本發(fā)明涉及生物免疫領(lǐng)域，具體地說，涉及雞球蟲病疫苗免疫。

背景技術(shù)：

雞球蟲病(Coccidiosis in Chicken)是雞常見且危害十分嚴(yán)重的寄生蟲病，是由一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病。它造成的經(jīng)濟損失是驚人的。10～30日齡的雛雞或35～60日齡的青年雞的發(fā)病率和致死率可高達80％。病愈的雛雞生長受阻，增重緩慢；成年雞一般不發(fā)病，但為帶蟲者，增重和產(chǎn)蛋能力降低，是傳播球蟲病的重要病源。

目前，雞球蟲病疫苗的免疫程序均采用雛雞一次免疫法。其是利用雞攝入自身疫苗接種后排出的卵囊進行加強免疫，進而建立抵抗球蟲感染的完全保護性免疫力，然而這一過程需要至少4周的時間(球蟲完成2-3次生活史)。因此，在疫苗免疫建立保護力之前的時間，機體不能抵抗大劑量球蟲的感染。生產(chǎn)中為解決此問題，常常采取疫苗免疫結(jié)合藥物防治的策略來控制球蟲病疫苗免疫后可能導(dǎo)致的球蟲病的爆發(fā)，這無疑增加了養(yǎng)殖成本，降低了養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有球蟲病疫苗免疫中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種新的雞球蟲病疫苗免疫方法，改變現(xiàn)有的球蟲病疫苗免疫策略或免疫程序，縮短疫苗免疫建立保護力的時間，進而降低雞攝入自身疫苗接種后排出的卵囊后的負(fù)作用，同時能夠為雞群提供良好的抗球蟲感染的免疫保護。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種雞球蟲病疫苗免疫方法，具體為：對1日齡雛雞經(jīng)口免疫球蟲病疫苗；1～3天后，再次經(jīng)口免疫相同的球蟲病疫苗。

所述雛雞包括但不限于肉雞、蛋雞或種雞。

所述球蟲病疫苗可為市售可得的商品化疫苗，也可優(yōu)選為后文提供的轉(zhuǎn)基因球蟲疫苗。

受免雞在首次免疫后，排出球蟲卵囊的時間約為5～14天。按照本發(fā)明所述的免疫方法，在首次免疫后的1～3天，再次經(jīng)口進行二次免疫，可使受免雞在攝入自身所排出的卵囊之前，進行二次免疫應(yīng)答，避免機體在未建立免疫保護力前，攝入過量卵囊對腸道造成嚴(yán)重?fù)p傷。

經(jīng)試驗研究發(fā)現(xiàn)，若在首免2天后進行二免，能達到最佳的免疫保護效果，具體表現(xiàn)為攻蟲感染后卵囊排出更少、病變更輕、體增重更優(yōu)。

進一步地，所述疫苗的免疫劑量為商品化疫苗推薦劑量的1/2。例如，雞球蟲病四價活疫苗疫苗(佛山市正典生物技術(shù)有限公司，獸藥生字(2008)190462139)的推薦劑量為1100±10％(275±10％卵囊/種)，將其應(yīng)用于本發(fā)明中，分為兩次免疫，每次劑量為550±10％。

本發(fā)明對現(xiàn)有技術(shù)的貢獻主要在于提供了兩次免疫的免疫策略與二免時間與劑量的選擇。但為了避免商品化疫苗推薦劑量差異較大，本發(fā)明進一步提供更加明確的劑量標(biāo)準(zhǔn)，即兩次疫苗免疫的劑量各為100～800卵囊/種/羽，優(yōu)選為兩次疫苗免疫的劑量相同，優(yōu)選為125～175卵囊/種/羽。使用時，可同時參考商品化疫苗推薦劑量和本發(fā)明所述劑量進行。

更進一步地，為了使球蟲病的免疫防控更加安全、有效，本發(fā)明提供了一種改進的球蟲病疫苗，所述球蟲病疫苗包含引起保護性免疫響應(yīng)的免疫原，所述免疫原為可表達調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答強度相關(guān)因子的轉(zhuǎn)基因球蟲。

其中，所述調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答強度相關(guān)因子包括細(xì)胞因子、免疫受體的配體及不同蟲種間能夠調(diào)控免疫應(yīng)答的蟲體抗原。

所述細(xì)胞因子選自Th1類細(xì)胞因子，優(yōu)選為IFN-γ。所述免疫受體的配體選自活化T細(xì)胞的協(xié)同作用因子，即第二信號因子，優(yōu)選為抗體Fc片段或CD40L。所述不同蟲種間能夠調(diào)控免疫應(yīng)答的蟲體抗原選自與樹突狀細(xì)胞表面受體結(jié)合的抗原因子，優(yōu)選為Profilin。

所述轉(zhuǎn)基因球蟲的構(gòu)建方法如下：

1)構(gòu)建含有上述細(xì)胞因子基因的球蟲轉(zhuǎn)染載體，利用球蟲自身調(diào)控原件如啟動子等，大量制備后利用限制性內(nèi)切酶線性化；

2)利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)染技術(shù)(轉(zhuǎn)染儀器：NucleofectorII,AMAXA,程序U-033)將線性化載體轉(zhuǎn)染至球蟲子孢子；

3)轉(zhuǎn)染后的子孢子經(jīng)泄殖腔接種雛雞，獲得轉(zhuǎn)基因球蟲卵囊，經(jīng)連續(xù)篩選與單克隆分選獲得穩(wěn)定遺傳群體。

可選地，雞IFN-γ、雞IgY Fc、雞CD40L、和巨型艾美耳球蟲Profilin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供了一種雞球蟲病疫苗免疫方法，既可有效避免初次免疫后大量排出卵囊被雞群食入爆發(fā)球蟲病的風(fēng)險，又可提高球蟲病疫苗免疫的整齊度至90％以上，還可迅速建立免疫保護力，對球蟲再次感染實現(xiàn)更好的保護，減緩因疫苗免疫引起的生產(chǎn)性能下降，增加養(yǎng)殖效益。同時，可降低或杜絕抗球蟲藥物的使用量，提供更加安全、綠色的禽肉和蛋產(chǎn)品。不僅如此，還節(jié)約了現(xiàn)有免疫方法的成本，經(jīng)濟效益巨大。

此外，本發(fā)明還利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建表達調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答強度的相關(guān)因子(包括細(xì)胞因子、免疫受體的配體及不同蟲種間能夠調(diào)控免疫應(yīng)答的蟲體抗原)的轉(zhuǎn)基因球蟲，該類轉(zhuǎn)基因球蟲和野生型球蟲相比，具備更強的免疫原性，作為新型球蟲病的疫苗組分更安全、有效，能夠迅速建立免疫保護力。以該類轉(zhuǎn)基因球蟲為疫苗組分可進一步提升現(xiàn)有球蟲病疫苗的免疫效果，降低球蟲病疫苗免疫產(chǎn)生的副作用，具備良好的經(jīng)濟效益和廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1的免疫策略。

圖2為本發(fā)明實驗例1的實驗分組。

圖3為本發(fā)明實驗例1中的卵囊排出量比較。

圖4為本發(fā)明實驗例1中的平均腸道病變計分比較。

圖5為本發(fā)明實驗例1中的體重比較。

圖6為本發(fā)明構(gòu)建的表達細(xì)胞因子(Interferon-γ，IFN-γ)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 1)與傳統(tǒng)疫苗組分即野生型球蟲(WT)免疫原性及保護力的比較。其中：(A)免疫后各組雞群的卵囊排出動態(tài)規(guī)律；(B)免疫后14天攻蟲的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻蟲前后雞群體增重；(D)免疫后14天攻蟲，盲腸病變計分；(E)免疫后28天攻蟲的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻蟲前后雞群體增重；(G)免疫后28天攻蟲，盲腸病變計分。

圖7為本發(fā)明構(gòu)建的免疫受體的配體(抗體Fc片段)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 2)與傳統(tǒng)疫苗組分即野生型球蟲(WT)免疫原性及保護力的比較。其中：(A)免疫后各組雞群的卵囊排出動態(tài)規(guī)律；(B)免疫后14天攻蟲的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻蟲前后雞群體增重；(D)免疫后14天攻蟲，盲腸病變計分；(E)免疫后28天攻蟲的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻蟲前后雞群體增重；(G)免疫后28天攻蟲，盲腸病變計分。

圖8為本發(fā)明構(gòu)建的免疫受體的配體(CD40L)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 3)與傳統(tǒng)疫苗組分即野生型球蟲(WT)免疫原性及保護力的比較。其中：(A)免疫后各組雞群的卵囊排出動態(tài)規(guī)律；(B)免疫后14天攻蟲的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻蟲前后雞群體增重；(D)免疫后14天攻蟲，盲腸病變計分；(E)免疫后28天攻蟲的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻蟲前后雞群體增重；(G)免疫后28天攻蟲，盲腸病變計分。

圖9為本發(fā)明構(gòu)建的不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 4)與傳統(tǒng)疫苗組分即野生型球蟲(WT)免疫原性及保護力的比較。其中：(A)免疫后各組雞群的卵囊排出動態(tài)規(guī)律；(B)免疫后14天攻蟲的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻蟲前后雞群體增重；(D)免疫后14天攻蟲，盲腸病變計分；(E)免疫后28天攻蟲的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻蟲前后雞群體增重；(G)免疫后28天攻蟲，盲腸病變計分。

圖10為本發(fā)明構(gòu)建的不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因毒害艾美耳球蟲(Trans 5)與傳統(tǒng)疫苗組分即野生型球蟲(WT)免疫原性及保護力的比較。其中：(A)免疫后各組雞群的卵囊排出動態(tài)規(guī)律；(B)免疫后14天攻蟲的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻蟲前后雞群體增重；(D)免疫后14天攻蟲，小腸病變計分；(E)免疫后28天攻蟲的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻蟲前后雞群體增重；(G)免疫后28天攻蟲，小腸病變計分。

圖11為本發(fā)明構(gòu)建的不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因堆型艾美耳球蟲(Trans 6)與傳統(tǒng)疫苗組分即野生型球蟲(WT)免疫原性及保護力的比較。其中：(A)免疫后各組雞群的卵囊排出動態(tài)規(guī)律；(B)免疫后14天攻蟲的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻蟲前后雞群體增重；(D)免疫后14天攻蟲，十二指腸病變計分；(E)免疫后28天攻蟲的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻蟲前后雞群體增重；(G)免疫后28天攻蟲，十二指腸病變計分。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所述的雞球蟲病四價活疫苗(以下簡稱球蟲疫苗)購自佛山市正典生物技術(shù)有限公司。

實施例1

本實施例用于說明本發(fā)明所述的免疫方法。

如圖1所示，雛雞1日齡經(jīng)口免疫球蟲病疫苗(劑量550±10％卵囊/羽)，正常飼喂無抗球蟲藥物的飼料，自由飲水，初次免疫后2天(雛雞3日齡)，進行同等劑量(550±10％卵囊/羽)的再次免疫。

實施例2

本實施例與實施例1的區(qū)別在于：再次免疫時間為初次免疫后1天(雛雞2日齡)。

實施例3

本實施例與實施例1的區(qū)別在于：再次免疫時間為初次免疫后3天(雛雞4日齡)。

實驗例1

本實驗例用于說明本發(fā)明所述免疫方法與現(xiàn)有技術(shù)中的免疫方法對雞群抵抗球蟲再次感染的不同保護效果。

試驗方法如下：

1、設(shè)置分組，如圖2所示：

(1)本發(fā)明免疫組：如實施例1。免疫后14天進行攻蟲感染(劑量10000±10％卵囊/種/羽，共計40000±10％卵囊、羽)。

(2)現(xiàn)有技術(shù)免疫組：雛雞1日齡經(jīng)口免疫球蟲疫苗(劑量1100±10％卵囊/羽)，正常飼喂無抗球蟲藥物的飼料，自由飲水。初次免疫后2天，使用PBS免疫作為對照。免疫后14天進行攻蟲感染(劑量10000±10％卵囊/種/羽，共計40000±10％卵囊/羽)。

(3)不免疫攻蟲組：雛雞1日齡經(jīng)口免疫PBS，正常飼喂無抗球蟲藥物的飼料，自由飲水。初次免疫后2天，使用PBS免疫作為對照。免疫后14天進行攻蟲感染(劑量10000±10％卵囊/種/羽，共計40000±10％卵囊/羽)。

(4)不免疫不攻蟲組：雛雞1日齡經(jīng)口免疫PBS，正常飼喂無抗球蟲藥物的飼料，自由飲水。初次免疫后2天，使用PBS免疫作為對照。免疫后14天進行口服PBS作為對照。

2、評估指標(biāo)

對免疫后、攻蟲后的卵囊排出進行統(tǒng)計及免疫前、免疫后和攻蟲感染后的腸道病變、體重變化進行分析，分析不同免疫程序免疫雞群，其保護效果的差異。

3、結(jié)果分析

如圖3所示，本發(fā)明免疫組的雞群免疫后、攻蟲后的卵囊排出顯著低于現(xiàn)有技術(shù)免疫組，說明本發(fā)明免疫程序可有效降低雞群疫苗免疫后的卵囊排出，并且提供更好的免疫保護，表現(xiàn)為攻蟲后的卵囊排出顯著降低，說明本發(fā)明的免疫程序顯著降低疫苗免疫的副作用，增強疫苗免疫的保護效果明顯。

如圖4所示，本發(fā)明免疫組的雞群攻蟲后的腸道病變計分顯著低于現(xiàn)有技術(shù)免疫組，說明本發(fā)明免疫程序可提供更好的免疫保護，顯著降低疫苗免疫的副作用，增強疫苗免疫的保護效果明顯。

如圖5所示，本發(fā)明免疫組的雞群免疫后、攻蟲后的體增重顯著高于現(xiàn)有技術(shù)免疫組，說明本發(fā)明免疫程序可有效降低雞群疫苗免疫引起的生產(chǎn)性能下降，并且提供更好的免疫保護，表現(xiàn)為攻蟲后的體增重明顯增加，說明本發(fā)明的免疫程序顯著降低疫苗免疫的副作用，增強疫苗免疫的保護效果明顯。

實施例4

本實施例用于說明本發(fā)明提供的改良球蟲病疫苗，所述疫苗的免疫原為表達細(xì)胞因子(Interferon-γ，IFN-γ)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 1)。

所述疫苗的制備方法為：

1)利用SEQ ID NO.1所示序列，構(gòu)建表達IFN-γ的球蟲轉(zhuǎn)染載體，系利用球蟲自身調(diào)控原件如啟動子等，大量制備后利用限制性內(nèi)切酶線性化；

2)利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)染技術(shù)(轉(zhuǎn)染儀器：NucleofectorII,AMAXA,程序U-033)將線性化載體轉(zhuǎn)染至球蟲子孢子；

3)轉(zhuǎn)染后的子孢子經(jīng)泄殖腔接種雛雞，獲得轉(zhuǎn)基因球蟲卵囊，經(jīng)連續(xù)篩選與單克隆分選獲得穩(wěn)定遺傳群體。

本實施例以危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的球蟲蟲種之一，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為對象，利用本發(fā)明所列表達細(xì)胞因子(Interferon-γ，IFN-γ)的轉(zhuǎn)基因球蟲，并通過卵囊排出、盲腸病變計分和體重變化反應(yīng)其免疫效果。

200羽1周齡SPF雞隨機分為4組：不免疫不攻蟲組、不免疫攻蟲組、傳統(tǒng)疫苗球蟲組分即野生型球蟲免疫組(WT)和轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組(Trans 1)。上述各組每羽雞分別口服接種200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各組雞群同等條件墊料平養(yǎng)，自由采食、飲水。免疫后第14天，各組25只雞除不免疫不攻蟲組外，口服感染10000卵囊/羽轉(zhuǎn)移至新隔離器飼養(yǎng)，感染后第6天剖殺10只雞記盲腸病變，其余統(tǒng)計其卵囊排出和體增重。剩余25只雞于免疫后28天作同樣處理。為了反映本發(fā)明免疫原性增強型球蟲病疫苗的免疫保護效果，本案例統(tǒng)計了免疫及攻蟲后的卵囊排出量、免疫前后和攻蟲感染后雞群體重的變化及盲腸的病變程度，詳述如下：

1、免疫后糞便中卵囊的排出(圖6A)顯示免疫原性增強型轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組顯著低于野生型球蟲免疫組，降低了該類新型疫苗免疫后引起球蟲病爆發(fā)的風(fēng)險。免疫第14天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖6B)，可以看出，Trans 1免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，減少卵囊排出。免疫第28天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖6E)，可以看出，Trans 1免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 1免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

2、免疫第14天攻蟲前后雞群的體增重(圖6C)，可以看出，Trans 1免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，對體增重的影響較小。免疫第28天攻蟲前后雞群的體增重(圖6F)，可以看出，Trans1免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 1免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

3、免疫第14天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖6D)，可以看出，Trans 1免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，病變較輕。免疫第28天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖6G)，可以看出，Trans 1免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 1免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

實施例5

本實施例用于說明本發(fā)明提供的改良球蟲病疫苗，所述疫苗的免疫原為表達免疫受體的配體(抗體Fc片段)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 2)

所述疫苗的制備方法與實施例4的區(qū)別在于IFN-γ基因替換為抗體Fc片段基因(SEQ ID NO.2所示序列)。

本實施例以危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的球蟲蟲種之一，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為對象，利用本發(fā)明所列表達免疫受體的配體(抗體Fc片段)的轉(zhuǎn)基因球蟲，并通過卵囊排出、盲腸病變計分和體重變化反應(yīng)其免疫效果。

200羽1周齡SPF雞隨機分為4組：不免疫不攻蟲組、不免疫攻蟲組、傳統(tǒng)疫苗球蟲組分即野生型球蟲免疫組(WT)和轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組(Trans 2)。上述各組每羽雞分別口服接種200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各組雞群同等條件墊料平養(yǎng)，自由采食、飲水。免疫后第14天，各組25只雞除不免疫不攻蟲組外，口服感染10000卵囊/羽轉(zhuǎn)移至新隔離器飼養(yǎng)，感染后第6天剖殺10只雞記盲腸病變，其余統(tǒng)計其卵囊排出和體增重。剩余25只雞于免疫后28天作同樣處理。為了反映本發(fā)明免疫原性增強型球蟲病疫苗的免疫保護效果，本案例統(tǒng)計了免疫及攻蟲后的卵囊排出量、免疫前后和攻蟲感染后雞群體重的變化及盲腸的病變程度，詳述如下：

1、免疫后糞便中卵囊的排出(圖7A)顯示免疫原性增強型轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組顯著低于野生型球蟲免疫組，降低了該類新型疫苗免疫后引起球蟲病爆發(fā)的風(fēng)險。免疫第14天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖7B)，可以看出，Trans 2免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，減少卵囊排出。免疫第28天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖7E)，可以看出，Trans 2免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 2免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

2、免疫第14天攻蟲前后雞群的體增重(圖7C)，可以看出，Trans 2免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，對體增重的影響較小。免疫第28天攻蟲前后雞群的體增重(圖7F)，可以看出，Trans 2免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 2免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

3、免疫第14天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖7D)，可以看出，Trans 2免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，病變較輕。免疫第28天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖7G)，可以看出，Trans 2免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 2免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

實施例6

本實施例用于說明本發(fā)明提供的改良球蟲病疫苗，所述疫苗的免疫原為表達免疫受體的配體(CD40L)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 3)。

所述疫苗的制備方法與實施例4的區(qū)別在于IFN-γ基因替換為雞CD40L基因(SEQ ID NO.3所示序列)。

本實施例以危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的球蟲蟲種之一，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為對象，利用本發(fā)明所列表達免疫受體的配體(CD40L)的轉(zhuǎn)基因球蟲，并通過卵囊排出、盲腸病變計分和體重變化反應(yīng)其免疫效果。

200羽1周齡SPF雞隨機分為4組：不免疫不攻蟲組、不免疫攻蟲組、傳統(tǒng)疫苗球蟲組分即野生型球蟲免疫組(WT)和轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組(Trans 3)。上述各組每羽雞分別口服接種200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各組雞群同等條件墊料平養(yǎng)，自由采食、飲水。免疫后第14天，各組25只雞除不免疫不攻蟲組外，口服感染10000卵囊/羽轉(zhuǎn)移至新隔離器飼養(yǎng)，感染后第6天剖殺10只雞記盲腸病變，其余統(tǒng)計其卵囊排出和體增重。剩余25只雞于免疫后28天作同樣處理。為了反映本發(fā)明免疫原性增強型球蟲病疫苗的免疫保護效果，本案例統(tǒng)計了免疫及攻蟲后的卵囊排出量、免疫前后和攻蟲感染后雞群體重的變化及盲腸的病變程度，詳述如下：

1、免疫后糞便中卵囊的排出(圖8A)顯示免疫原性增強型轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組顯著低于野生型球蟲免疫組，降低了該類新型疫苗免疫后引起球蟲病爆發(fā)的風(fēng)險。免疫第14天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖8B)，可以看出，Trans 3免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，減少卵囊排出。免疫第28天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖8E)，可以看出，Trans 3免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 3免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

2、免疫第14天攻蟲前后雞群的體增重(圖8C)，可以看出，Trans 3免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，對體增重的影響較小。免疫第28天攻蟲前后雞群的體增重(圖8F)，可以看出，Trans 3免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 3免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

3、免疫第14天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖8D)，可以看出，Trans 3免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，病變較輕。免疫第28天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖8G)，可以看出，Trans 3免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 3免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

實施例7

本實施例用于說明本發(fā)明提供的改良球蟲病疫苗，所述疫苗的免疫原為表達不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因柔嫩艾美耳球蟲(Trans 4)。

所述疫苗的制備方法與實施例4的區(qū)別在于IFN-γ基因替換為巨型艾美耳球蟲Profilin基因(SEQ ID NO.4所示序列)。

本實施例以危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的球蟲蟲種之一，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)為對象，利用本發(fā)明所列表達不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因球蟲，并通過卵囊排出、盲腸病變計分和體重變化反應(yīng)其免疫效果。

200羽1周齡SPF雞隨機分為4組：不免疫不攻蟲組、不免疫攻蟲組、傳統(tǒng)疫苗球蟲組分即野生型球蟲免疫組(WT)和轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組(Trans 4)。上述各組每羽雞分別口服接種200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各組雞群同等條件墊料平養(yǎng)，自由采食、飲水。免疫后第14天，各組25只雞除不免疫不攻蟲組外，口服感染10000卵囊/羽轉(zhuǎn)移至新隔離器飼養(yǎng)，感染后第6天剖殺10只雞記盲腸病變，其余統(tǒng)計其卵囊排出和體增重。剩余25只雞于免疫后28天作同樣處理。為了反映本發(fā)明免疫原性增強型球蟲病疫苗的免疫保護效果，本案例統(tǒng)計了免疫及攻蟲后的卵囊排出量、免疫前后和攻蟲感染后雞群體重的變化及盲腸的病變程度，詳述如下：

1、免疫后糞便中卵囊的排出(圖9A)顯示免疫原性增強型轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組顯著低于野生型球蟲免疫組，降低了該類新型疫苗免疫后引起球蟲病爆發(fā)的風(fēng)險。免疫第14天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖9B)，可以看出，Trans 4免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，減少卵囊排出。免疫第28天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖9E)，可以看出，Trans 4免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 4免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

2、免疫第14天攻蟲前后雞群的體增重(圖9C)，可以看出，Trans 4免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，對體增重的影響較小。免疫第28天攻蟲前后雞群的體增重(圖9F)，可以看出，Trans 4免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 4免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

3、免疫第14天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖9D)，可以看出，Trans 4免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，病變較輕。免疫第28天攻蟲后6天雞群的盲腸病變(圖9G)，可以看出，Trans 4免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 4免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

實施例8

本實施例用于說明本發(fā)明提供的改良球蟲病疫苗，所述疫苗的免疫原為表達不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因毒害艾美耳球蟲(Trans 5)。

所述疫苗的制備方法與實施例4的區(qū)別在于IFN-γ基因替換為巨型艾美耳球蟲Profilin基因(SEQ ID NO.4所示序列)。

本實施例以危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的另一球蟲蟲種，毒害艾美耳球蟲(Eimeria necatrix)為對象，利用本發(fā)明所列表達不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因球蟲，并通過卵囊排出、盲腸病變計分和體重變化反應(yīng)其免疫效果。

200羽1周齡SPF雞隨機分為4組：不免疫不攻蟲組、不免疫攻蟲組、傳統(tǒng)疫苗球蟲組分即野生型球蟲免疫組(WT)和轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組(Trans 5)。上述各組每羽雞分別口服接種200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各組雞群同等條件墊料平養(yǎng)，自由采食、飲水。免疫后第14天，各組25只雞除不免疫不攻蟲組外，口服感染10000卵囊/羽轉(zhuǎn)移至新隔離器飼養(yǎng)，感染后第6天剖殺10只雞記盲腸病變，其余統(tǒng)計其卵囊排出和體增重。剩余25只雞于免疫后28天作同樣處理。為了反映本發(fā)明免疫原性增強型球蟲病疫苗的免疫保護效果，本案例統(tǒng)計了免疫及攻蟲后的卵囊排出量、免疫前后和攻蟲感染后雞群體重的變化及小腸的病變程度，詳述如下：

1、免疫后糞便中卵囊的排出(圖10A)顯示免疫原性增強型轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組顯著低于野生型球蟲免疫組，降低了該類新型疫苗免疫后引起球蟲病爆發(fā)的風(fēng)險。免疫第14天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖10B)，可以看出，Trans 5免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，減少卵囊排出。免疫第28天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖10E)，可以看出，Trans 5免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 5免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

2、免疫第14天攻蟲前后雞群的體增重(圖10C)，可以看出，Trans 5免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，對體增重的影響較小。免疫第28天攻蟲前后雞群的體增重(圖10F)，可以看出，Trans 5免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 5免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

3、免疫第14天攻蟲后6天雞群的小腸病變(圖10D)，可以看出，Trans 5免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，病變較輕。免疫第28天攻蟲后6天雞群的小腸病變(圖10G)，可以看出，Trans 5免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 5免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

實施例9

本實施例用于說明本發(fā)明提供的改良球蟲病疫苗，所述疫苗的免疫原為表達不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因堆型艾美耳球蟲(Trans 6)。

所述疫苗的制備方法與實施例4的區(qū)別在于IFN-γ基因替換為巨型艾美耳球蟲Profilin基因(SEQ ID NO.4所示序列)。

本實施例以危害養(yǎng)禽業(yè)最為嚴(yán)重的另一球蟲蟲種，堆型艾美耳球蟲(Eimeria acervulina)為對象，利用本發(fā)明所列表達不同蟲種間差異的免疫調(diào)節(jié)抗原(巨型艾美耳球蟲Profilin)的轉(zhuǎn)基因球蟲，并通過卵囊排出、盲腸病變計分和體重變化反應(yīng)其免疫效果。

200羽1周齡SPF雞隨機分為4組：不免疫不攻蟲組、不免疫攻蟲組、傳統(tǒng)疫苗球蟲組分即野生型球蟲免疫組(WT)和轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組(Trans 6)。上述各組每羽雞分別口服接種200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各組雞群同等條件墊料平養(yǎng)，自由采食、飲水。免疫后第14天，各組25只雞除不免疫不攻蟲組外，口服感染10000卵囊/羽轉(zhuǎn)移至新隔離器飼養(yǎng)，感染后第5天剖殺10只雞記盲腸病變，其余統(tǒng)計其卵囊排出和體增重。剩余25只雞于免疫后28天作同樣處理。為了反映本發(fā)明免疫原性增強型球蟲病疫苗的免疫保護效果，本案例統(tǒng)計了免疫及攻蟲后的卵囊排出量、免疫前后和攻蟲感染后雞群體重的變化及小腸的病變程度，詳述如下：

1、免疫后糞便中卵囊的排出(圖11A)顯示免疫原性增強型轉(zhuǎn)基因球蟲免疫組顯著低于野生型球蟲免疫組，降低了該類新型疫苗免疫后引起球蟲病爆發(fā)的風(fēng)險。免疫第14天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖11B)，可以看出，Trans 6免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，減少卵囊排出。免疫第28天攻蟲后糞便中卵囊的排出(圖11E)，可以看出，Trans 6免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 6免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

2、免疫第14天攻蟲前后雞群的體增重(圖11C)，可以看出，Trans 6免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，對體增重的影響較小。免疫第28天攻蟲前后雞群的體增重(圖11F)，可以看出，Trans 6免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 6免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

3、免疫第14天攻蟲后5天雞群的十二指腸病變(圖11D)，可以看出，Trans 6免疫組與野生型球蟲免疫組相比能夠提供更好的免疫保護，病變較輕。免疫第28天攻蟲后5天雞群的十二指腸病變(圖11G)，可以看出，Trans 6免疫組與野生型球蟲免疫組提供的免疫保護均增強，但Trans 6免疫組優(yōu)于野生型球蟲免疫組。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。