位，但與養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的國家相比，疫病防控水平較薄弱，這在一定程序上制約了我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。2014年，國家現(xiàn)代肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系分別對全國肉羊主產(chǎn)區(qū)內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、甘肅、青海等14個省區(qū)市的近60個縣(區(qū)、旗)的肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)行專題調(diào)研后形成的《2014年全國肉羊產(chǎn)業(yè)調(diào)研報告》中指出：從調(diào)查的總體情況看，當(dāng)前對我國肉羊產(chǎn)業(yè)危害最為嚴(yán)重的傳染病有羊支原體肺炎(傳染性胸膜肺炎)、鏈球菌病、梭菌病、羊痘、羊傳染性膿皰(羊口瘡)、羔羊痢疾和羊腸毒血癥。這些病均引起不同程度的死亡，養(yǎng)羊戶損失嚴(yán)重。其中最引人關(guān)注的是近年來發(fā)生嚴(yán)重的羊支原體肺炎，飼養(yǎng)密集的規(guī)?；驁龊徒?jīng)過長途運輸?shù)难蛑谎蛑гw肺炎的發(fā)病率很高，死亡嚴(yán)重。在寧夏、安徽、云南和四川調(diào)研時，發(fā)現(xiàn)所有的規(guī)?；驁龆即嬖谘騻魅拘孕啬し窝?，只是危害的程度不同。
山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleurpneumonia,CCPP)是由山羊支原體山羊肺炎亞種(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp，引起的一種山羊特有的急性或慢性高度接觸性傳染病，以呈現(xiàn)纖維素性肺炎和胸膜炎為特征,發(fā)病率為22％～30％，個別地區(qū)高達(dá)60％～80％，死亡率15％～30％。該病在非洲、亞洲等數(shù)十個國家和地區(qū)都有流行，對山羊養(yǎng)殖業(yè)帶來了較為嚴(yán)重的損失，被世界動物衛(wèi)生組織列為B類傳染病。我國于1947年首發(fā)于甘肅,繼而在內(nèi)蒙古、四川、山東、湖北、河北、云南、江西、江蘇等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。近幾年，在湖南、河南、貴州、重慶、內(nèi)蒙等地區(qū)都有CCPP的報道，給山羊養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。
目前，我國預(yù)防山羊傳染性胸膜肺炎，主要依靠中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研發(fā)的“山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗”，該疫苗已在我國廣泛使用近60年，長期的臨床實踐證明該疫苗具有極好的臨床免疫保護(hù)效力。但原疫苗采用強毒氣管注射山羊，采集肺組織制成山羊傳染性胸膜肺炎組織滅活疫苗，該疫苗不適宜工業(yè)化生產(chǎn)，存在散毒的危險；肺組織中雜菌含量高，所制備的疫苗易出現(xiàn)過敏反應(yīng)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于制備出采用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)工藝生產(chǎn)的山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，用于預(yù)防山羊傳染性胸膜肺炎。
本發(fā)明技術(shù)方案
1.一種山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，其特征在于所述滅活疫苗含有采用EZH液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的山羊支原體山羊肺炎亞種抗原。
2.本發(fā)明所述山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，其特征在于所述山羊支原體山羊肺炎亞種抗原生產(chǎn)菌株為C87001株。
3.本發(fā)明所述山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，其特征在于所述液體培養(yǎng)基為EZH液體培養(yǎng)基，由如下組分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉湯粉10.5％、1％酚紅0.1％，余量為注射用水；用滅菌1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.8，經(jīng)0.22μm過濾除菌。
4.本發(fā)明所述山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于用所述山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株作為疫苗生產(chǎn)菌株，接種適宜培養(yǎng)基，培養(yǎng)后收獲培養(yǎng)物經(jīng)濃縮、滅活，加礦物油佐劑混合乳化制成山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗。
本發(fā)明具體實施方式
1.山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗的制備
(1)生產(chǎn)和檢驗用菌種 山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株生產(chǎn)用基礎(chǔ)種子，山羊支原體山羊肺炎亞種C87002株為疫苗檢驗用菌種，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供(該菌原分類命名為絲狀支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasma mycoides suhsp.capri Edward and Freundt)(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p89)。)。
(2)一級種子繁殖及鑒定 取C87001株凍干菌種1支，接種含15％馬血清的EZH液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)3～5日，當(dāng)培養(yǎng)基pH值下降至7.0左右時，作為制苗用一級種子。
(3)二級種子繁殖及鑒定 取一級種子，接種含15％馬血清的EZH液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)3～5日，當(dāng)培養(yǎng)基pH值下降至7.0左右時，作為制苗用二級種子。
(4)制苗用抗原 制備取合格的二級種子，按培養(yǎng)基總量的2％接種含15％馬血清的EZH液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物pH值下降到7.0左右時，終止培養(yǎng)。取樣進(jìn)行純粹檢驗及活菌滴度測定?；罹味葢?yīng)≥1×109.0CCU/ml。
(5)抗原濃縮 采用2萬截留分子量(MW)超濾濃縮系統(tǒng)濃縮15倍(V/V)。
(6)滅活 按濃縮抗原總量的0.01％加入硫柳汞，充分混勻，在15～25℃作用10小時，期間攪拌數(shù)次。滅活結(jié)束后，2～8℃保存，應(yīng)不超過30日，取樣進(jìn)行半成品檢驗。
(7)疫苗配制 將油佐劑導(dǎo)入油相罐內(nèi)，以至少121配高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫備用。根據(jù)滅活前活菌滴度測定結(jié)果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)將濃縮后的抗原稀釋至每1ml含1m109.0CCU菌體。將油相加入乳化罐內(nèi)，以80～100r/min攪拌，同時按1:1(V/V)的比例，緩慢加入水相，加完后攪拌5～10min，用乳化機以5600r/min，循環(huán)乳化10～20min。乳化后取樣進(jìn)行檢驗，合格后分裝。
本發(fā)明以上所述液體培養(yǎng)基為EZH液體培養(yǎng)基，由如下組分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉湯粉10.5％、1％酚紅0.1％，余量為注射用水；用滅菌1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.8，經(jīng)0.22μm過濾除菌。
2.山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗的檢驗
(1)性狀
外觀 乳白色或淡黃色乳劑。
劑型 油包水型(W/O)。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴(kuò)散。
穩(wěn)定性 吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15min，管底析出的水相應(yīng)不得超過0.5ml。
黏度 按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定，應(yīng)符合規(guī)定。
(2)裝量檢查 按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會，中華人民共和國獸藥典，二〇一〇年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，以下稱《中國獸藥典》)附錄進(jìn)行檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
(3)無菌檢驗 按《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。
(4)安全檢驗 用體重1.5～2.0kg健康家兔5只，各肌肉注射疫苗1.0ml；用1月齡的健康易感山羊2只，各分點肌肉注射疫苗4.0ml，均觀察10日。應(yīng)全部健活。
(5)效力檢驗 用體重至少為20kg、1～3歲的健康易感山羊4只，各頸部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml。21日后連同對照山羊3只，各氣管注射山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株肺組織乳劑4.0ml，觀察30日。對照山羊應(yīng)全部發(fā)病，免疫山羊應(yīng)至少保護(hù)3只。
(6)汞類防腐劑殘留量測定 按《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定，應(yīng)符合規(guī)定。
本發(fā)明涉及生物材料資源信息
山羊支原體山羊肺炎亞種(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)C87001株生產(chǎn)用基礎(chǔ)種子，山羊支原體山羊肺炎亞種C87002株為疫苗檢驗用菌種，該類菌原分類命名為絲狀支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasma mycoides suhsp.capri Edward and Freundt)C87001株和C87002株，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002年，p89)。
本發(fā)明的積極意義
本發(fā)明涉及一種山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明采用山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株，接種適宜培養(yǎng)基，收獲培養(yǎng)物，經(jīng)濃縮、硫柳汞滅活后，加礦物油佐劑混合乳化制成，用于預(yù)防山羊支原體山羊肺炎亞種引起的山羊傳染性胸膜肺炎。本發(fā)明采用液體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)工藝生產(chǎn)山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，較原組織滅活疫苗具有明顯的優(yōu)勢，即大大降低了疫苗生產(chǎn)過程中的生物安全風(fēng)險、降低了生產(chǎn)成本，且所制備的疫苗不易出現(xiàn)過敏反應(yīng)，安全性更高。
實施例
以下實施例為進(jìn)一步說明本發(fā)明，不對本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案構(gòu)成限制。
實施例1
——疫苗制備及檢驗
按照確定的生產(chǎn)工藝，制備了3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1.材料
(1)菌種 生產(chǎn)用菌種：山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001株，F(xiàn)8代，活菌滴度為1×109.0CCU/ml；檢驗用菌種：山羊傳染性胸膜肺炎C87002株組織凍干毒，代號87002，代次：52代，規(guī)格：1.0g/支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。
(2)培養(yǎng)基 EZH液體培養(yǎng)基及無菌檢驗用培養(yǎng)基、由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基組提供。
所述EZH液體培養(yǎng)基，由如下組分(W/W)制成:水解乳蛋白3.5％、酵母粉1.5％、葡萄糖1.5％、PPLO肉湯粉10.5％、1％酚紅0.1％，余量為注射用水；用滅菌1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.8，經(jīng)0.22μm過濾除菌。
(3)油佐劑 Montanide ISA 50V佐劑，法國SEPPIC公司生產(chǎn)。
(4)實驗動物 試驗用山羊，1歲齡，健康，無皮膚病、寄生蟲感染，經(jīng)山羊傳染性胸膜肺炎支原體F38株、綿羊肺炎支原體Y98株及布魯氏桿菌病等血清學(xué)檢驗均為陰性，來自甘肅省某養(yǎng)羊廠。家兔，體重1.5～2.0kg、健康，來自中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠實驗動物場。
(5)過濾器(Polygard CR，0.22μm)：反應(yīng)罐(福州福爾特公司)；超濾濃縮設(shè)備(Millipore公司產(chǎn)品，Pellicon2盒式濾器，采用Biomax 2萬截留分子量，改良聚醚砜材料，0.5m2膜面積膜堆)；乳化設(shè)備(德國產(chǎn)IKA 2000/4型乳化機)。
2.抗原制備與檢驗
(1)將山羊傳染性胸膜肺炎支原體C87001株生產(chǎn)種子按培養(yǎng)基總量2％的比例接種含15％的馬血清EZH液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)，待培養(yǎng)物pH值下降至7.0左右，收獲培養(yǎng)物，收獲菌液。采用此方法連續(xù)制備3批菌液，同時抽樣進(jìn)行純粹檢驗、活菌滴度測定。
(2)抗原檢驗
1)純粹檢驗 按《中國獸藥典》附錄方法檢驗，均純粹。
2)活菌滴度測定 將待測樣品用含15％馬血清的EZH液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍系列稀釋至10-12，同時設(shè)未加菌液的含15％馬血清EZH液體培養(yǎng)基作為陰性對照。置37℃培養(yǎng)7日，培養(yǎng)基顏色改變的最高稀釋度即為待測樣品的滴度。用3份樣品的平均滴度，作為菌液滴度(CCU/ml)。檢驗結(jié)果見表1。
表1 實驗室3批制品培養(yǎng)菌液的純粹檢驗和活菌滴度檢驗結(jié)果
注：“-”表示純粹檢驗結(jié)果為純粹。
從表1可以看出，實驗室3批制品均純粹，濃縮前菌液活菌滴度達(dá)7×109.0～1×1010.0CCU/mll。
(3)制苗抗原的濃縮
將3批檢驗合格的抗原培養(yǎng)物，分別以2萬分子量內(nèi)壓式超濾膜堆濃縮超濾15倍，濃縮后抗原量為原液量的1/15。
(4)菌液的滅活
按0.01％比例將硫柳汞加入濃縮菌液，充分混勻，分別在室溫20℃滅活10小時，期間攪拌5次。滅活后，2～8℃保存，并無菌抽樣進(jìn)行半成品檢驗。
(5)半成品檢驗
1)無菌檢驗 每批滅活抗原按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄方法進(jìn)行檢驗，均無細(xì)菌及霉菌生長。
2)滅活檢驗 取滅活抗原接種含15％馬血清的EZH液體培養(yǎng)基2支，每支0.2ml，置37℃培養(yǎng)5日，均無支原體生長。檢驗結(jié)果見表2。
表2 3批制品的半成品檢驗結(jié)果
注：“-”表示無細(xì)、菌霉菌生長。
從表2可以看出，實驗室3批制品的抗原滅活完全。
(6)疫苗制備
1)抗原稀釋 據(jù)滅活前活菌滴度測定結(jié)果，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)將濃縮后的抗原稀釋并調(diào)節(jié)濃度，使每1ml含1m109.0CCU菌體。
2)油相準(zhǔn)備 將SEPPIC Montanide ISA 50V2油佐劑經(jīng)121℃滅菌30min，備用。
3)疫苗乳化 按油相：水相為1:1的比例加入乳化罐內(nèi)，以90r/min的轉(zhuǎn)速充分?jǐn)嚢?，再通過轉(zhuǎn)速為5600r/min的剪切機進(jìn)行剪切，使疫苗乳化成油包水劑型。
4)分裝 疫苗充分混合后，在無菌條件下定量分裝，密封瓶口，2～8℃保存。
(7)成品檢驗
1)性狀檢測
外觀：試制的3批疫苗均為乳白色乳劑。
劑型：每批疫苗抽樣分別用一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，均呈云滴狀不擴(kuò)散。
黏度：按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄方法進(jìn)行檢測，黏度均小于200cP。
2)穩(wěn)定性檢查：每批疫苗吸取10ml加入離心管中，以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，管底析出的水相均未超過0.5ml。
3)裝量檢查：按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄方法進(jìn)行檢測，均應(yīng)不低于100ml/瓶。
4)無菌檢驗：每批產(chǎn)品隨機抽取10瓶，按現(xiàn)行《中國獸藥典》方法進(jìn)行檢驗，無細(xì)菌，霉菌等生長。
5)汞類防腐劑殘留量測定：按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行，均符合獸用生物制品檢驗的一般規(guī)定。
6)安全檢驗
用體重1.5～2.0kg健康家兔5只，肌肉注射1.0ml/只；用1歲齡的健康易感山羊(山羊支原體山羊肺炎亞種抗體IHA效價不高于1∶4)2只，分點肌肉注射4.0ml/只。均觀察10日，全部健活。
7)效力檢驗
用體重20kg以上，1歲的健康易感山羊4只，各頸部皮下或肌肉注射2.0ml。21日后，連同條件相同的對照山羊3只，各氣管注射山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株肺組織劑4.0ml(含15個最小發(fā)病量)，觀察30日。對照山羊3/3發(fā)病，免疫山羊均4只全部保護(hù)。
實施例2
——與同類制品比較研究報告
為了比較山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗與同類制品在安全性、效力及免疫產(chǎn)生期等方面差異，取實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗制品和國產(chǎn)同類制品按1頭份/只接種1歲齡山羊，比較兩種疫苗接種的安全性和21日后攻毒保護(hù)率等。
1.試驗材料
(1.)試驗疫苗 3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗：批號為201001001、201001002和201001003。
(2)對照疫苗 山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，批號為200901，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)；山羊支原體山羊肺炎亞種C87002組織凍干毒
(3)山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株，代號87002，代次：52代，規(guī)格：1.0g/支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。
(4)實驗動物 1)試驗用山羊，1歲齡，購自某養(yǎng)殖場，體重20～40kg，健康，無皮膚病、寄生蟲感染，經(jīng)山羊支原體山羊肺炎亞種F38株、綿羊肺炎支原體Y-98株及布魯氏桿菌病等血清學(xué)檢驗均為陰性。2)豚鼠，體重350～450g、健康；兔，體重1.5～2.0kg、健康，北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司、中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠。
2.安全檢驗
(1)對山羊的安全性
將實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗(批號為201001001、201001002和201001003)分別以2.0ml/只皮下接種1歲齡山羊，同時取哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司的同類制品按1頭份/只皮下接種1歲齡山羊，觀察10日，是否出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)。
(2)對非靶動物(豚鼠和兔)的安全性
將實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗(批號為201001001、201001002和201001003)和哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)的同類制品分別肌肉注射豚鼠和兔各2只，2.0ml/只，觀察10日，觀察是否出現(xiàn)局部和全身反應(yīng)。
3批實驗室制品和哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)的同類制品對試驗山羊、豚鼠和兔注射當(dāng)日均有壓痛，次日后消失，無其它局部和全身反應(yīng)，表3。
表3 實驗室制品和同類制品注射豚鼠和兔7日內(nèi)的局部反應(yīng)觀察結(jié)果
注：“/”表示未注射疫苗。
3.免疫產(chǎn)生期試驗
將實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗(批號為201001001、201001002和201001003)分別以2.0ml頸部皮下接種1歲齡山羊，同時取哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)的同類制品按1頭份/只頸部皮下接種1歲齡山羊，接種后第14日和21日攻毒。見表4。
4.本動物攻毒保護(hù)試驗
免疫21日后，免疫羊與對照羊同時以山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株肺組織乳劑氣管接種4.0ml(含15個最小發(fā)病量)，臨床觀察30日。
表4 本發(fā)明的疫苗與國產(chǎn)同類制品的免疫產(chǎn)生期測定結(jié)果
從表4可以看出，接種3批制品和哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)的同類制品后第14日，所有山羊攻毒保護(hù)達(dá)到3/4以上，第21日攻毒保護(hù)達(dá)到4/4；攻毒對照組山羊3/3發(fā)病。
實驗室3批制品的生產(chǎn)是采用EZH液體培養(yǎng)基培養(yǎng)山羊支原體山羊肺炎亞種C87001株菌種，收獲菌液濃縮15倍、硫柳汞滅活、與進(jìn)口50V油佐劑按1:1(v/v)混合乳化后分裝制成的。通過進(jìn)行兩種制品安全性、效力及免疫產(chǎn)生期等方面比較，結(jié)果顯示：實驗室產(chǎn)品與哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)的同類制品在效力和免疫產(chǎn)生期方面均相當(dāng)。
實施例3
——最小免疫劑量確定
為了檢驗山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗不同劑量對靶動物的免疫效果，取實驗室試制的3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗按不同劑量接種1歲齡山羊，21日后進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗，確定該制品的最小免疫劑量?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1.材料
(1)疫苗 3批山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗，批號為201001001、201001002和201001003批，由本實驗室制備。
(2)山羊傳染性胸膜肺炎C87002組織凍干毒 山羊支原體山羊肺炎亞種強毒C87002株，代號87002，代次：52代，規(guī)格：1.0g/支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。
(3)實驗動物 甘肅省內(nèi)一養(yǎng)殖廠山羊，1歲齡，健康、無傳染病、皮膚病和寄生蟲感染，經(jīng)山羊支原體山羊肺炎亞種F38株、綿羊肺炎支原體Y98株及布魯氏桿菌病等血清學(xué)檢驗均為陰性。
2.攻毒保護(hù)
實驗室3批制品(批號為201001001、201001002和201001003批)分別按0.5、1.0、1.5、2.0ml的免疫劑量對山羊注射，注射后21日進(jìn)行攻毒，不同免疫劑量攻毒保護(hù)率測定結(jié)果見表5、6。
表5 疫苗不同免疫劑量接種后攻毒保護(hù)率
表6 攻毒對照組山羊攻毒保護(hù)率
從表3和表4可以看出，3批制品按1.0、1.5、2.0ml免疫劑量接種山羊后21日攻毒保護(hù)率均達(dá)到3/4(75％)以上；攻毒對照組山羊3/3(100％)發(fā)病。
3.臨床癥狀觀察結(jié)果
攻毒后，每日觀察免疫組和對照組山羊的臨床癥狀，連續(xù)觀察30天。201001001批免疫組2號、4號、7號山羊均出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高，201001002批免疫組18號、19號24號、27號山羊出均現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高；201001003批免疫組34號山羊出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高，免疫組其余山羊臨床表現(xiàn)正常；對照組3只羊均出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高等癥狀，其中C1號山羊于攻毒后24天死亡。
4.剖檢結(jié)果
攻毒后30天，對所有試驗山羊進(jìn)行解剖，結(jié)果201001001批出現(xiàn)臨床癥狀的3只山羊解剖后發(fā)現(xiàn)肺部有不同程度的特征性病變；201001002批出現(xiàn)臨床癥狀的4只山羊解剖后發(fā)現(xiàn)肺部有不同程度的特征性病變；2010011003批出現(xiàn)臨床癥狀的34號山羊解剖后左肺膈葉2/3肝變，剖面呈大理石狀。其余免疫山羊左右肺均正常；對照組C1號死亡解剖后左肺尖葉2/3肝變，剖面呈大理石狀；其余2只對照山羊到期解剖均出現(xiàn)不同程度的肺部大理石樣特征性病變。
本試驗結(jié)果表明，采用0.5ml免疫劑量不能產(chǎn)生可靠的保護(hù)效果；采用1.0、1.5與2.0ml免疫劑量無顯著差異，3批疫苗1次接種21日后攻毒均可對山羊起到保護(hù)作用，證明本疫苗以1.0ml接種1歲齡山羊，21日后攻毒均能保護(hù)，為本疫苗最小免疫劑量。因此，為確保免疫效果，免疫劑量建議為2.0ml/只。
實施例4
——疫苗的免疫期測定
本試驗通過測定實驗室3批制品對1月齡山羊接種后不同時間的攻毒保護(hù)率，來評定疫苗對靶動物的免疫效力。
1.材料 同實施例3。
疫苗1頭份的使用劑量為：2.0ml/只，采用頸部皮下或肌肉注射。
2.攻毒保護(hù)率
實驗室3批制品(批號為201001001、201001002和201001003批)1頭份免疫程序?qū)ι窖蜃⑸?，注射后?、9、12和15個月攻毒，不同時間點攻毒保護(hù)率測定結(jié)果見表7、8。
表7 不同免疫程序接種后攻毒保護(hù)率(1)
表8 不同免疫程序接種后攻毒保護(hù)率(2)
從表3、表4結(jié)果可以看出，3批制品一次接種和兩次接種1頭份免疫山羊后6、9、12、15月攻毒保護(hù)率均達(dá)到3/4(75％)以上；各時間點攻毒對照組山羊3/3發(fā)病，經(jīng)剖檢肺部有典型山羊傳染性胸膜肺炎病變。證明采用兩種免疫程序接種的山羊，15月內(nèi)攻毒的保護(hù)率均達(dá)到《中國獸藥典》的規(guī)定。
3.臨床癥狀觀察結(jié)果
攻毒后，每日觀察免疫組和對照組山羊的臨床癥狀，連續(xù)觀察30天。山羊攻毒保護(hù)試驗組臨床表現(xiàn)正常；201001003批1針法分別在免疫后9、12個月攻毒后各有1只山羊出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高，201001002批1針法免疫后12個月攻毒有1只山羊出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高，201001001批2針法免疫后15個月攻毒有1只山羊出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高，其余山羊臨床表現(xiàn)正常，對照組山羊均出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高等癥狀。
4.剖檢結(jié)果
攻毒后30天，對所有出現(xiàn)咳嗽、減食、體溫升高的山羊及攻毒對照組山羊進(jìn)行解剖，結(jié)果，肺部均出現(xiàn)不同程度大理石狀病變，未出現(xiàn)臨床癥狀山羊左右肺均正常。1針法山羊免疫疫苗6、9、12、15個月后攻毒保護(hù)試驗發(fā)病判定結(jié)果分別見表6、表8、表10和表12，2針法山羊免疫疫苗后的攻毒保護(hù)試驗發(fā)病判定結(jié)果分別見表9、表10、表11。
表9 疫苗免疫6個月山羊攻毒保護(hù)試驗發(fā)病判定結(jié)果
表10 疫苗免疫12個月山羊攻毒保護(hù)試驗發(fā)病判定結(jié)果
表12 疫苗免疫15個月山羊攻毒保護(hù)試驗發(fā)病判定結(jié)果
實施例5
——疫苗穩(wěn)定性(保存期)試驗
試驗結(jié)果見表表12-16.
表12 三批疫苗在2-8℃保存不同時間性狀檢驗、無菌檢驗、裝量和汞類防腐劑殘留量測定結(jié)果
表13 三批疫苗在2～8℃保存不同時間安全檢驗結(jié)果
表14 實驗室制品2～8℃保存0、3和6個月攻毒保護(hù)率
表15 實驗室制品2～8℃保存9、12和18個月攻毒保護(hù)率
表16 疫苗2～8℃保存21、24和30個月攻毒保護(hù)率
從表14、15和16可以看出，3批制品保存30個月按2.0ml免疫劑量接種山羊后21日攻毒保護(hù)率雖均達(dá)到3/4(75％)以上，但保護(hù)率與保存21個月相比有明顯降低；攻毒對照組山羊3/3(100％)發(fā)病，經(jīng)剖檢肺部有典型山羊傳染性胸膜肺炎病變。